способ получения иммуноглобулинового препарата

Формула изобретения

Способ получения иммуноглобулинового препарата путем растворения спиртовой фракции плазмы крови, содержащей иммуноглобулины, в воде или буферном растворе, доведения концентрации белка до 0,5-20,0%, установления рН раствора 3,5-5,0 добавлением кислоты при температуре 0-20^oС, ионной силе 0,001, ультрафильтрации, диафильтрации, диализа или комбинации этих методов, добавления мальтозы, стерилизующей фильтрации, отличающийся тем, что предварительно спиртовую фракцию плазмы крови растворяют в воде до концентрации белка 0,1-8,0%, устанавливают рН 6,5-7,8, инкубируют от 8 ч до 1 месяца при температуре 4-20^oС, сформировавшийся осадок удаляют центрифугированием или фильтрацией, добавляют в раствор суспензию гидроокиси алюминия в количестве 10-40 мл на 1 л раствора, инкубируют 3-5 ч при комнатной температуре и отделяют гидроокись алюминия центрифугированием.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для иммунотерапии и иммунопрофилактики бактериальных и вирусных заболеваний.

Известен способ получения препарата иммуноглобулинов для внутривенного введения, описанный в статье Анастасиева В.В. и др. "Получение из плазмы крови доноров иммуноглобулина для внутривенного введения" (Журнал "Гематология и трансфузиология", 1985, 10, стр. 46-48). Способ заключается в растворении спиртовой фракции плазмы крови, содержащей иммуноглобулины, в 0,9% растворе хлорида натрия до конечной концентрации белка 8-10%, добавлении в раствор глицина до 0,5% и глюкозы до 1%, лиофилизации раствора, растворении полученного порошка иммуноглобулина в дистиллированной воде, установлении концентрации белка 14,5-15,5%, фильтрации раствора, обработке пепсином при рН 3,9-4,0, адсорбции остаточного пепсина гидроокисью алюминия, удалении нестабильных примесей путем выстаивания и центрифугирования, стерилизующей фильтрации.

Известен способ получения иммуноглобулинов для внутривенного введения, близкий к вышеописанному, защищенный патентом RU 2141341 С1 кл. 6 А 61 К 39/395, 39/085, дата публикации 20.11.99, отличающийся использованием иных концентраций глюкозы, временем выстаивания и инкубации с пепсином.

Общим недостатком всех вышеописанных методов является то, что при обработке пепсином происходит разрушение значительной части молекул иммуноглобулинов от 15 до 30%. Данная обработка проводится с целью снижения антикомплементарной активности и улучшения переносимости препарата. Вследствие разрушения молекул снижается лечебный эффект препарата.

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигнутому результату является способ получения иммуноглобулинового препарата, разработанный R. Tenold, 1985, защищенный патентом США 4.499.073, кл. A 31 J 1/06, А 61 К 37/64, С 07 G 7/100, 1983 г.

Автор предлагает растворять спиртовую фракцию или лиофилизированный порошок, содержащие иммуноглобулины, в воде или буферном растворе, доводя концентрацию белка до 0,5-20,0%; устанавливать рН раствора 3,5-5,0 добавлением кислоты, при температуре 0-20^oС, ионной силе 0,001, с использованием методов ультрафильтрации, диафильтрации, диализа или комбинации этих методов. Далее устанавливают необходимую концентрацию белка, ионную силу раствора регулируют добавлением общепринятых в данном случае реагентов: аминокислот (например, глицина), углеводов (мальтозы, декстрозы, фруктозы), сахароспиртов (сорбитола, маннитола) или комбинации этих веществ. Далее проводят стерилизующую фильтрацию, розлив во флаконы и, если необходимо, лиофилизацию. Недостатком способа является то, что полученный препарат может содержать нежелательные примеси белков неиммуноглобулиновой природы. Кроме того, описанная технология не включает методы удаления или инактивации вирусов.

Задача, решаемая предлагаемым изобретением - совершенствование технологии получения иммуноглобулина.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении качества препарата за счет удаления примесей белков, липидов и вирусов.

Указанный результат достигается тем, что в способе получения иммуноглобулинового препарата путем растворения спиртовой фракции плазмы крови, содержащей иммуноглобулины, в воде или буферном растворе, доведения концентрации белка до 0,5-20,0%; установления рН раствора 3,5-5,0 добавлением кислоты, при температуре 0-20^oС, ионной силе 0,001, ультрафильтрации, диафильтрации, диализа или комбинации этих методов; добавления мальтозы, стерилизующей фильтрации, предварительно спиртовую фракцию плазмы крови растворяют в воде до концентрации белка 0,1-8,0%, устанавливают рН 6,5-7,8, инкубируют от 8 ч до 1 месяца при температуре +4^oС - +20^oС, сформировавшийся осадок удаляют центрифугированием или фильтрацией, добавляют в раствор суспензию гидроокиси алюминия в количестве 10-40 мл на 1 л раствора, инкубируют 3-5 ч при комнатной температуре и отделяют гидроокись алюминия центрифугированием.

Способ осуществляют следующим образом. В качестве исходного сырья используют спиртовую фракцию плазмы крови, содержащую иммуноглобулины. Готовят раствор с концентрацией белка 0,1-8,0%, рН 6,5-7,8. Данные параметры являются оптимальными, так как снижение концентрации белка ниже 0,1% и рН ниже 6,5 затрудняет формирование осадка нестабильных примесей. Увеличение рН более 7,8 и концентрации белка более 8% может привести к денатурации молекул иммуноглобулинов. Приготовленный раствор выстаивают от 8 ч до 1 месяца при температуре от +4^oС до +20^oС. Уменьшение времени выстаивания не позволяет добиться желаемого результата, увеличение времени выстаивания более 1 месяца технологически нецелесообразно. Сформировавшийся осадок удаляют центрифугированием или фильтрацией. Это позволяет добиться удаления примесей иммуноглобулинов А и М, а также липопротеидов. Определение иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии по Манчини установило наличие иммуноглобулинов А и М в препаратах, полученных по методике прототипа, и полное их отсутствие в препаратах, полученных по предлагаемой нами методике. Иммуноэлектрофоретический анализ с окраской фореграмм Суданом черным показал наличие примесей липопротеидов в препаратах, полученных по методике прототипа, и полное их отсутствие в препаратах, полученных по предлагаемой нами методике. Это позволяет повысить стабильность раствора иммуноглобулинов по сравнению с прототипом. В процессе хранения препаратов не наблюдалось формирования осадка и уменьшения прозрачности растворов. Кроме того, известно, что наличие в препаратах иммуноглобулинов А и М может являться причиной побочных реакций при введении пациентам.

Далее в раствор добавляют суспензию гидроокиси алюминия из расчета 10-40 мл суспензии на 1 л раствора, инкубируют 3-5 ч при комнатной температуре. Сокращение времени инкубации менее 3 ч не позволяет добиться желаемого результата, увеличение более 5 ч технологически нецелесообразно. Уменьшение указанного количества гидроокиси алюминия не позволяет добиться полного удаления примесей, увеличение является технологически нецелесообразным. Гидроокись алюминия удаляют из раствора центрифугированием. Применение гидроокиси алюминия позволяет обеспечить дополнительное удаление примесей - в частности, вирусных частиц. Экспериментальные исследования с использованием вируса гепатита С, определяемого с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), показали снижение количества вирусных частиц в 10²-10³ раз. Далее раствор иммуноглобулинов разбавляют водой и проводят ультрафильтрацию с одновременным понижением рН до 4,60,2, доводя концентрацию белка до 5,5-6,0%. В раствор добавляют мальтозу до 10%, проводят стерилизующую фильтрацию и розлив препарата.

Пример 1. К 1 кг спиртовой фракции плазмы крови добавляют 5 л воды при перемешивании. Концентрация белка в растворе 0,1%. Устанавливают рН раствора равным 6,5. Раствор выстаивают в течение 8 ч при комнатной температуре. Осадок удаляют центрифугированием. В раствор добавляют 50 мл суспензии гидроокиси алюминия, из расчета 10 мл на 1 л раствора, инкубируют 3 ч при комнатной температуре. Гидроокись алюминия удаляют центрифугированием. Раствор разводят 4-кратным объемом воды и проводят ультрафильтрацию, одновременно снижая рН раствора до 4,6 постепенным добавлением 0,1 Н соляной кислоты. Процесс ультрафильтрации проводят до достижения концентрации белка равной 5,0%. В раствор добавляют мальтозу до концентрации 10%, проводят стерилизующую фильтрацию и розлив препарата. Иммуноэлектрофоретический анализ не выявил в полученном препарате примесей иммуноглобулинов А и М и липопротеидов. Вирусологический анализ методом ПЦР показал отсутствие вирусных частиц.

Пример 2. Проведен аналогично Примеру 1, но при доведении рН раствора исходного сырья до 7,8, концентрации белка до 8%, выстаивании в течение 1 месяца, добавлении гидроокиси алюминия из расчета 40 мл/л. Данные сведены в таблицу. Иммуноэлектрофоретический анализ не выявил в полученном препарате примесей иммуноглобулинов А и М и липопротеидов. Вирусологический анализ методом ПЦР показал отсутствие вирусных частиц.

Удаление нестабильных примесей из растворов иммуноглобулинов позволяет устранить опалесценцию растворов иммуноглобулинов, предотвратить формирование осадка в них, уменьшить вероятность развития побочных реакций при введении препаратов. Использование гидроокиси алюминия позволяет повысить вирусологическую безопасность препарата по сравнению с прототипом.