способ получения препарата на основе иммуноглобулина м для внутривенного применения

Формула изобретения

1. Способ получения вводимого внутривенно поликлонального, химически не модифицированного иммуноглобулинового препарата с содержанием иммуноглобулина М более чем 5 мас.%, в расчете на общее количество иммуноглобулина, и низкой антикомплементарной активностью, отличающийся тем, что водный раствор или суспензию соответствующей, содержащей иммуноглобулин М фракции плазмы обрабатывают путем инкубации в присутствии протеазы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что препарат обладает антикомплементарной активностью менее 500 СН50/г протеина, предпочтительно менее 200 СН50/г протеина и в особенности менее 150 СН50/г протеина, где CH50 представляет собой гемолитическую единицу комплемента.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что водный раствор или суспензию содержащей иммуноглобулин М фракции плазмы при кислом значении рН и при добавлении протеазы инкубируют при температуре, по крайней мере, 15^oС.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что температура инкубации составляет 20-50^oС, предпочтительно 35-40^oС.

5. Способ по п.3 или 4, отличающийся тем, что продолжительность инкубации составляет 1-48 ч, предпочтительно 6-12 ч.

6. Способ по одному из пп.1-5, отличающийся тем, что концентрация протеазы в водном растворе или суспензии содержащей иммуноглобулин М фракции плазмы составляет, по крайней мере, 50 Ед/г протеина, предпочтительно 300-1200 Ед/г протеина.

7. Способ по одному из пп.1-6, отличающийся тем, что рН-значение водного раствора или суспензии содержащей иммуноглобулин фракции плазмы при обработке протеазой составляет 3,5-5,5, предпочтительно 3,7-4,3.

8. Способ по одному из пп.1-7, отличающийся тем, что протеазой является эндопептидаза.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что протеазой является, по крайней мере, эндопептидаза, которую выбирают из группы, состоящей из пепсина, папаина, плазмина или термолизина, которые, в случае необходимости, могут быть иммобилизированы на носителе.

10. Способ по одному из пп.1-9, отличающийся тем, что ионная сила в водном растворе или суспензии содержащей иммуноглобулин М фракции плазмы составляет менее 0,1, предпочтительно менее 0,04.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способу получения пригодного для внутривенного применения раствора иммуноглобулина (Иг). В качестве исходного материала используют получаемую из крови человека или животного протеиновую фракцию, которая содержит иммуноглобулины в концентрированной форме.

Как известно, иммуноглобулины играют важную роль в иммунной системе человека и млекопитающего при защите от инфекций. Иммуноглобулины подразделяют на различные классы (например, ИгГ, ИгА, ИгМ, ИгД и ИгЕ) с различными биохимическими и физиологическими свойствами. Вплоть до 1980 г. был выделен только ИгГ и использован в качестве приемлемого для внутривенного применения продукта для профилактики и терапии. В заявках на европейские патенты 0013901, 0413187 и 0352500 описываются препараты на основе ИгМ, которые становятся приемлемыми для внутривенного применения главным образом за счет обработки с помощью -пропиолактона. В заявке на европейский патент 0413188 описывается способ, в котором достигают приемлемости для внутривенного применения за счет анионообменной хроматографической обработки с селективным элюированием внутривенно приемлемой фракции.

Целью настоящего изобретения является получение пригодного для внутривенного введения концентрата ИгМ высокой степени чистоты для терапии и профилактики. Продукт должен обладать низкой антикомплементарной активностью (АСА) и вызывать незначительное падение артериального давления в случае крыс в качестве модели, однако молекулы ИгМ не должны быть химически модифицированы. Этой цели неожиданно достигают путем обработки содержащего ИгМ иммуноглобулинового раствора с помощью протеазы.

Предметом изобретения, следовательно, является указанный в пункте 1 формулы изобретения способ.

Предпочтительно обработка протеазой представляет собой осуществляемую при повышенной температуре инкубацию в присутствии пепсина, папаина, плазмина или термолизина. Протеазы могут быть также химически модифицированы, иммобилизированы на носителе и/или получены путем генной технологии. Полученный по предлагаемому согласно изобретению способу препарат можно переводить во внутривенно вводимый раствор. Этот раствор показывает уменьшение АСА, падения кровяного давления в случае крыс в качестве модели и активности связывания C1q.

В качестве исходных материалов для способа согласно настоящему изобретению пригодны содержащие иммуноглобулин растворы, как, например, плазма; осадок А или Б, получаемый при фракционировании по методу Кистлера-Нитшманна; фракция Коэна I/II/III; II/III; III или другие, содержащие ИгМ фракции из плазмы человека или животного. Например, содержащую иммуноглобулин фракцию, как осадок Б по Кистлеру-Нитшманну, можно растворять в буферах и удалять наибольшую часть примесей путем осаждения с помощью 0,5-5%-ной октановой кислоты при рН-значении от 4 до 6, предпочтительно при рН 5. Затем раствор с низкой ионной силой при добавлении, по крайней мере, 50 ЕД/г, предпочтительно 600 ЕД/г, пепсина инкубируют в течение 1-48 ч, предпочтительно в течение 9 ч, при температуре 20-50^oС, предпочтительно при 37^oС.

Для дальнейшей очистки раствор можно подвергать адсорбции, например, с помощью содержащего диэтиламиноэтильные группы геля в ванне или по способу с использованием колонки. Если в целевом продукте далее нужно повысить концентрацию ИгМ, то содержащий ИгМ раствор подвергают обработке с помощью ионообменника (например, TMAE-Fractogel). Путем селективного элюирования, например, с помощью градиентов соли или рН, можно выделить фракцию ИгМ. Путем ультра- и диафильтрации соответственно гельфильтрации, раствор можно концентрировать и устанавливать содержание электролита в окончательной, приемлемой для внутривенного применения препаративной форме. Концентрация протеина может составлять 1-20%, предпочтительно 3-6%. Продукт может содержать дополнительно протеины, предпочтительно альбумин, а также сахар, предпочтительно глюкозу или сахарозу, или аминокислоты.

Для оценки внутривенной приемлемости иммуноглобулиновых препаратов обычно используют такой параметр, как антикоиплементарная активность (АСА). Для определения АСА определенное количество испытуемого продукта инкубируют с определенным количеством комплемента морской свинки и оттитровывают остающееся количество комплемента. АСА указывают как расход СН50 на г иммуноглобулина. Указанные результаты АСА далее определяют по методу, опубликованному М. Мауеr (М.М. Мауеr "Комплемент и фиксация комплемента", в руководстве "Экспериментальная иммунохимия", второе изд. 1961, с. 133-240, С. Thomas, Springfield, II). В качестве ориентировочного значения для внутривенно применимых ИгГ-продуктов указывается АСА <1000 СН50 на г протеина.

Для оценки внутривенной приемлемости далее можно использовать связывание компонента комплемента C1q с иммуноглобулином. Для определения инкубируют определенное количество испытуемого продукта вместе с определенным количеством очищенного, радиоактивно меченого Clq-комплемента в буфере и в сыворотке. Активность связывания Clq испытуемого продукта определяют путем преципитации в присутствии полиэтиленгликоля. Чем выше радиоактивность в осадке, тем больше активность связывания Clq-продукта. Более достоверной информации о роде Clq-связывания и вместе с тем о качестве продукта можно достигать в том случае, если Clq радиоактивно метят с помощью двух различных способов; с одной стороны, по возможности в мягких окислительных условиях с помощью лактопероксидазы (LPO) и, с другой стороны, в сильно окислительных условиях с помощью хлорамина Т (СТ). Исследования далее осуществляют по методу, опубликованному Р. Spth (P.J. Spth, A. Corvetta, U.E. Nydegger, R. Bttler: An Extended Clq-Binding Assay Using Lactoperoxidase- and Chloramin-T-Iodinated Clq; Scand. 3. Immunol. , 18, 319-328 [1983]). От интактного внутривенно приемлемого препарата ожидают, чтобы активность связывания Clq была по возможности незначительной. В качестве модели для испытания внутривенной приемлемости иммуноглобулинов используют крыс согласно Bleeker и др. (W.K. Bleeker, J. Аgterberg, G. Rigter, A. de Vries-van Rossen, J.С. Bakker: An animal model for the detection of hypotensive side effects of immunoglobulin preparations. Vox. Sang. , 52, 281-290 [1987]). Параметром приемлемости в этой модели является кровяное давление. Неприемлемые для внутривенного применения продукты приводят к отчетливому снижению кровяного давления.

Примеры

Ссылочный пример 1

1 кг осадка Б по Кистлеру-Нитшманну суспендируют в 4 кг 0,1 М ацетатного буфера, рН 5,1 и при комнатной температуре смешивают с 2% октановой кислоты. На 1 г октановой кислоты добавляют 0,15 г трикальцийфосфата и осадок отфильтровывают. Фильтрат подвергают диафильтрации против раствора с 20 ммоль/л пиперазина, 60 ммоль/л хлорида натрия, рН=5,8. Полученный после диафильтрации раствор обрабатывают с помощью 75 мг диэтиламиноэтил-сефадекса на 1 г протеина. Затем устанавливают концентрацию протеина при значении 20 мг/мл и раствор обрабатывают в течение 8 часов при температуре 25^oС с помощью 1% Tвина 80 и 0,3% три-н-бутилфосфата. После этого раствор вносят в колонку, содержащую TMAE-Fractogel, и элюируют фракцию ИгМ с помощью элюента, содержащего 20 ммоль пиперазина, 160 ммоль хлорида натрия, рН 5,8. Целевой продукт концентрируют до содержания протеина 5% и устанавливают рН-значение, равное 4,5.

Ссылочный пример 2

1 кг осадка Б по Кистлеру-Нитшманну суспендируют в 4 кг 0,1 М ацетатного буфера, рН 5,1 и при комнатной температуре смешивают с 2% октановой кислоты. На 1 г октановой кислоты добавляют 0,15 г трикальцийфосфата и осадок отфильтровывают. Фильтрат подвергают диафильтрации против раствора с 20 ммоль/л хлорида натрия и полученный после диафильтрации раствор доводят до содержания протеина 20 мг/мл. Устанавливают рН-значение равным 4,0 с помощью 0,2 М соляной кислоты и раствор инкубируют в течение 9 ч при температуре 37^oС. После охлаждения до температуры 20^oС устанавливают рН-значение равным 5,8 и добавляют пиперазин до концентрации 20 ммоль/л и хлорид натрия до концентрации 60 ммоль/л. Раствор затем обрабатывают в течение 8 ч при температуре 25^oС с помощью 1% Tвина 80 и 0,3% три-н-бутилфосфата. После этого раствор вносят в колонку, содержащую TMAE-Fractogel, и элюируют фракцию ИгМ с помощью элюента, содержащего 20 ммоль пиперазина, 160 ммоль хлорида натрия, рН 5,8. Конечный продукт концентрируют до содержания протеина 5% и устанавливают рН-значение, равное 4,5.

Пример 1

1 кг осадка Б по Кистлеру-Нитшманну суспендируют в 4 кг 0,1 М ацетатного буфера, рН 5,1 и при комнатной температуре смешивают с 2% октановой кислоты. На 1 г октановой кислоты добавляют 0,15 г трикальцийфосфата и осадок отфильтровывают. Фильтрат подвергают диафильтрации против раствора с 20 ммоль/л хлорида натрия и полученный после диафильтрации раствор доводят до содержания протеина 20 мг/мл. Устанавливают рН-значение равным 4,0 с помощью 0,2 М соляной кислоты и добавляют 600 ЕД пепсина на 1 г протеина. Затем раствор инкубируют в течение 9 ч при температуре 37^oС. После охлаждения до температуры 20^oС устанавливают рН-значение равным 5,8 и добавляют пиперазин до концентрации 20 ммоль/л и хлорид натрия до концентрации 60 ммоль/л. Раствор затем обрабатывают в течение 8 ч при температуре 25^oС с помощью 1% Tвина 80 и 0,3% три-н-бутилфосфата. После этого раствор вносят в колонку, содержащую TMAE-Fractogel, и элюируют фракцию ИгМ с помощью элюента, содержащего 20 ммоль пиперазина, 160 ммоль хлорида натрия, рН 5,8. Конечный продукт концентрируют до содержания протеина 5% и устанавливают рН-значение, равное 4,5.

Пример 2

1 кг осадка Б обрабатывают по методике ссылочного примера 2, причем, однако, вместо 600 ЕД пепсина на 1 г протеина добавляют раствор 1200 Ед. пепсина на 1 г протеина перед инкубацией при рН-значении, равном 4.

Характеристика экспериментально полученных продуктов

Иммуноглобулины ИгГ, ИгА и ИгМ определяют нефелометрически с помощью антисывороток. Общее содержание протеина определяют по методу Кьельдаля (см. табл.1).

Табл.2 параметров приемлемости приведена в конце описания.

Добавление пепсина вызывает снижение АСА, уменьшение падения артериального давления у крыс в качестве модели, а также снижение активности связывания C1q.