композиция стабилизированного гормона роста и способ ее приготовления

Формула изобретения

1. Способ приготовления стабильной жидкой композиции гормона роста, содержащей гормон роста, буфер и эффективное для стабилизации количество по меньшей мере одного стабилизирующего агента, выбранного из группы, состоящей из: (i) неионных поверхностно-активных веществ на основе полиоксиэтилен-полиоксипропиленового блок-сополимера, (ii) таурохолевой кислоты или ее солей, или производных, и (iii) производных метилцеллюлозы, включающий смешивание раствора гормона роста с буфером и стабилизирующим агентом (агентами) в таких условиях, что гормон роста не подвергается воздействию концентраций буфера или стабилизирующего агента (агентов), которые выше чем в 2 раза от конечных концентраций буфера или стабилизирующего агента (агентов) в композиции, и концентрация стабилизирующего агента (агентов) в композиции составляет 0,01-5,0% вес./об.

2. Способ по п.1, где гормон роста является гормоном роста человека.

3. Способ по п.1 или 2, где композиция содержит 0,05-2,0% вес./об., предпочтительно 0,08-1,0% вес./об., стабилизирующего агента (агентов).

4. Способ по пп.1-3, где стабилизирующий агент (агенты) выбирают из Pluronic полиспиртов, таурохолевой кислоты и ее солей и гидроксипропилметилцеллюлозы.

5. Способ по пп. 1-4, где композиция содержит 0,08% вес./об. Pluronic полиспирта в качестве стабилизирующего агента (агентов).

6. Способ по пп.1-5, где композиция содержит фармакологически приемлемый буфер, предпочтительно фосфатный или нитратный буфер, с концентрацией от 2,5 до 50 мМ, предпочтительно 10-20 мМ.

7. Способ по пп.1-6, где рН композиции составляет от 5,0 до 7,5, предпочтительно от 5,0 до 6,8, более предпочтительно от 5,2 до 6,5 и наиболее предпочтительно от 5,4 до 5,8.

8. Стабильная жидкая композиция гормона роста, приготовленная по способу в соответствии с любым из пп.1-7.

9. Стабильная жидкая композиция гормона роста, содержащая гормон роста, буфер и эффективное для стабилизации количество по меньшей мере одного стабилизирующего агента, выбранного из таурохолевой кислоты или ее солей, или производных и производных метилцеллюлозы, полученная способом по любому из пп.1-7.

10. Способ лечения больного человека или животного, нуждающегося в гормоне роста, включающий введение указанному пациенту фармацевтически эффективного количества композиции по п.8 или 9.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к композиции стабилизированного гормона роста (ГР) и в особенности к жидким композициям гормона роста человека (ГРЧ), который стабилизирован введением стабилизирующих добавок. Эти жидкие композиции ГРЧ имеют повышенную химическую и физическую стабильность. Настоящее изобретение относится в особенности к способу получения таких композиций стабилизированного ГР.

Обоснование изобретения

Гормоны роста человека и животных представляют собой протеины, содержащие приблизительно 191 аминокислоту, которые обнаруживаются в переднем гипофизе. Главное биологическое действие ГР - ускорять соматогенез у молодых особей и сохранять ткани у взрослых особей. ГР воздействует на скелет, мышцы, соединительную ткань и внутренние органы. Гормон роста действует путем взаимодействия со специфическими рецепторами мембран клеток-мишеней.

Гормон роста человека (ГРЧ) является ключевым гормоном, вовлеченным в регуляцию нормального роста тела человека, и, кроме того, воздействует на ряд физиологических и метаболических функций, включающих среди прочего линейный рост костей, выделение молока и использование клеточной энергии. Дефицит ГРЧ у маленьких детей приводит к низкорослости, и это расстройство лечат введением ГРЧ извне.

В прошлом внимание было сосредоточено на определении молекулярных функций гормона роста у различных видов. Практический интерес был силен и в медицинских, и в ветеринарных кругах, и ген ГРЧ был клонирован. В настоящее время и ГРЧ, и его производное метионил-ГРЧ (мет-ГРЧ) получают путем биосинтеза в системах культур клеток млекопитающих и бактерий.

Для того чтобы ГРЧ мог быть доступен на рынке как терапевтический и профилактический препарат, должны быть получены стабильные композиции. Такие композиции должны сохранять свою активность при хранении в течение приемлемого времени, они должны легко составляться и быть пригодными для введения пациентам.

Гормон роста человека может быть введен в различные рецептуры. В качестве примера патент США 5096885 описывает фармацевтически приемлемую композицию ГРЧ, содержащую кроме ГРЧ глицин, маннитол, буфер и необязательно неионный поверхностно-активный агент с мольным соотношением ГРЧ:глицин 1:50-200. Международный патент WO 93/19776 описывает композиции ГРЧ для инъекций, содержащие цитрат в качестве буферного вещества и необязательно факторы роста, такие как инсулиноподобные факторы роста или эпидермальные факторы роста, аминокислоты, такие как глицин или аланин, маннитол или другие сахарные спирты, глицерин и/или консервант, такой как бензиловый спирт. Международный патент WO 94/13198 описывает композицию ГР, содержащую ГРЧ, буфер, неионный поверхностно-активный агент и необязательно нейтральную соль и/или консервирующий агент.

В европейском патенте 0131864 (и в соответствующем австралийском патенте 579016) описан водный раствор протеинов с молекулярным весом выше 8500 дальтон, которые защищены от адсорбции на поверхностях раздела, против денатурирования и против осаждения протеинов добавлением в качестве стабилизирующего агента поверхностно-активного вещества, содержащего линейную полиоксиалкиленовую цепь.

Европейский патент 0211601 описывает композицию для ускорения роста, содержащую водную смесь ускоряющего рост гормона и блок-сополимера, состоящего из полиоксиэтиленполиоксипропиленовых единиц и имеющего средний молекулярный вес от примерно 1100 до примерно 40000, который сохраняет текучесть ускоряющего рост гормона и его биологическую активность до применения. Более поздний европейский патент 0303746 описывает различные другие стабилизаторы ускоряющего рост гормона для водных сред, включающие некоторые полиспирты, аминокислоты, полимеры аминокислот, имеющие заряженные боковые группы при физиологических величинах рН, и соли холина.

Фармацевтические препараты ГРЧ проявляют нестабильность особенно в растворах. Появляются продукты деградации, такие как деамидированные или сульфоксилированные формы ГРЧ, и из-за физической нестабильности могут образоваться димерные или более высокомолекулярные агрегаты (Becker et al., 1988, Biotechnol Applied Biochem., 10, 326, Pearlman and Nguyen, 1989, в книге D. Marshak and D. Liu (eds), Therapeutic Peptides and Proteins, Formulations, Delivery and Targetting, Current Communications in Molecular Biology, Cold-Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, New York, pp 23-30; Becker et al., 1987, Biotechtol. Applied Biochem., 9, 478).

Вследствие нестабильности ГРЧ в растворе фармацевтические композиции ГРЧ предпочтительно поставляются в лиофилизированной форме, которая должна быть восстановлена перед применением. Лиофилизацию часто используют для того, чтобы сохранить биологическую активность и биохимическую целостность полипептидов в диапазоне условий хранения, когда стабильность в растворе неудовлетворительна, однако было бы предпочтительно избежать лиофилизации, так как это дорогой и длительный этап производства. Лиофилизированные формы ГРЧ обычно восстанавливаются перед применением путем добавления фармацевтически приемлемого разбавителя, такого как стерильная вода для инъекций, стерильный солевой физиологический раствор или другой подходящий стерильный физиологически приемлемый разбавитель. Восстановленные растворы ГРЧ предпочтительно хранят при 4^oС, чтобы свести к минимуму реакции химической и физической деградации, однако некоторая деградация будет происходить при таком хранении, которое может продолжаться до 14 суток.

Фармацевтическая композиция ГРЧ, поставляемая в жидкой форме, особенно такая, которая сохраняет стабильность ГРЧ в течение длительного периода времени, была бы особенно полезной. Как описано выше, существующие жидкие композиции имеют ограниченный срок хранения из-за продуктов реакций химической и физической деградации, которые протекают во время производства и хранения. Проблемы, связанные с образованием димеров, были рассмотрены в Becker et al., 1987 (см. выше), и предшествующие попытки избежать образования димеров ГРЧ оказались безуспешными.

Цель настоящего изобретения - предложить стабильные жидкие композиции ГРЧ, которые не приводят к образованию нежелательных агрегированных веществ или не вызывают химических изменений, снижающих биологическую активность или меняющих распознавание рецептора. Другая цель - предложить композицию, которая могла бы вводиться безыгольным шприцом для подкожных инъекций или превращаться в аэрозоль для использования при вдыхании.

Краткое описание изобретения

В соответствии с настоящим изобретением предлагается способ приготовления стабильной жидкой композиции гормона роста, содержащей гормон роста, буфер и эффективное для стабилизации количество по меньшей мере одного стабилизирующего агента, выбранного из группы, включающей:

(i) неионные поверхностно-активные вещества на основе полиоксиэтилен-полиоксипропиленового блок-сополимера;

(ii) таурохолевую кислоту, или ее соли, или производные;

(iii) производные метилцеллюлозы,

где способ включает смешивание гормона роста с буфером и стабилизирующим агентом (агентами) в таких условиях, что гормон роста не подвергается контакту с концентрациями буфера или стабилизирующего агента (агентов), большими чем 2 от конечных концентраций буфера или стабилизирующего агента (агентов) в композиции.

Данное изобретение также распространяется на стабильную жидкую композицию гормона роста, полученную по способу, который в целом описан выше.

В еще одном аспекте изобретение также распространяется на стабильную жидкую композицию гормона роста, содержащую гормон роста, буфер и эффективное для стабилизации количество по меньшей мере одного стабилизирующего агента, выбранного из группы, включающей таурохолевую кислоту, или ее соли, или ее производные и производные метилцеллюлозы.

В данном описании, если другое не следует из контекста, слово "содержат" или его вариации, такие как "содержит" или "содержащий", следует понимать как включение заявленного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.

По особенно предпочтительному осуществлению изобретение предлагает способ приготовления стабилизированной фармацевтически приемлемой жидкой композиции гормона роста человека, включающей:

(а) фармацевтически эффективное количество ГРЧ,

(b) 0,01-5,0% вес./об. по меньшей мере одного стабилизатора, выбранного из группы, которая в общем определена выше,

(с) фармакологически приемлемый буфер.

Предпочтительно эта композиция содержит 0,05-2,0% (вес./об.), более предпочтительно 0,08-1,0% вес./об. стабилизирующего агента (агентов).

Особо предпочтительными стабилизирующими агентами являются (Pluronic) полиспирты, таурохолевая кислота и ее соли и гидроксипропилметилцеллюлоза, причем Pluronic является товарным наименованием полиспиртов, являющихся патоксиалкиленовыми производными пропиленгликоля с молекулярной массой 1000-15000.

Стабилизированная жидкая композиция гормона роста предпочтительно содержит также фармакологически приемлемый буфер, такой как фосфатный или цитратный буфер в концентрации 2,5-50 мМ, наиболее предпочтительно 10-20 мМ.

Показатель рН композиции составляет предпочтительно от 5,0 до 7,5, более предпочтительно от 5,0 до 6,8, еще более предпочтительно от 5,2 до 6,5 и наиболее предпочтительно от 5,4 до 5,8.

При приготовлении стабилизированной жидкой композиции гормона роста гормон роста смешивается с буфером при таких условиях, что гормон роста не подвергается контакту с концентрациями буфера, большими чем 2 конечной концентрации буфера в композиции, и затем к смеси добавляется стабилизирующий агент (агенты) при соответствующих условиях.

В особо предпочтительном способе приготовления стабилизированной жидкой композиции гормона роста экспозиция гормона роста ограничена концентрациями фосфатного или цитратного буфера и Pluronic (товарное наименование) полиспиртов не выше чем 2 конечной концентрации каждого компонента.

Настоящее изобретение также распространяется на способ лечения человека или животного, нуждающегося в гормоне роста, который включает введение указанному пациенту фармацевтически эффективного количества стабильной жидкой композиции гормона роста, описанного в общем выше.

Жидкая композиция гормона роста может вводиться инъекцией в пищевой комок аэрозольным устройством, или безыгольным пистолетом для инъекций, или непрерывным внутривенным вливанием.

В данном контексте ссылки на "гормон роста" предполагают включение всех видов гормона роста, включающих среди прочих человеческий, бычий, свиной, овечий и лосолевый, в особенности ГРЧ, а также биологически активные производные ГР. Производные ГР включают производные ГР человека или животных с вариациями в последовательности аминокислот, такими как небольшие делеции аминокислот или замещение аминокислот другими аминокислотными остатками. Кроме того, включаются усеченные формы ГР и их производные, а также ГР с добавлениями аминокислоты к амино или карбоксильному концу протеина, такие как метионил-ГРЧ. Другим типом модификации ГРЧ является модификация, образованная ковалентным присоединением полиэтиленгликоля к реактивным аминокислотам (Davis et al., US Patent 4179337).

Подробное описание изобретения

Способ приготовления жидких композиций ГР и стабилизирующих агентов, предлагаемый настоящим изобретением, дает в результате стабильную жидкую композицию ГР, пригодную для длительного хранения при температурах ниже и выше температуры замерзания и для терапевтического применения. Терапевтические композиции, содержащие эти стабилизирующие агенты, являются стабильными, и в то же время позволяющими терапевтическое применение композиции.

По предпочтительному осуществлению настоящего изобретения ГР представляет собой ГРЧ.

(1) Композиции гормона роста человека

Термины "гормон роста человека" или "ГРЧ" обозначают гормон роста человека, полученный, например, экстракцией и очисткой ГРЧ из природных источников или системами рекомбинантных клеточных культур. Последовательность ГРЧ и его характеристики описаны, например, в Hormone Drugs, Gueriguigan et al., USP Convention, Rockville, MD (1982). Как указано выше, эти термины также распространяются на биологически активные эквиваленты гормона роста человека, которые отличаются одной или несколькими аминогруппами в общей последовательности ГРЧ, включая, в частности, мет-ГРЧ. Эти термины также предназначены включать в себя варианты ГРЧ, полученные замещением, делецией и инсерцией аминокислот, или послетрансляционные модификации. ГРЧ, использованный в композиции по настоящему изобретению, обычно получали рекомбинантными способами, как указано ранее.

"Фармацевтически эффективное количество" ГР, в частности ГРЧ, относится к такому количеству, которое вызывает терапевтический эффект при различных режимах введения. Композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены с содержанием ГР по меньшей мере от примерно 0,1 мг/мл до примерно 20 мг/мл или более, предпочтительно от примерно 1 мг/мл до примерно 10 мг/мл, более предпочтительно от примерно 1 мг/мл до примерно 5 мг/мл.

(2) Буфер и рН

Буфером может быть любой фармацевтически приемлемый буферный агент, такой как фосфат, трис-HCl, цитрат и т.п. Предпочтительным буфером является фосфатный или цитратный буфер. Предпочтительной является концентрация буфера большая или равная 2 мМ и меньшая чем 50 мМ, наиболее предпочтительно 10-20 мМ. Подходящим для приготовления композиции интервалом рН, который регулируется буфером, является интервал от примерно 5 до примерно 7,5, наиболее предпочтительно около 5,6. Показатель рН композиции должен быть меньше чем 7,5 для того, чтобы снизить деамидизацию ГР.

(3) Стабилизирующие агенты

В соответствии с настоящим изобретением композиция содержит один или несколько стабилизирующих агентов для повышения стабильности ГР. Стабилизирующим агентом может являться неионное поверхностно-активное вещество из полиоксиэтилен-полиоксипропиленового блок-сополимера, такое как полиоениевый полиспирт (Pluronics ), например Pluronics F127, F68, L64, РЕ6800 и РЕ6400, желчная соль, такая как соль таурохолевой кислоты или ее производное, или производное метилцеллюлозы, такое как гидроксипропилметилцеллюлоза (НПМЦ). Композиция может содержать один стабилизирующий агент или комбинацию из двух или нескольких агентов.

Концентрация добавленного стабилизирующего агента (агентов) будет определяться выбором буфера и рН, но предпочтительно должна быть в интервале от 0,01% до 5,0%, более предпочтительно от 0,05 до 2,0% и еще более предпочтительно от 0,08 до 1,0% в расчете вес на объем. Использование стабилизирующих агентов улучшает стабильность композиции, если она предназначена для длительного хранения в широком интервале температур, включающем температуры ниже и выше температуры замерзания, или если композиция подвергается межфазному напряжению.

Стабилизирующий агент (агенты) улучшает стабильность к межфазному напряжению при повышенных концентрациях. Однако повышенная концентрация стабилизирующего агента снижает химическую стабильность. По настоящему изобретению концентрация стабилизирующего агента (агентов) оптимизируется, чтобы достичь высокой стабильности к межфазному напряжению при минимуме дополнительной химической нестабильности.

(4) Предпочтительная композиция стабилизирующих агентов и ГРЧ

При приготовлении композиции по настоящему изобретению один или несколько стабилизирующих агентов добавляют к жидкой композиции ГРЧ. Как описано выше, при составлении композиции гормон роста подвергается воздействию концентраций буфера не выше чем 2 конечной концентрации буфера, и предпочтительно стабилизирующий агент (агенты) добавляют в композицию непосредственно перед конечным регулированием объема. Получаемые композиции имеют улучшенную стабильность к денатурации и не восприимчивы к нежелательным реакциям, которые могут иметь место в ходе процесса и при хранении. Термин "процесс", как он используется здесь, включает фильтрацию, заполнение ампул растворами ГРЧ и другие манипуляции, включенные в производство композиции.

Жидкие композиции ГРЧ для терапевтического применения могут быть приготовлены путем соединения ГРЧ и стабилизирующих агентов, имеющих необходимую степень чистоты, с физиологически приемлемыми добавками, буферными растворами или консервантами (Pemington"s Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, Osol, A., Ed. (1980)). Приемлемыми добавками являются те, которые нетоксичны для пациента при используемых концентрациях и дозах и включают буферы, консерванты, антиоксиданты и регуляторы рН и тоничности.

Жидкие композиции гормона роста могут также, если требуется, включать один или несколько других стабилизирующих добавок. Дополнительные стабилизирующие добавки могут включать, например, аминокислоты, такие как глицин или аланин, манитол и другие спирты сахаров или глицерин. Кроме того, жидкая композиция может включать другие факторы роста, такие как инсулиноподобные факторы роста или эпидермальный фактор роста.

Предпочтительное осуществление изобретения предлагает способы эффективной стабилизации ГРЧ. Предпочтительная композиция содержит один или несколько стабилизирующих агентов, выбранных из полиспиртов Pluronic, таурохолевой кислоты, или ее солей, или производных, или производных метилцеллюлозы. Композиция предпочтительно содержит существенно чистый ГРЧ, свободный от загрязняющих пептидов, или протеинов, или от инфекционных агентов, обнаруживаемых у человека. Композиции в этом предпочтительном осуществлении могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества. Они включают, например, буферы, модификаторы изотоничности и рН, хелатирующие агенты, консерванты, антиоксиданты, вспомогательные растворители и т.п., конкретные примеры которых могут включать цитратные соли, фосфатные соли и т.п. Консерванты могут быть добавлены, если ожидаемое использование композиции может угрожать стерильности, и в таком случае может быть использован фармацевтически приемлемый консервант, такой как бензиловый спирт или фенол.

Повышенная стабильность ГРЧ, обеспечиваемая композицией, приготовленной в соответствии с настоящим изобретением, позволяет широко использовать композиции ГРЧ, которые могут быть более концентрированными чем те, которые обычно используются без стабилизирующих агентов. Например, стабилизированные жидкие композиции ГРЧ также снижают частоту вызванного контактом с поверхностью денатурирования ГРЧ, которое происходит при создании аэрозоля или при безыгольной инъекции композиции ГРЧ. Дальнейшее оптимальное дозирование композиции ГРЧ может быть осуществлено, когда композиции ГРЧ по настоящему изобретению разливаются в сосуды 1-50 мг на сосуд, предпочтительно 2-25 мг на сосуд и более предпочтительно 3-10 мг на сосуд. Увеличенная стабильность композиции ГРЧ делает возможным их длительное хранение при соответствующих температурах, таких как ниже температуры замерзания (наиболее предпочтительно при -20^oС) или выше температуры замерзания, предпочтительно при 2-8^oС, наиболее предпочтительно при 4^oС.

Композиции ГРЧ, предназначенные для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко обеспечивается фильтрацией через стерильные фильтрационные мембраны.

Терапевтические жидкие композиции ГРЧ обычно помещаются в контейнер, имеющий стерильный порт доступа, например в мешок для внутривенных растворов, или в сосуд, имеющий пробку, которая может быть проткнута иглой для подкожных инъекций.

Способ введения жидких композиций ГРЧ по настоящему изобретению соответствует известной практике, например, инъекцией или вливанием внутривенным, внутрибрюшинным, внутрицеребральным, внутримышечным, внутриглазным, внутриартериальным, или внутриочаговым путем, или непрерывным внутривенным вливанием.

Дополнительные характеристики настоящего изобретения будут ясны из нижеследующих примеров и сопровождающих чертежей.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 показывает химическую стабильность ГРЧ (1,5 мг/мл) в 5 мМ фосфатном буфере, рН 6,0-7,5.

Фигура 2 показывает зависимость агрегирования ГРЧ (2 мг/мл в 10 мМ ацетатном буфере, рН 4,1-4,5 или в 5 мМ фосфатном буфере, рН 6,0-7,5), вызванного межфазным напряжением (вихревое перемешивание).

Фигура 3 представляет графически способность различных стабилизирующих агентов уменьшать осаждение агрегированного ГРЧ, вызванное межфазным напряжением (вихревое перемешивание).

Фигура 4 показывает стабильность двух композиций ГРЧ (5 мг/мл), отличающихся только способом введения ГРЧ, в среду, и третьей композиции ГРЧ, к которой добавлено 0,005% вес./об. EDTA.

Примеры

Пример 1. Способы отбора стабилизирующих агентов

Способность стабилизирующих агентов уменьшать или предотвращать агрегацию ГР и, в особенности ГРЧ, вызванную межфазным напряжением, оценивали, используя способ быстрого агрегирования, и анализировали методом хроматографии исключения по размеру (SEC). Хроматографию ГРЧ проводили при использовании двух колонок TSK G3000SW (7,8 мм внутр. диаметр 300 мм, Toyo Sodo, Japan) последовательно. Подвижная фаза состояла из 0,1 мМ фосфатного буфера, рН 7,0, и прокачивалась со скоростью потока 0,9 мл/мин. Элюирование ГРЧ детектировалось по поглощению УФ на 214 нм при использовании объема пробы 20 мкл.

Способ быстрого агрегирования включал создание развитой поверхности раздела воздух/вода путем вихревого перемешивания раствора ГРЧ с постоянной скоростью в течение 15-60 сек в закрытых полипропиленовых пробирках (11 мм внутр. диаметр 74 мм). Пробы доводили до разновесия в течение 30 мин при комнатной температуре, чтобы произошло осаждение, затем фильтровали через 0,2 мкм фильтры для микроцентрифуг из ацетатцеллюлозы и фильтрат анализировали методом SEC. Контрольные растворы каждой пробы, которые не прошли обработку, также анализировали методом SEC.

Количество оставшегося общего растворимого ГРЧ (площадь пика мономерных и более высокомолекулярных соединений) выражали как процент от общей площади пика (принадлежащего ГРЧ) соответствующего необработанного контрольного раствора.

Таблица 1 показывает влияние различных стабилизирующих агентов на степень агрегирования ГРЧ, вызванного межфазным напряжением, при рН 7,0.

Таблица 2 показывает влияние различных стабилизирующих агентов на степень агрегирования ГРЧ, вызванного межфазным напряжением, при рН 6,0.

Таблица 3 показывает влияние различных стабилизирующих агентов на степень агрегирования ГРЧ, вызванного межфазным напряжением, при рН 5,6.

Таблица 4 показывает влияние регулирования изотоничности на степень агрегирования ГРЧ (1,5 мг/мл) в различных буферах при рН 5,6.

Таблица 5 показывает влияние различных стабилизирующих агентов на степень агрегирования ГРЧ, вызванного замерзанием-плавлением при рН 5,6.

Как показано в прилагаемых таблицах, ряд добавок оказался очень эффективным для снижения или предотвращения агрегирования ГРЧ, вызванного межфазным напряжением. Полиониевые (pluronic) полиспирты обеспечивают почти количественную защиту при концентрациях выше 0,05% вес./об., причем остается только мономерный ГРЧ. Таурохолат обеспечивает почти количественную защиту при коцентрациях выше 0,02%, причем остается только мономерный ГРЧ. Тауродеоксихолат не годится в качестве стабилизирующего агента при рН выше 5,6, так как он вызывает димеризацию ГРЧ в отсутствии межфазового напряжения.

Были исследованы характеристики агрегирования ГРЧ (1,5 мг/мл, рН 5,6) в цитратном или фосфатном (5 или 20 мМ) буфере без добавления или с добавлением хлористого натрия (для изотоничности), поскольку сообщалось, что это агрегирование зависит от концентрации фосфата (Pearlman and Nguyen, 1992, J. Pharm. Pharmacol, 44, 178-185).

Использовали вышеописанную методику эксперимента при изменении времени обработки (15 сек).

Было найдено, что агрегирование ГРЧ не зависит от природы буфера или от концентрации буфера. Агрегирование ГРЧ обратно пропорционально ионной силе (при регулировании NaCl).

Исследовали агрегирование ГРЧ (1,5 мг/мл в 20 мМ изотоническом цитратном буфере, рН 5,6) в присутствии сред, вызванное замерзанием-плавлением. Пробы ГРЧ (100 мкл) в присутствии различных сред замораживали при -20^oС в течение 24 час и затем расплавляли при комнатной температуре и выдерживали до равновесия в течение 30 мин, чтобы произошло осаждение. Анализ отфильтрованных проб проводили методом SEC, как описано выше.

Агрегирование ГРЧ после замерзания-плавления не было обильным, но не увеличивалось при введении добавок.

Пример 2

Фигура 1 является наглядным профилем химической стабильности ГРЧ (1,5 мг/мл) в 5 мМ фосфатном буфере, рН 6,0-7,5 (хранилось при 40^oС). Пробы после разложения анализировали жидкостной хроматографией высокого разрешения с обращенной фазой (ЖXBP-ОФ) по способу, описанному в United States Pharmacopoeia (USP 1990) с использованием колокни Vydac C-4. Продукты разложения идентифицировали в соответствии с методикой, описанной в US Pharmacopeial Prewies, Nov-Dec, 1990, как дезамидо-ГРЧ или окисленный ГРЧ. Количество нативного ГРЧ (график А), дезамидо-ГРЧ (график В) и окисленного ГРЧ (график С), присутствующих в деградированных пробах, выражено как процент площади пика (для нативного ГРЧ или продуктов разложения) относительно общей площади пика (в расчете на ГРЧ) при рН 6,0 (о), рН 6,5 (), рН 7,0 () и рН 7,5 ().

Было найдено, что убыль нативного ГРЧ отвечает кинетике первого порядка в интервале рН 6,0-7,5 и уравнению Аррениуса в интервале температур 8-40^oС. Найденные значения константы скорости первого порядка при 40^oС были в интервале от 2,410^-2 сут^-1 при рН 6,0 до 7,410^-2 сут^-1 при рН 7,5. То что деамидирование и окисление являлись плавными путями разложения ГРЧ, согласуется с опубликованными отчетами (Peariman and Nguyen, 1989, см. выше). Дезамидо-ГРЧ образовывался с большей скоростью, чем окисленный ГРЧ. Химическая стабильность улучшалась при значениях рН от 6,0 и ниже.

Фигура 2 показывает агрегирование и осаждение ГРЧ (2 мг/мл) в 10 мМ ацетатном буфере (рН 4,1-4,5) или 5 мМ фосфатном буфере (рН 6,6-7,5), вызванное межфазным напряжением с использованием методик, описанных в примере 1. Количество мономерного ГРЧ (площадь пика мономера) или общее количество остающегося растворенного ГРЧ (суммарная площадь пика мономера и более высокоагрегированных продуктов) определяли в процентном отношении к площади пика соответствующего необработанного контрольного раствора. Данные представляют количество растворенного мономерного ГРЧ (график А) или общего растворенного ГРЧ (график В), остающегося после вихревого перемешивания в течение 30 сек (о) или 60 сек ().

Агрегирование и последующее осаждение ГРЧ были максимальными в интервале рН от 5 до 6. Только мономерный ГРЧ оставался в растворе после межфазного напряжения в интервале рН 4,1-6,0. Растворимые агрегированные продукты (димер и агрегаты более высокого порядка) присутствовали главным образом в интервале рН 7,0-7,5.

Фигура 3 показывает влияние добавок (% вес./об.) на агрегирование ГРЧ (1,5 мг/мл в 5 мМ фосфатном буфере, рН 5,6), вызванное межфазным напряжением при вихревом перемешивании с постоянной скоростью в течение 60 сек, представленном на фиг.2. Данные представляют процентное содержание общего растворимого ГРЧ (мономер плюс более высоко агрегированные продукты), остающегося после обработки, выраженное в процентах относительно пика площади пика ГРЧ по анализу соответствующего контрольного раствора в присутствии Pluronic F-68 (о), Pluronic F-127 (), таурохолата натрия () или ГПМЦ ().

В отсутствии добавок в растворе остается менее чем 1% ГРЧ. Добавление Pluronic полиспиртов, таурохолата или ГПМЦ приводило к существенному увеличению количества остающегося ГРЧ. Pluronic F-68, F-127 и таурохолат в особенности обеспечивают почти количественную защиту ГРЧ от агрегирования.

Пример 3

Фигура 4 показывает влияние способа приготовления композиции на стабильность композиций ГРЧ. Композицию 1 готовили путем концентрирования раствора очищенного ГРЧ до 7-7,5 мг/мл и добавления двухкратного концентрата раствора, содержащего все добавки и доведенного до такого рН, которое обеспечило бы рН жидкой композиции 5,6 без дополнительного регулирования, и заключительного разбавления водой до получения конечной концентрации ГРЧ 5 мг/мл.

Композиция 2 готовили буферным обменом и раствор очищенного ГРЧ концентрировали до необходимой концентрации путем обмена в буфер, который содержал все добавки (кроме Pluronic F-68) в необходимой концентрации. Затем добавляли достаточное количество Pluronic F-68, чтобы получить требуемую концентрацию. Затем проверяли рН и, если требовалось, доводили его до нужной величины.

Композиции 1 и 2 имели одинаковые характеристики:

ГРЧ (соматотропин) - 5 мг

Моногидрат лимонной кислоты - 2,04 мг/мл

Дигидрат тринатрийцитрата - 2,85 мг/мл

Хлористый натрий - 6,23 мг/мл

Гидроокись натрия - 0,388 мг/мл

Бензиловый спирт - 0,9%

Pluronic F-68 - 0,08%

pН - 5,6

Композицию 3 готовили так же, как композицию 2, с такими же характеристиками, как у композиций 1 и 2, при добавлении 0,005% вес. EDTA.

Композиции 1-3 хранили при 40^oС и периодически проверяли на содержание ГРЧ методом ЖХВР исключения по размеру в течение 40 дней. Как показано на фиг.4, в ускоренном тесте на стабильность при 40^oС композиции 2 и 3 показали превосходную стабильность, особенно в сравнении с композицией 1.