пептидный антиген, полученый из белка х вируса гепатита b (варианты), ph-чувствительная липосома для индукции клеточного иммунитета против вируса гепатита b

Классы МПК:C07K14/02 Hepadnaviridae, например вирус гепатита B
A61K38/08 пептиды, содержащие 5-11 аминокислот
A61K9/127 липосомы
A61K39/29 вирус гепатита
Автор(ы):, , , , , ,
Патентообладатель(и):МОГАМ БАЙОТЕКНОЛОДЖИ РИСЕРЧ ИНСТИТЬЮТ (KR)
Приоритеты:
подача заявки:
1998-01-19
публикация патента:

Изобретение относится к липосомам, включающим новые пептидные антигены, которые принимают участие в регулировании иммунитета человека против вируса гепатита В, более конкретно к группам пептидов, соответствующих эпитопам антигенов, полученных из балка Х НВV. Пептидные антигены индуцируют цитотоксические Т-лимфоциты против вируса гепатита В или иммунологической толерантности в отношении вируса. рН-чувствительные липосомы включают пептидные антигены для индуцирования клеточного иммунитета таким образом, чтобы могли вырабатываться СТL, специфичные в отношении вируса. Так как пептидные антигены, полученные из белка Х, такие как Х3, Х4, Х5, Х6 и Х7, активируют СТL, которые могут распознавать антигены НВV, присутствующие в организме человека, и могут также распознаваться СТL, указанные липосомы можно использовать для создания потенциальных лекарственных средств для профилактики и лечения НВV-ассоциированных заболеваний. 6 с. и 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 5 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14

Формула изобретения

1. Пептидный антиген, полученный из белка X вируса гепатита В, который распознается цитотоксическими Т-лимфоцитами, для проявления цитотоксичности против вируса гепатита В, причем его аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID No: 1: HLSLRGLFV.

2. Пептидный антиген, полученный из белка Х вируса гепатита В, который распознается цитотоксическими Т-лимфоцитами, для проявления цитотоксичности против вируса гепатита В, причем его аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID No: 2: VLHKRTLGL.

3. Пептидный антиген, полученный из белка X вируса гепатита В, который распознается цитотоксическими Т-лимфоцитами, для проявления цитотоксичности против вируса гепатита В, причем его аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID No: 3: AMSTTDLEA.

4. Пептидный антиген, полученный из белка X вируса гепатита В, который распознается цитотоксическими Т-лимфоцитами, для проявления цитотоксичности против вируса гепатита В, причем его аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID No: 4: CLFKDWEEL.

5. Пептидный антиген, полученный из белка X вируса гепатита В, который распознается цитотоксическими Т-лимфоцитами, для проявления цитотоксичности против вируса гепатита В, причем его аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID No: 5: EIRLKVFVL.

6. рН-Чувствительная липосома, включающая пептидные антигены, предназначенная для индукции клеточного иммунитета против вируса гепатита В, которая получена в результате смешивания в молярном отношении от 5: 1 до 25: 1 фосфолипида и одного или нескольких пептидных антигенов по пп. 1-5.

7. рН-Чувствительная липосома по п. 6, где пептидный антиген выбирают из группы, состоящей из HLSLRGLFV, VLHKRTLGL, AMSTTDLEA, CLFKDWEEL и EIRLKVFVL.

8. рН-Чувствительная липосома по п. 6, где фосфолипид содержит 50% или более фосфатидилэтаноламин-пептидный антиген, полученый из белка х вируса гепатита b   (варианты), ph-чувствительная липосома для индукции   клеточного иммунитета против вируса гепатита b, патент № 2189989-олеоил-пептидный антиген, полученый из белка х вируса гепатита b   (варианты), ph-чувствительная липосома для индукции   клеточного иммунитета против вируса гепатита b, патент № 2189989-пальмитоила.

9. рН-Чувствительная липосома по п. 6, где фосфолипид получают, смешивая фосфатидилэтаноламин-пептидный антиген, полученый из белка х вируса гепатита b   (варианты), ph-чувствительная липосома для индукции   клеточного иммунитета против вируса гепатита b, патент № 2189989-олеоил-пептидный антиген, полученый из белка х вируса гепатита b   (варианты), ph-чувствительная липосома для индукции   клеточного иммунитета против вируса гепатита b, патент № 2189989-пальмитоил и холестерингемисукцинат в молярном отношении от 6: 4 до 8: 2.

10. рН-Чувствительная липосома по п. 9, где фосфолипид получают путем дополнительного включения до 1 мол. % монофосфориллипида А.

11. рН-Чувствительная липосома по п. 6, где фосфолипид получают, смешивая фосфатидилэтаноламин-пептидный антиген, полученый из белка х вируса гепатита b   (варианты), ph-чувствительная липосома для индукции   клеточного иммунитета против вируса гепатита b, патент № 2189989-олеоил-пептидный антиген, полученый из белка х вируса гепатита b   (варианты), ph-чувствительная липосома для индукции   клеточного иммунитета против вируса гепатита b, патент № 2189989-пальмитоил, фосфатидилэтаноламин и холестерингемисукцинат в молярном отношении от 3: 3: 4 до 4: 4: 2.

12. рН-Чувствительная липосома по п. 11, где фосфолипид получают путем дополнительного включения до 1 мол. % монофосфориллипида А.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к липосомам, содержащим новые пептидные антигены, которые принимают участие в регуляции иммунитета человека против вируса гепатита В ("HBV"), более конкретно к группам пептидов, соответствующих эпитопам антигенов, полученных из белка Х HBV, которые индуцируют цитотоксические Т-лимфоциты ("CTL") против вирусов, или иммунологической толерантности к вирусам, и рН-чувствительным липосомам, содержащим указанные группы пептидов, для индуцирования клеточного иммунитета таким образом, чтобы осуществлялась выработка CTL специфических в отношении этого вируса.

Описание уровня техники

Когда организм человека инфицирован HBV, в нем происходят различные физиологические реакции для удаления вируса. Среди этих реакций одна из наиболее важных состоит в разрушении и удалении инфицированных клеток, что, в конце концов, приводит к выздоровлению от вирусной инфекции. Разрушение инфицированных клеток осуществляется клетками другого типа, которые обладают цитотоксичностью, и которые носят название CTL. Для проявления цитотоксичности CTL должны прежде всего распознать некоторые пептиды, полученные из вторгшихся вирусных белков. Обычно вирусные белки синтезируются внутри инфицированных клеток, а затем они превращаются в короткие пептиды, содержащие от 8 до 15 аминокислот, в результате внутриклеточной деградации. Если некоторые из образовавшихся таким образом пептидов появляются на клеточной поверхности в объединенной форме с молекулой внутриклеточного главного комплекса гистосовместимости ("МНС"), CTL распознает их, чтобы разрушить инфицированные клетки. С другой стороны, МНС подразделены на класс I и класс II, и было известно, что МНС класса I играют более важную роль в индуцировании CTL по сравнению с CTL класса II. Однако сообщалось, что сайты белков (пептидов), распознаваемые CTL, ограничены только теми, которые содержат специфичные аминокислотные последовательности среди всех пептидов, которые образуются при разрушении вирусных белков (см.: Fremont, D. et al., Science, 257:919-926 (1992); Matsumura, M. et al., Science, 257:929-934 (1992)).

Соответственно выяснение аминокислотных последовательностей этих специфичных сайтов позволит химическим способом синтезировать и получить пептиды, соответствующие этим аминокислотным последовательностям, и такое использование этих пептидов позволит искусственным образом индуцировать CTL, специфически распознающие вирус гепатита в организме человека, или регулировать другие иммунные реакции, такие как иммуносупрессия, что приведет к эффективной профилактике и лечению заболеваний, вызываемых вирусом гепатита.

Зная это, многие исследователи предпринимали попытки найти аминокислотные последовательности пептидов, распознаваемых CTL, среди пептидов, образующихся в результате разрушения протеинов вируса гепатита. В результате было обнаружено несколько специфичных аминокислотных последовательностей, и ожидалось, что в дальнейшем будет обнаружено еще несколько последовательностей. Кроме того, чтобы использовать такие пептиды для профилактики и лечения связанных с гепатитом заболеваний, необходимо, чтобы одновременно использовалось как можно больше пептидов, и их эффективность могла бы меняться в зависимости от типа пептидов. Поэтому раскрытие аминокислотных последовательностей таких пептидов имеет очень важное значение.

Пептиды для профилактики и лечения гепатита В, достоверно распознаваемые CTL, происходят главным образом из белка S (поверхностного антигена) и белка С (ядерного) HBV. Однако о пептидах, полученных из белка X, одного из антигенных белков HBV, до сих пор не сообщалось, несмотря на то, что ряд исследований с использованием трансгенных мышей четко показал, что белок Х непосредственно связан с HBV-ассоциированной злокачественной опухолью печени (см: Hoyhne et al, EMBO J., 9:1137-1145 (1990); Kim et al., Nature, 351:317-320 (1991)).

С другой стороны, если фосфолипиды диспергированы в воде, полярные головные группы ориентируются к воде, а гидрофобные хвосты собираются за счет гидрофобных взаимодействий, спонтанно образуя сферические замкнутые двухслойные пузырьки, так называемые "липосомы". Такие липосомы широко используются в качестве носителей в системах доставки лекарств, а также в моделирующих исследованиях биологических мембран (см: Lee, J.w. and Kim, H., Arch. Biochem. Biophys., 297:354(1992); Hahn, K.H. and Kim, H., J. Biochem., 110: 635(1991); Yun, C. H. and Kim, H., J. Biochem., 105:406(1989); Kim, J. and Kim, H. , Biochemistry, 25:7867(1986); Kim, J. and Kim, H., 15 Korean Biochem. J., 18:403 (1985)).

Недавно сообщалось, что липосомы можно использовать в области иммунологии, что ускоряет исследования липосом в качестве носителей вакцин или адъювантов (см: Rooijen, N.V., Vaccine, 11:1170 (1993). Обычно, если липосомы вводят внутривенно, их легко захватывают макрофаги ("МО"), которые в большом количестве присутствуют в крови, что играет важную роль в процессинге липосомного антигена, а также в иммунологическом процессинге антигена.

Кроме того, недавно были разработаны способы индуцирования CTL реакции специфической в отношении некоторых белков или пептидов с использованием рН-чувствительных липосом (см.: Readdy, R. et al., J. Immunol. Methods, 141: 157(1991); Zhou, F. et al., J. Immnunol. Methods, 145:143(1991); Nair, S. et al. , J. Exp. Med., 175: 609(1992); Harding, C.V. et al., J. Immunol. 147: 2860(1991); Zhou, F. and Huang, L., Vaccine, 11:1139(1993)), и рН-чувствительные липосомы были широко использованы в качестве носителей и систем адъювантов белка или пептидного антигена для получения субъединичной вакцины. В этой связи авторы настоящего изобретения раскрыли способ получения рН-чувствительной липосомы, которая позволяет обеспечить селективный транспорт противобластомных лекарственных средств (см: Choi, M.J. et al., J. Biochem., 112:694 (1992)).

Сущность изобретения

В соответствии с настоящим изобретением предложен ряд пептидов, специфически распознаваемых CTL, среди пептидов, полученных из белка Х HBV. Предложены также рН-чувствительные липосомы, содержащие пептидные антигены, полученные из белка Х HBV. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что эти липосомы можно использовать для создания предполагаемых терапевтических агентов для профилактики и лечения HBV-связанных заболеваний за счет индуцирования клеточного иммунитета таким образом, чтобы могли вырабатываться CTL, специфичные в отношении пептидных антигенов HBV.

Поэтому основной целью изобретения является создание пептидных антигенов, полученных из белка Х HBV, которые могут распознаваться CTL и демонстрируют цитотоксичность в отношении вируса.

Другой целью изобретения является создание рН-чувствительных липосом, включающих указанные пептидные антигены, которые могут индуцировать клеточный иммунитет.

Краткое описание чертежей

Вышеуказанные и другие объекты и признаки настоящего изобретения станут более очевидны из следующего описания, приведенного вместе с сопровождающими чертежами, где:

Фиг. 1 представляет график, демонстрирующий изменение количества молекул МНС класса I, экспрессированных на поверхности Т2-клетки, что представлено как интенсивность флуоресценции. Фиг.2 представляет график, демонстрирующий цитотоксичность CTL в отношении Т2-клеток.

Фиг.3А представляет график, демонстрирующий образование опухолей у мышей nude, зараженных гепатоцеллюлярной карциномой человека.

Фиг. 3В представляет график, демонстрирующий регрессирование опухоли у мышей nude после лечения CTL, стимулированными пептидными антигенами, полученными из белка Х HBV.

Подробное описание изобретения

На основании открытия того факта, что пептиды, связывающиеся с молекулами МНС класса I, имеют специфичные аминокислотные последовательности, пептиды, обладающие потенциальными возможностями связывания с молекулами МНС класса I, были секвенированы в полных аминокислотных последовательностях белка Х HBV. То есть, так как пептиды, которые могут связываться с HLA-A2, человеческой молекулой МНС класса I, содержат лейцин, валин или изолейцин у С-концов и во втором положении с N-концов (см.: Matsumura, М. et al., Science, 257: 929-934 (1992)), аминокислотные последовательности, удовлетворяющие указанным условиям, были скринированы из полных аминокислотных последовательностей белка Х HBV, и пептиды, которые обладают потенциалом связывания с HLA-A2 молекулой, т.е. пептидные антигены, которые могут индуцировать ответ CTL за счет связывания с человеческой молекулой МНС класса I, были отобраны из пептидов, образующихся при деградации антигенного белка Х HBV, на основании трехмерной структуры, молекулы (см. таблицу 1 далее). Затем были химически синтезированы пептиды в соответствии с определенными таким образом аминокислотными последовательностями. Аминокислотные последовательности пептидов, полученных из HBV Х белка, т.е. Х3, Х4, Х5, Х6 и Х7, представлены далее в таблице 1.

Настоящее изобретение охватывает не только описанные выше пептиды, состоящие из 9 аминокислот, но также и пептиды, к которым добавлены от 1 до 5 аминокислот с N- или С-концов указанных пептидов, а также их функциональные эквиваленты. В настоящем изобретении термин "функциональные эквиваленты" используют для обозначения всех пептидов, замещенных 1 или 2 аминокислотами среди аминокислотных последовательностей указанных пептидов. Например, такие замещения включают такие комбинации, как Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; и Phe, Туr.

Для получения рН-чувствительных липосом, включающих пептидные антигены, полученные из белка X HBV, фосфатидилэтаноламин-пептидный антиген, полученый из белка х вируса гепатита b   (варианты), ph-чувствительная липосома для индукции   клеточного иммунитета против вируса гепатита b, патент № 2189989-олеоил-пептидный антиген, полученый из белка х вируса гепатита b   (варианты), ph-чувствительная липосома для индукции   клеточного иммунитета против вируса гепатита b, патент № 2189989-пальмитоил (POPE) и холестерингемисукцинат (СНОН) смешивают в молярном отношении от 6:4 до 8: 2, более предпочтительно 7: 3, или POPE, фосфатидилэтаноламин (РЕ) и СНОН смешивают в молярном отношении от 3:3:4 до 4:4:2, более предпочтительно 3,5: 3,5: 3, для получения в итоге тонкой мембраны фосфолипидов. Затем полученные таким образом липосомы добавляют к буферному раствору, содержащему указанные пептидные антигены, полученные из белка Х HBV. В этой связи липосомы, включающие пептидные антигены, полученные из белка Х HBV, приготавливают, смешивая 1 или более из типов пептидных антигенов с фосфолипидом в молярном отношении от 1:5 до 1:25, более предпочтительно 1:20. Кроме того, рН-чувствительные липосомы, полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут включать далее вплоть до 1 мольного % монофосфориллипида А в качестве фосфолипида.

Липосомы настоящего изобретения инкапсулируют пептидные антигены, индуцирующие CTL реакцию у человека, и рН-чувствительные липосомы, которые используются в качестве носителей пептидов, также могут индуцировать CTL реакцию, специфическую в отношении вируса, из которого получены инкапсулированные пептиды. Естественно, четко показано, что рН-чувствительные липосомы, включающие указанные пептиды, могут индуцировать клеточный иммунитет у человека.

При описании аминокислотных последовательностей пептидов настоящего изобретения используются следующие однобуквенные символы в соответствии со стандартами IUPAC-IUB:

Аминокислота - Символ

Аланин - А

Аргинин - R

Аспарагин - N

Аспарагиновая кислота - D

Цистеин - С

Глутамин - Q

Глутаминовая кислота - Е

Глицин - G

Гистидин - Н

Изолейцин - I

Лейцин - L

Лизин - К

Метионин - М

Фенилаланин - F

Пролин - Р

Серин - S

Треонин - Т

Триптофан - W

Тирозин - Y

Валин - V

Далее настоящее изобретение иллюстрируется примерами, которые не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения.

Пример 1. Определение пептидов, обладающих потенциалом связывания с молекулами МНС белка Х

Так как пептиды, которые могут связываться с HLA-A2, человеческой молекулой МРС класса I, содержат лейцин, валин или изолейцин с С-концов, и во втором положении от N-концов (см.: Matsumura, М. et al., Science, 257:929-934 (1992)), аминокислотные последовательности, удовлетворяющие указанным условиям, вначале скринируют из полных аминокислотных последовательностей белка Х HBV, и в итоге отбирают пептиды, обладающие потенциальными возможностями связывания с HLA-A2 молекулами, учитывая трехмерную структуру молекулы (см. таблицу 1). Затем осуществляют химический синтез пептидов известными специалистам способами на основании определенных таким образом аминокислотных последовательностей.

Пример 2. Синтез пептидов и определение их связывания с молекулами МНС

Семь различных пептидов, включая пептиды, указанные ранее в таблице 1, которые были получены из белка Х HBV, были синтезированы химическим способом и растворены в фосфатно-буферном растворе (здесь и далее именуемом "PBS"). Для исследования возможности связывания этих пептидов с молекулами МНС класса I, связанными с индуцированном CTL, каждый из пептидов добавляют к Т2 клеточной линии в концентрации 100, 64, 32, 16, 8, 2 и 1 мкг/мл соответственно и оставляют взаимодействовать при 37oС в течение 4 часов. Затем клетки промывают PBS для удаления непрореагировавших пептидов, добавляют ВВ7.2 антитело против HLA-2A.1, молекул МНС класса I, и оставляют реагировать при 4oС в течение 1 часа. Клетки снова промывают PBS, добавляют флуоресцинизотиоцианат (FITC), конъюгированный с антителом к мышиному иммуноглобулину, и реакции позволяют протекать при 4oС в течение 1 часа. Затем определяют флуоресценцию клеток с помощью флюороцитометра (FACScan, BECTON DICKINSON), и полученные результаты представлены на фиг.1 далее.

Как видно на фиг.1, было обнаружено 5 пептидов, таких как Х3, Х4, Х5, Х6 и Х7, которые успешно связываются с молекулами МНС класса I на поверхности Т2 клеток. Пептиды, использованные в этих экспериментах, охарактеризованы в таблице 2.

Клеточная линия Т2, используемая в этом примере, имеет нарушение в схеме внутриклеточного транспорта пептидов, и не позволяет осуществить правильное связывание молекулы МНС класса I с пептидом с образованием нестабильной молекулярной структуры, что приводит к низкой экспрессии молекул МНС во время культивирования при 37oС, нормальной температуре для роста. Однако, если клетки Т2 культивируют в среде, содержащей пептиды, которые могут связываться с молекулами МНС, эти пептиды связываются с молекулами МНС на поверхности Т2-клеток, повышая стабильность молекул МНС, что приводит к усилению экспрессии молекул МНС. Зная это, связывание специфических пептидов с молекулами МНС на поверхности Т2-клеток можно анализировать, определяя степень связывания ВВ7.2 антител с клеточной поверхностью.

Пример 3: Определение распознавания пептида CTL

Связывание определенного пептида с молекулой МНС не может доказать распознавание пептида CTL. Соответственно следующий эксперимент был проведен для исследования того, действительно ли пептиды, используемые для определения связывания с молекулами МНС в примере 2, распознаются CTL, которые могут распознавать HBV в организме человека.

То есть отбирают кровь, положительную в отношении анти-HBV антител (величина, полученная с помощью ELISA: 1,0 или более), у обычных доноров и центрифугируют для сбора клеток крови. Указанные пептиды добавляют в концентрации 10 мкг/мл к лейкоцитам, которые остались после удаления красных кровяных клеток (эритроцитов) из клеток крови, и инкубируют при 37oС в СO2 инкубаторе, в котором поддерживается концентрация 5% СO2. Через 2 суток культивирования 10 ед интерлейкина-2 добавляют к культуральной среде и клетки продолжают культивировать еще 3 суток. Затем клетки крови с одинаковыми МНС инактивируют митомицином С и добавляют к культуральной среде в качестве стимулирующих клеток. И пептиды, и интерлейкин-2 добавляют к среде, и клетки продолжают культивировать в течение 7 суток. Затем определяют, распознают ли клетки крови и разрушают ли Т2 клетки, содержащие определенный пептид на своей поверхности, полученные результаты представлены в таблице 3 и на фиг.2 соответственно.

Разрушение Т2-клеток культивируемыми клетками крови определяют следующим образом: 100 мкг/мл пептида добавляют к Т2 клеткам и оставляют реагировать при 37oС в течение 3 часов. Затем клетки тщательно промывают для удаления непрореагировавших пептидов, добавляют радиоактивный хромат натрия (Сr51) и оставляют реагировать при 37oС на 2 часа в СO2 инкубаторе. Затем их тщательно промывают RPMI средой для удаления непрореагировавшего хромата, смешивают с клетками крови, промытыми PBS, в определенном соотношении и оставляют реагировать при 37oС в течение 4 часов в СО2 инкубаторе. Полученную среду собирают и определяют интенсивность гамма лучей для определения цитотоксичности клеток крови в отношении Т2 клеток, т.е. клеток-мишеней. Как видно из таблицы 3, было обнаружено, что Х3, Х4, Х6, Х7 и Р5 распознаются культивируемыми клетками крови, причем Р5 представляет известный пептид, играющий роль позитивного контроля (см: Nayersina, R. Et al., J. Immunol., 150: 4659-4671 (1993)), что свидетельствует о пригодности экспериментальных методик, использованных в этом примере.

Пример 4: Получение рН-чувствительных липосом, содержащих пептидные антигены

Фосфолипид, содержащий РОРЕ/СНОН (7: 3 молярное отношение) или РОРЕ/РЕ/СНОН (3,5:3,5:3 молярное отношение) добавляют в стеклянный сосуд и растворяют в органическом растворителе. Затем сосуд заполняют газообразным азотом для образования липидной тонкой пленки в сосуде. Затем к липидной пленке добавляют буфер (рН 8,0), содержащий пептиды, которые должны быть инкапсулированы, для достаточного увлажнения, и интенсивно перемешивают для получения многослойных пузырьков ("MLV"), из которых получают маленькие однослойные пузырьки ("SUV") в результате обработки ультразвуком. Полученные таким образом SUV инкубируют при комнатной температуре в течение от 2 до 12 часов и быстрое замораживание SUV с помощью жидкого азота и медленное оттаивание при комнатной температуре повторяют 3-4 раза для получения липосом, включающих пептиды. Таким образом в итоге получают липосомы в результате смешивания пептидов и фосфолипидов в молярном отношении 1:20. В этой связи используемыми пептидами являются пептидные антигены, которые получают из белка Х HBV, и которые могут индуцировать CTL реакцию за счет связывания с молекулами МНС класса I (см. таблицу 1).

Физическую стабильность и рН-чувствительность полученных таким образом липосом исследуют следующим образом, что показало слабое разрушение липосом при обработке этанолом и очень малое уменьшение содержания липосом по сравнению с обычными рН-чувствительными липосомами:

(1) Определение физической стабильности

Физическую стабильность полученных таким образом липосом определяют, измеряя изменение мутности раствора при добавлении к нему этанола. Так как обработка этанолом разрушает липосомы, что приводит к уменьшению мутности, стабильность липосом определяют, измеряя изменение поглощения на 400 нм. В результате было обнаружено, что липосомы, содержащие пептиды настоящего изобретения, обладают более высокой физической стабильностью, нежели обычные рН-чувствительные липосомы.

(2) Определение рН-чувствительности

12,5 мМ динатриевой соли 8-аминонафталин-1,3,6-трисульфоновой кислоты (ANTS), 45 мМ параксилол-бис(пиридиний)бромида (DPX), 68 мМ NaCl и 10 мМ буферированного раствора HEPES (рН 8,0) инкапсулируют в липосомы, содержащие пептиды, a FNTA и DPX, которые оказались не инкапсулированы, удаляют, используя колонку Sephadex G-50 (1пептидный антиген, полученый из белка х вируса гепатита b   (варианты), ph-чувствительная липосома для индукции   клеточного иммунитета против вируса гепатита b, патент № 218998920 см) для сбора только липосомного раствора. Концентрацию фосфолипидов в липосомах определяют по методу Vaskovsky (см: Vaskovsky, V.E., Kostetsky, E.Y. and Vasendin, I.M., J. Chromatogr., 114:129 (1975)).

В этом эксперименте для определения рН-чувствительности интенсивность флуоресценции прошедшего через колонку липосомного раствора, принимают за "0% рассеяния", а интенсивность флуоресценции липосомного потока, разрушенного Triton X-100, принимают за "100% рассеяния". Концентрации липосом (по 30 мкМ) добавляют к 2 мл буферного раствора с соответствующими значениями рН (7,5, 6,9, 5,9, 5,4, 4,9 и 4,5), и оставляют выстаиваться при 37oС в течение 30 минут. Затем определяют рН-чувствительность, измеряя флуоресценцию. При этом флуоресценцию измеряют, используя возбуждающее излучение с длиной волны 360 нм и измеряя эмиссию на длине волны 545 нм с помощью спектрофлюориметра (FP-777, JASCJ, Japan).

В результате оказалось, что липосомы, которые содержат пептиды настоящего изобретения, демонстрируют меньшее уменьшение содержания липосом (примерно 20%) по сравнению с обычными рН-чувствительными липосомами, которые используют в качестве контроля (примерно 80%).

Пример 5: Индуцирование клеточного иммунитета рН-чувствительными липосомами, содержащими пептиды

Для определения того, могут ли рН-чувствительные липосомы в качестве носителя пептидов индуцировать CTL реакцию, специфическую в отношении вируса, из которого эти пептиды получены, получают рН-чувствительные липосомы, в которых инкапсулированы синтетические пептиды, и проводят исследования цитотоксичности серийным способом. Так как клеточный иммунитет пептидов, которые могут связывать HLA-А2, человеческие молекулы МНС класса I, должен быть исследован, используя организм человека, осуществляют косвенный эксперимент с использованием пептидов, полученных из белков HBV и HCV, которые могут связывать мышиные молекулы МНС класса I (см. таблицу 4). Для этого получают рН-чувствительные липосомы, включающие пептиды, используя композицию фосфолипидов, содержащую РОРЕ/СНОН (7:3 молярное отношение). Затем осуществляют иммунизацию мышей липосомами и определяют цитотоксичность Т-лимфоцитов после распознавания клеток-мишеней, меченных Cr51.

В случае HIV мышей штамма Balb/C иммунизуют рН-чувствительными липосомами, включающими R15K или Т26К, и через 4 недели после бустерной иммунизации иссекают селезенку и гомогенизируют в 2 мл клеточной культуральной среды RPMI, используя гомогенизатор. 2 мл полученного таким образом гомогената добавляют к 2 мл фиколла и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 30 минут. Т-лимфоциты, расположенные между фиколлом и клеточной культуральной средой, выделяют, добавляют к 15 мл клеточной культуральной среды RPMI-10, центрифугируют при 1000 об/мин и трижды промывают RPMI-10 средой. Т-лимфоциты разбавляют до клеточной концентрации 5 х 106/мл в 24-луночном планшете и иммунизированный пептидный антиген добавляют до конечной концентрации 2 мкМ. Затем клетки культивируют при 37oС в течение 3 дней в СO2 инкубаторе, содержащем 5% СО2, и используют в качестве эффекторных клеток. В случае HCV пятинедельных мышей штамма C57BL/6 иммунизируют липосомами, содержащими пептидный антиген D8L и Т-лимфоциты выделяют таким же образом, что и описан выше, и используют в качестве эффекторных клеток. С другой стороны, р815 клетки (АТСС TIB64) у которых МНС класса I такие же, что и у мышей Balb/C, используют в качестве клеток-мишеней в случае HIV, и RMA клетки (см.: Hosken, N.A. and Bevan, M.J., J.Exp. Med., 175:719 (1992)) или EL4 клетки (АТСС TIB39), у которых МНС класса I такие же, что и у мышей штамма C57BL/6, используют в качестве их клеток-мишеней в случае HCV.

100 мкМ иммунизованного пептида добавляют к соответствующим клеткам-мишеням, оставляют реагировать при 37oС в течение 16 часов и дважды промывают клеточной культуральной средой RPMI. Затем к клеткам добавляют радиоактивный хромат натрия (Сr51) и оставляют реагировать при 37oС в течение 2 часов в СO2 инкубаторе. После реакции клетки тщательно промывают клеточной культуральной средой RPMI для удаления непрореагировавшего хромата натрия, смешивают с эффекторными клетками, промытыми фосфатно-буферным раствором, в различных отношениях, представленных в таблице 5, и оставляют реагировать при 37oС в течение 4 часов в CO2 инкубаторе. Полученную среду собирают и измеряют интенсивность гамма-лучей для определения цитотоксичности эффекторных клеток в отношении клеток-мишеней (см. таблицу 5).

Как видно из таблицы 5, оказалось, что эффекторные клетки, выделенные из селезенок мышей, иммунизованных R15K, Т26К и D8L пептидными антигенами, могут распознавать и уничтожать клетки-мишени. Более того, было обнаружено, что если мышей иммунизировать пептидными антигенами, индуцирующими CTL реакцию, используя рН-чувствительные липосомы, можно индуцировать клеточный иммунитет, выражающийся в продукции CTL, специфичных в отношении вируса.

На непрямых экспериментах по индуцированию клеточного иммунитета, которые проводили с использованием рН-чувствительных липосом, содержащих пептиды, полученные из белков HIV и HCV, было четко показано, что: липосомы, содержащие пептидные антигены, полученные из белка Х HBV, могут индуцировать клеточный иммунитет, который, в свою очередь, индуцирует ответ CTL, так как пептидные антигены, полученные из белка Х HBV, могут индуцировать ответ CTL реакцию у человека (см. пример 3), и рН-чувствительные липосомы, содержащие эти пептиды, также могут индуцировать ответ CTL реакцию, специфическую в отношении вируса, из которого эти пептиды получены.

Пример 6: Уничтожение гепатоцеллюлярной карциномы человека НВх-специфичными Т-клетками

Уничтожение опухоли CTL, которые были стимулированы пептидными антигенами, полученными из белка Х HBV (т.е. пептидом НВх) исследуют следующим образом. Клетки гепатокарциномы человека подкожно вводят мышам nude штамма Ва1Ь/С в различном количестве клеток от 1пептидный антиген, полученый из белка х вируса гепатита b   (варианты), ph-чувствительная липосома для индукции   клеточного иммунитета против вируса гепатита b, патент № 2189989107 до 2пептидный антиген, полученый из белка х вируса гепатита b   (варианты), ph-чувствительная липосома для индукции   клеточного иммунитета против вируса гепатита b, патент № 2189989107, и на голых мышах проводят тест на образование опухоли. Через 3 суток опухоли уже можно определять, а через 5 суток адоптивно переносят CTL, стимулированные пептидом Нвх в хвостовую вену мышей, у которых образовались опухоли, в количестве 1,5х 108 клеток (см. фиг.3А). В результате показано, что размеры опухоли начинают уменьшаться на 2 сутки после обработки, и опухоли полностью исчезают после обработки (см фиг.3В). На фиг 3А и 3В значки (-пептидный антиген, полученый из белка х вируса гепатита b   (варианты), ph-чувствительная липосома для индукции   клеточного иммунитета против вируса гепатита b, патент № 2189989-) и пептидный антиген, полученый из белка х вируса гепатита b   (варианты), ph-чувствительная липосома для индукции   клеточного иммунитета против вируса гепатита b, патент № 2189989 представляют вводимые дозы 2пептидный антиген, полученый из белка х вируса гепатита b   (варианты), ph-чувствительная липосома для индукции   клеточного иммунитета против вируса гепатита b, патент № 2189989107 и 1пептидный антиген, полученый из белка х вируса гепатита b   (варианты), ph-чувствительная липосома для индукции   клеточного иммунитета против вируса гепатита b, патент № 2189989106 соответственно, а Т.Р. представляют моменты обработки CTL.

Как было четко проиллюстрировано выше, в настоящем изобретении предложены рН-чувствительные липосомы, которые включают группы пептидов, соответствующих эпитопам антигенов, полученных из белка Х HBV, которые индуцируют CTL против вируса или иммунологической толерантности к вирусу, таким образом, что можно индуцировать клеточный иммунитет против HBV. Так как пептидные антигены, полученные из белка Х а, такие как Х3, Х4, Х5, Х6 и Х7, активируют CTL, которые могут распознавать HBV антигены, присутствующие в организме человека, и также могут распознаваться CTL, указанные рН-чувствительные липосомы, включающие пептидные антигены, полученные из белка Х HBV, можно использовать для создания потенциальных терапевтических средств для профилактики и лечения HBV-ассоциированных заболеваний.

Список последовательностей приведен в конце описания.

Класс C07K14/02 Hepadnaviridae, например вирус гепатита B

способ получения рекомбинантного капсидного белка вируса гепатита е и рекомбинантная вакцина для профилактики вирусного гепатита е -  патент 2501809 (20.12.2013)
рекомбинантная вакцина для профилактики вирусного гепатита е у животных -  патент 2501568 (20.12.2013)
рекомбинантный штамм дрожжей hansenula polymorpha - продуцент капсидного белка вируса гепатита е -  патент 2493249 (20.09.2013)
гидрофобные, модифицированные, полученные из pres вируса гепатита в (hbv) пептиды и их использование в качестве ингибиторов проникновения hbv и hdv -  патент 2492182 (10.09.2013)
рекомбинантный вирусный вектор и система экспрессии в клетках растения гибридного белка, включающего внеклеточный домен белка м2 вируса гриппа, присоединенный к ядерному антигену вируса гепатита в -  патент 2460796 (10.09.2012)
получение вакцин, содержащих поверхностный антиген вируса гепатита в и поверхностно-активное вещество -  патент 2444374 (10.03.2012)
конъюгаты гаптен-носитель и их применение -  патент 2326693 (20.06.2008)
композиции на основе белка вируса гепатита в и стрессового белка и их применение -  патент 2295536 (20.03.2007)
мутантный штамм вируса гепатита в и его применение -  патент 2270863 (27.02.2006)
способ изготовления контрольной панели сывороток ay энд ad субтипов hbsag для контроля качества диагностики гепатита b -  патент 2265028 (27.11.2005)

Класс A61K38/08 пептиды, содержащие 5-11 аминокислот

применение пептида актг (4-7)-пгп гепатопротекторного воздействия -  патент 2528741 (20.09.2014)
циклический октапептид, радиофармацевтическое средство на его основе и способ применения радиофармацевтического средства для получения лекарственных (фармацевтических) средств для лечения новообразований, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы -  патент 2528414 (20.09.2014)
содежащий октреотид состав с замедленным высвобождением со стабильно высоким уровнем воздействия -  патент 2526822 (27.08.2014)
применение опиорфина в качестве психостимулирующего агента -  патент 2526819 (27.08.2014)
способ хирургического лечения острого панкреатита с ранним энтеральным интраоперационным питанием пациента -  патент 2526247 (20.08.2014)
способ лечения болезни альцгеймера -  патент 2526155 (20.08.2014)
новый пептид и его применение -  патент 2525913 (20.08.2014)
пептиды и их производные, взаимодействующие с никотиновым ацетилхолиновым рецептором и пригодные для использования в косметологии против мимических и возрастных морщин -  патент 2524428 (27.07.2014)
ингибиторы протеазы вируса гепатита с и их применение -  патент 2523790 (27.07.2014)
применение аналогов соматостатина при менингиоме -  патент 2523416 (20.07.2014)

Класс A61K9/127 липосомы

стабилизатор липосомальных суспензий и способ его получения -  патент 2529179 (27.09.2014)
носитель лекарственного средства, обеспечивающий контрастное усиление при мрт -  патент 2528104 (10.09.2014)
липосомы иринотекана или его солей, способ их получения -  патент 2526114 (20.08.2014)
композиция, содержащая везикулы, и способ ее получения -  патент 2517710 (27.05.2014)
липосомальная композиция и способ ее получения -  патент 2516893 (20.05.2014)
фармацевтическая композиция, содержащая фермент дезоксирибонуклеазу и/или рибонуклеазу и липосомы, для местного применения -  патент 2504361 (20.01.2014)
способ получения магниточувствительного липидного композита -  патент 2502505 (27.12.2013)
способ получения липосомально-иммунопероксидазного конъюгата -  патент 2500813 (10.12.2013)
новые термочувствительные липосомы, содержащие терапевтические агенты -  патент 2497499 (10.11.2013)
липосомальный фармацевтический препарат и способ его изготовления -  патент 2494729 (10.10.2013)

Класс A61K39/29 вирус гепатита

комбинированная вакцина, включающая антигены дифтерии, столбняка, ацеллюлярного коклюша, haemophilus influenzae и полиовируса, ее применение и способ производства -  патент 2526214 (20.08.2014)
вакцина на основе вирусоподобных частиц, содержащих все структурные антигены вируса гепатита с, и способ ее получения в дрожжах hansenula polymorpha -  патент 2510998 (10.04.2014)
вакцинная композиция, пригодная при инфекциях hpv и вирусом гепатита в, и способ ее получения -  патент 2509570 (20.03.2014)
способ получения рекомбинантного капсидного белка вируса гепатита е и рекомбинантная вакцина для профилактики вирусного гепатита е -  патент 2501809 (20.12.2013)
рекомбинантная вакцина для профилактики вирусного гепатита е у животных -  патент 2501568 (20.12.2013)
гидрофобные, модифицированные, полученные из pres вируса гепатита в (hbv) пептиды и их использование в качестве ингибиторов проникновения hbv и hdv -  патент 2492182 (10.09.2013)
композиция для лечения гепатита с и способ лечения гепатита с -  патент 2447899 (20.04.2012)
получение вакцин, содержащих поверхностный антиген вируса гепатита в и поверхностно-активное вещество -  патент 2444374 (10.03.2012)
иммуногенные композиции, способы получения таких композиций и плазмида, включенная в такие композиции -  патент 2442825 (20.02.2012)
иммуностимулирующая комбинация для профилактики и лечения гепатита с -  патент 2431499 (20.10.2011)
Наверх