способ получения диагностической паракоклюшной сыворотки к агглютиногену 14 для реакции агглютинации

Формула изобретения

1. Способ получения диагностической паракоклюшной сыворотки к агглютиногену 14 для реакции агглютинации, включающий адсорбцию гипериммунной сыворотки к паракоклюшному микробу живой культурой бронхисептикозного микроба с последующим отделением сыворотки, отличающийся тем, что гипериммунную сыворотку адсорбируют осадком микробных клеток, полученным из смеси двух штаммов бронхисептикозного микроба с разным набором агглютиногенов, при этом адсорбцию проводят путем гомогенизации, а готовую сыворотку лиофильно высушивают в ампулах.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для адсорбции используют штаммы B. bronchiseptica 214, и/или 899, и/или 5379.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, к способам получения диагностических агглютинтрующих сывороток, а именно сыворотки диагностической паракоклюшной к агглютиногену 14, адсорбированной, сухой для реакции агглютинации (РА), используемой для серологической идентификации бактерий Bordetella parapertussis.

Известен способ получения диагностической паракоклюшной сыворотки к агглютиногену 14 (М. С. Захарова, О.П. Панова-Стоянова "Специфические видовые антисыворотки для представителей рода Bordetella", ЖМЭИ, 1965, 6, с.60-64). Способ заключается в том, что производят подбор и культивирование штаммов для адсорбции антибактериальной гипериммунной сыворотки, в качестве которой используют ослиную гипериммунную сыворотку к паракоклюшному микробу (штамм 17903). Сыворотку последовательно адсорбируют суспензией живой культуры штамма В. bronchiseptica 899 и 7306 путем тщательного перемешивания смеси сыворотки и соответствующей культуры клеток в равных объемах и прогревания на водяной бане при температуре 37^oС в течение 4 часов с последующим отделением сыворотки центрифугированием. Полученную надосадочную жидкость используют в реакции агглютинации с соответствующими культурами для проверки полноты сорбции.

Недостатком известного способа является то, что адсорбцию проводят суспензией микробной культуры, в результате чего происходит разведение и снижение титра сыворотки. При этом гомогенизацию смеси на шуттель-аппарате не применяют, готовый продукт не подвергают лиофильному высушиванию.

В итоге получают жидкую сыворотку со сроком годности 1 год. Титр сыворотки в РА составляет 1:80.

Задачей изобретения является создание способа получения стандартной паракоклюшной сыворотки к агглютиногену 14 для реакции агглютинации, обладающей высокой специфичностью, более высоким титром и более длительным сроком годности.

Сущность изобретения состоит в том, что в способе получения диагностической паракоклюшной сыворотки к агглютиногену 14 для реакции агглютинации, включающем адсорбцию гипериммунной сыворотки к паракоклюшному микробу живой культурой бронхисептикозного микроба с последующим отделением сыворотки, гипериммунную сыворотку адсорбируют осадком микробных клеток, полученным из смеси двух штаммов бронхисептикозного микроба с разным набором агглютиногенов, при этом адсорбцию проводят путем гомогенизации, а готовую сыворотку лиофильно высушивают в ампулах.

Для адсорбции используют штаммы B.bronchiseptica 214, и/или 899, и/или 5376.

Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат.

Полученная сыворотка обладает высокой специфичностью, высоким титром в РА не ниже 1:25 на предметном стекле и 1:1280 - в PA на планшетах. Она являются стандартным сухим препаратом по 0,1 мл в ампуле с массой влаги не выше 3%. Срок годности увеличивается до 3 лет по сравнению с 1 годом срока годности для жидкой сыворотки.

Способ получения сыворотки более простой и менее трудоемкий. Технический результат достигается за счет того, что:

- проводят осаждение микробных клеток перед адсорбцией путем центрифугирования;

- применяют гомогенизацию смеси сыворотки и осадка микробной массы при проведении адсорбции;

- осуществляют адсорбцию меньшей дозой микробов;

- применяют высокоспецифичные гипериммунные ослиные или бараньи сыворотки с высоким титром;

- используют для адсорбции смесь двух штаммов бронхисептикозного микроба с разным набором агглютиногенов;

- применяют метод лиофильного высушивания готовой сыворотки.

Способ осуществляется следующим образом:

Для получения диагностической паракоклюшной сыворотки к агглютиногену 14 для реакции агглютинации используют гипериммунную сыворотку осла или барана к паракоклюшному микробу В. parapertussis (штамм 402 или 17903), а для адсорбции гетерологичных антител из сыворотки используют штаммы В. bronchiseptica с разным набором агглютиногенов - 214, 899, 5376. Адсорбцию проводят в один этап осадком смеси двух отобранных штаммов бронхисептикозного микроба.

Процесс начинают с восстановления отобранных лиофилизированных культур бронхисептикозных бактерий высевом на среду Борде-Жангу (БЖ) или казеиново-угольный агар (КУА) с добавлением 5% крови человека (генерация 1). Выращивание производят в термостате при температуре (361)^oС в течение 48 часов. При тех же условиях проводят второй пассаж и пересевают культуру в пробирки со средой КУА, выращивание осуществляют при тех же условиях в течение 24 часов, но не более 36 часов (генерация II). Выросшую культуру контролируют на чистоту и пересевают на матрацы со средой КУА. Выращивание производят в течение 26 часов при температуре (361)^oС. Выращенную микробную массу двух отобранных штаммов смывают 0,9% раствором натрия хлорида, рН 7,0-7,2, в одну емкость, полученную смесь центрифугируют в течение 3 часов при 3000 об/мин. Осадок микробных клеток используют для адсорбции сыворотки из расчета 5000 млрд. микробных клеток на 1 мл сыворотки, предварительно разведенной физиологическим раствором до титра 1:5000. Смесь гомогенизируют путем растирания в шуттель-аппарате в течение 4 часов при температуре (361)^oС, затем выдерживают в холодильнике в течение 18 часов при температуре (53)^oС. Суспензию центрифугируют в течение 3 часов при 3000 об/мин, сыворотку стерильно отделяют (сливают) и добавляют к ней консервант мертиолят из расчета 1:10000.

Сыворотку контролируют на стерильность (ГФ XI, вып.II, стр. 187), физические свойства (ГФ XI, вып. I, стр. 176). Она должна представлять собой прозрачную жидкость светло-желтого цвета, без осадка и признаков гемолиза.

Специфическую активность сыворотки определяют в реакции агглютинации на предметном стекле со штаммами паракоклюшного микроба 402 и 17903, содержащими агглютиноген 14. Полноту сорбции гетерологичных антител проверяют с набором штаммов коклюшных и бронхисептикозных микробов.

Сыворотка к агглютиногену 14 паракоклюшного микроба должна агглютинировать все культуры паракоклюшного микроба и не агглютинировать культуры коклюшных и бронхисептикозных микробов.

Готовую сыворотку в стерильных условиях разливают в ампулах по 0,1 мл и лиофильно высушивают. В результате получают стандартный высокоактивный препарат с титром в РА на стекле не ниже 1:25, в РА на планшетах - не ниже 1: 1280.

Пример.

При получении диагностической паракоклюшной сыворотки к агглютиногену 14 использовали гипериммунную сыворотку осла к штамму В. parapertussis 17903 с исходным титром в РА 1:102400, для адсорбции из которой гетерологичных антител использовали смесь двух штаммов бронхисептикозного микроба с разным набором агглютиногенов: 899 (8, 9, 10, 11, 12) и 5376 (8, 9, 12, 13). Провели культивирование отобранных для адсорбции штаммов. Выращенную микробную массу двух штаммов смыли 0,9% раствором натрия хлорида (рН 7,0) в одну емкость. Смесь подвергли центрифугированию в течение 3 часов при 3000 об/мин. Полученный осадок использовали для адсорбции сыворотки из расчета 5000 млрд. микробных клеток на 1 мл сыворотки, разведенной до титра 1:5000. Смесь гомогенизировали путем растирания в шуттель-аппарате в течение 4 часов при температуре 37^oС, затем выдержали в холодильнике в течение 18 часов при температуре 8^oС. Суспензию подвергли центрифугированию в течение 3 часов при 3000 об/мин, сыворотку стерильно слили и добавили к ней консервант мертиолят из расчета 1:10000.

Провели контроль готовой сыворотки на стерильность, физические свойства, определили специфическую активность и чистоту сорбции.

Получен стандартный, специфичный высокоактивный препарат с титром в РА на стекле 1:25, в РА на планшетах - 1:1280.