способ выделения пневмоцист

Формула изобретения

Способ выделения пневмоцист, включающий заражение животных, обработку ферментами, высокоскоростное центрифугирование, отличающийся тем, что легочную ткань зараженных минисвиней обрабатывают только трипсином и центрифугируют при 2000 об/мин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к паразитологии, и касается способов выделения очищенных пневмоцист (Pneumocystis carinii), которые могут быть использованы для приготовления диагностических тест-систем.

Известен способ выделения пневмоцист из легочной ткани зараженных крыс или мышей (1, 2).

Однако при этом способе выделение проводят на дорогостоящем оборудовании при 10000 об/мин с использованием импортных ферментов (коллагеназы, гиалуронидазы, ДНК-азы, РНК-азы) в течение 4-х часов.

Цель изобретения - удешевление способа, сокращение по времени процедуры обработки ферментом, повышение выхода целевого продукта.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что легочную ткань зараженных минисвиней обрабатывают трипсином и центрифугируют при 2000 об/мин.

Пример. Минисвиньям в возрасте от 1 до 1,5 месяцев, весом 1,5-2 кг вводят подкожно в область бедра ацетат кортизона (75-100 мл/кг массы) 2 раза в неделю в течение 2-х месяцев. На второй неделе с начала инъекций проводят интерназальное инфицирование испытуемых животных суспензией пневмоцист при концентрации 10⁶ цист/мл. Для предупреждения бактериальной инфекции в пищу добавляют тетрациклин из расчета 25 мг на 1 кг массы животного. Через 2 месяца минисвиней умерщвляют под эфирной анестезией, иссекают легкие и делают мазки-отпечатки. Окраску препарата осуществляют по методу Романовского-Гимза и оценивают в световом микроскопе при увеличении x 7000 (3).

Ткань легкого измельчают в стерильной чашке Петри, переносят в стерильную колбу с 25% трипсином (t 37^oС). Объем трипсина превышает легочную массу в 20 раз. Колбу помещают в термостат при (t 37^oС) на магнитную мешалку на 3-4 минуты. Затем отбирают жидкую суспензию, содержащую цисты и клетки легкого, и переносят в стерильный флакон, который ставят в холодильник (t +4^oС) для прекращения действия трипсина. Оставшиеся неразрушенные кусочки легких заливают трипсином и повторяют процедуру до полной трипсинизации легкого (5-7 раз). Все полученные пробы жидкой суспензии объединяют и фильтруют через стерильную воронку, покрытую 3-4 слоями стерильной марлевой салфетки, на поверхности которой остаются крупные конгломераты легочной ткани и слизи. Очищенный материал, содержащий цисты, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15-20 минут. Затем надосадочную жидкость удаляют, а к осадку пневмоцист добавляют 1-2 мл раствора Хенкса, ресуспендируют его и доводят до 10 мл раствором Хенкса и вновь центрифугируют при 2000 об/мин. Этот этап отмывки пневмоцист повторяют еще раз. Эта процедура переваривания легочной ткани трипсином занимает 2 часа. После чего полученный осадок ресуспендируют в 1-2 мл раствора Хенкса и готовят контрольный мазок на стекле, который высушивают на воздухе, фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимза или проводят иммунофлюоресцентную реакцию. В препарате должно быть не менее 300 цист в 10 полях зрения. Дальнейшая очистка и концентрация пневмоцист проводятся в градиенте плотности перколла.

Выход целевого продукта в 10 раз превышает выход цист, полученных известным способом.

Таким образом, использование в качестве фермента трипсина позволило удешевить способ выделения пневмоцист, повысить выход целевого продукта, сократить время процедуры до 2 часов и проводить центрифугирование материала при 2000 об/мин.

Литература

1. Kersfin E. Laboratory diagnosis and occurrence of Pn. Carinii//Seand: J. Infect. Diseases Suppe. 1994. Vol. 94. - p.1-34.

2. Walzer P., Powell R., Yoneda K. Experimental Pn. Carinii pneumonia in different stains of cortizonized mice //Infect. Immun., 1979. Vol. 24. - p. 939-947.

3. Васильева В. И. , Каражас Н. В., Плюхин Д.Ю., Савицкий И.Г. А.с. 1685991.