способ количественного определения рнк вируса гепатита с в сыворотке крови

Формула изобретения

Способ оценки количества РНК вируса гепатита С в сыворотке крови методом ПЦР с использованием внутреннего стандарта, отличающийся тем, что в качестве внутреннего стандарта использовали ретровирусные частицы, полученные на основе ретровирусного вектора рBabe, в сайт EcoRl которого вставили последовательность, содержащую модифицированный фрагмент кДНК вируса гепатита С (1100 н. п. ), имеющий вставку 628 н. п. в положении 340 н. п. (Крnl), после чего полученную ДНК-матрицу трансфектировали методом электропорации в мышиную пакующую линию PG13 и культивировали, затем в среде, содержащей пуромицин, отбирали клон, культивировали его, культуральную среду, содержащую РНК-матрицу, упакованную в вирусные частицы, собирали и использовали для вычисления титра вирусных частиц стандарта после инфицирования восприимчивых клеток-мишеней серийными разведениями вируса.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к методам определения количества вирусных геномов, присутствующих в образце крови. Нами разработан количественный стандарт для оценки количества геномов гепатита С в образце сыворотки крови больных.

Сегодня для количественной оценки содержания вирусных нуклеиновых кислот применяется конкурентный ПЦР с использованием стандарта. Внутренний стандарт ДНК или РНК амплидифицируется с теми же праймерами, что и ДНК- или РНК-мишень, но включает или делецию, или вставку, так что продукты, полученные при амплификации стандарта и мишени, отличаются. Изменяющиеся известные количества внутреннего стандарта добавляются к равным аликвотам образца, содержащим неизвестные количества мишени. Внутренний стандарт и мишень конкурируют в равной мере за связывание с праймерами и амплификацию в ПЦР. Эффективность аппликации в данном случае будет одинаковой для двух матриц. Равные количества продуктов будут амплифицированы в том случае, когда начальные концентрации матриц равны. Отношение наработанных в процессе ПЦР продуктов может быть определено экспериментально и эквивалентная точка может быть вычислена.

Самая удачная на наш взгляд модификация способа измерения количества вирусных нуклеиновых кислот с использованием в качестве внутреннего стандарта мутантных вирусов описана авторами Natarajan; Venkatachala, Germantown, MD Salzman; Norman P, Potomas, MD. Patent US 77661.

Способ, предложенный Natarajan; Venkatachala, Germantown, MD Salzman; Norman P, Potomas, MD.

Авторами предложен способ измерения вирусных нуклеиновых кислот в любом образце с использованием в качестве внутреннего контроля инфекционного мутантного вируса, который имеет последовательность-метку в районе генома, используемом для амплификации. Разведения этого вируса добавляются к равным аликвотам образца для измерения. Нуклеиновые кислоты выделяются, амплифицируются и определяются количественно. Этот способ позволяет избежать ошибок, возникающих при выделении нуклеиновых кислот.

В предлагаемом нами изобретении в отличие от прототипа внутренний стандарт сконструирован на основе ретровирусного вектора, в который клонирован модифицированный участок генома вируса гепатита С, используемый для амплификации, что дает нам следующие преимущества: наличие в векторе гена устойчивости к пуромицину позволяет определять титр вирусных частиц стандарта в экспериментах по инфицированию клеточных культур; препарат дефектного вируса, не способного к репликации, получают из культуры пакующих клеток, просто собирая среду культивирования, в которой росли клетки; получаемые вирусные частицы стандарта не патогенны для человека и животных.

Описание предлагаемого способа количественного определения РНК вируса гепатита С в сыворотках крови больных.

Конструирование внутреннего стандарта.

В ретровирусный вектор hBabe в сайт EcoRl вставлена последовательность, содержащая модифицированный фрагмент кДНК вируса гепатита С (1100 н.п.), используемый для амплификации в ПЦР с теми же праймерами, что и исходный фрагмент вируса гепатита С. Модифицированный фрагмент кДНК вируса гепатита С имеет вставку 628 н.п. в положении 340 н.р.(Крnl). Полученная конструкция (ДНК-матрица) была трансфектирована в мышиную пакующую линию PG 13 методом электропорации. Клеточная линия PG 13 культивировалась в среде DMEM с 10% FBS. После селекции на среде, содержащей 4 мкг/мл пуромицина, проводилось клонирование методом лимитирующих разведений и отобран клон. Культуральная сред этого клона, содержащая упакованную в вирусные частицы РНК-матрицу, была собрана, разлита по аликвотам, заморожена при -70^oС и использовалась для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР.

Праймеры.

Для проведения обратной транскрипции и ПЦР использовали праймеры (2):

SU1 5"(GTG CTT GCG AGT GC 3"

ASU1 5"(AGG GGTR TCG ATG AC 3"

SU2 5"(GGA GGT CTC GTA GAC CGT G 3"

AS1b 5"(GAG CCA TCC TGC CCA CCC CA 3"

AS2a 5"CCA AGA GGG ACG GGA FCC TC 3"

AS1a 5"(GGG ATA GGC TGA CGT CTA CC 3"

AS3a 5"(ACC GTT CAG AAG TTT TAC GC 3"

(G/A)=R

Выделение РНК

Сыворотки крови, содержащей вирус гепатита С, хранятся при -70^oС. Аликвоты (25 мкл) серийных разведений супернатанта были добавлены к 25 мкл сыворотки крови и лизированы 450 мкл раствора 5,5 М гуанидин изоциоцианат, 0,3 М натрий ацетат, об/об фенол, насыщенный 0,1 М Трис. РН 6,5Б транспортная РНК, 25 мкг/мл. РНК высаживалась добавлением равного объема изопропанола. После центрифугирования осадок отмывали 70% этанолом и растворяли в 25 мкл деионизованной воды.

Обратная транскрипция

Собирают рабочую смесь и инкубируют 1 час при 42^oС.

5 мкл раствора РНК

5 мкл 5RT буфер (250 mMTris, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂)

2,5 мкл 2 mM dNTR

2,5 мкл 1 мкМ праймер ASU1

2,5 мкл 50 mM DTT

5 ед. RNAsе ингибитор

10 ед. М-МLV обратная транскриптаза

деионизованная вода до 25 мкл.

ПЦР.

Готовят рабочую смесь для поставки двухэтапной полимеразной цепной реакции.

1 этап.

2,5 мкл 10буфер (100 mMTris, pH 8.3, 50 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 40% формамид

2,5 мкл 2 mM dNTR

2,5 мкл 1 мкМ праймер SU1, ASU1

5 ед. TAQ полимераза

деионизованная вода до 25 мкл.

1 этап реакции амплификации проводят в программируемом термостате при следующем температурном режиме:

94^oС - 30 с

42^oС - 60 с

72^oС - 45 с

25 циклов

2 этап.

2,5 мкл 10буфер (100 mMTris, pH 8.3, 50 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 40% формамид

2,5 мкл 2 mM dNTR

2,5 мкл 1 мкМ праймер SU2, AS1a, AS1b, AS2a, AS3a

5 ед. TAQ полимераза

деионизованная вода до 25 мкл.

2 этап реакции амплификации проводят в программируемом термостате при следующем температурном режиме:

94^oС - 30 с

58^oС - 60 с

72^oС - 45 с

25 циклов

Анализ ПЦР-продуктов проводился с помощью электрофореза в агарозном геле, содержащем бромистый этидий.

Определение титра вирусных частиц.

К преимуществам предлагаемого внутреннего стандарта относится возможность оценки титра вирусных частиц в супернатанте по количеству колоний, выросших после инфицирования клеточной культуры на селективной среде, так как ретровирусный вектор рBabe обеспечивает трансформированным клеткам устойчивость к пуромицину.

Ретровирусный препарат получают из культуры пакующих клеток просто собирая среду культивирования, в которой росли клетки. Клеточные обломки удаляют центрифугированием. Инфицированные клетки высвобождают вирусные частицы наиболее активно в экспоненциальной фазе роста. Максимальное содержание вируса в среде достигается на стадии, непосредственно предшествующей формированию слитного монослоя. Когда монослой сформировался на 80-90%, клетки помещают в свежую среду и инкубируют еще 12-24 часа, после чего собирают вирус.

Инфицирование клеток-мишеней.

1. Клетки высеваются в количестве 400000 на : см-чашки за один день до инфицирования. Количество чашей определяется числом предполагаемых разведений вирусного препарата.

2. Из чашек удаляется культуральная среда и заливается 2 мл свежей среды, содержащей определенное количество вируса и 8 мкг/мл полибрена.

3. Чашка помещается в инкубатор на 2 часа.

4. Из чашек удаляется среда, содержащая полибрен, и наливается 5 мл свежей среды. Клетки оставляются при 37^oС до рассева на 24 часа.

5. Клетки помещаются в среду, содержащую пуромицин.

6. После 7-10 дней селекции подсчитывают количество пуромицинустойчивых колоний, возникших в результате инфекции. Титр препарата определяют как количество колониеобразующих единиц в 1 мл вирусной суспензии.

Получаемый этим методом титр вирусных частиц в супернананте соответствовал 1000000/мл.

Пример определения количества РНК вируса гепатита С в сыворотке больного приведен на чертеже.

Продукты амплификации фрагмента РНК вируса гепатита С и внутреннего стандарта имеют размеры 315 н.п. и 943 н.п. соответственно. Дорожка 2: количества продуктов амплификации двух матриц равны (см. чертеж). Исходя из этого, количество РНК вируса гепатита С в сыворотке данного больного равно 20000 копий/мл.

Список литературы

1. Natarajan; Venkatachala, Germantown, MD Salzman, Norman P.Potomas, MD.

Internflly controlled virion nucleic acid amplification reaction for quantitation of virion nucleic acid. US Patent US 6077661 (2000).

2. Судариков А. Б. , Огрель О.Д., Способ выявления вируса гепатита С в сыворотке крови человека. Патент РФ 2150505 (2000).