способ определения биологической активности препаратов из ткани предстательной железы

Формула изобретения

1. Способ количественного определения биологической активности действующего вещества в различных лекарственных формах препаратов из ткани предстательной железы, отличающийся тем, что ее оценивают по концентрации тестостерона в сыворотке крови половозрелых мышей-самцов через 72 ч после однократного введения им тест-дозы препарата 25 мкг/мл общих пептидов в объеме 0,5 мл/мышь при параллельном введении контрольной группе стерильного изотонического раствора хлорида натрия в том же объеме, при этом биологически активным считают препарат, обеспечивающий увеличение концентрации тестостерона не менее чем в 4 раза по сравнению с контрольной группой.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрацию сывороточного тестостерона определяют методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для количественного определения биологической активности препаратов из ткани предстательной железы.

Известно, что цитомединовые препараты, в том числе полученные из ткани предстательной железы, представляют собой смесь до конца неизученных низкомолекулярных регуляторных пептидов и обладают полифункциональностью (1, 2).

Известно несколько методов определения той или иной биологической активности цитомединовых препаратов. В частности, неспецифическое иммуномодуляторное действие их оценивают по выраженности реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ), индуцированной фитогемагглютинином (ФГА) или липополисахаридом (ЛПС), а также по содержанию в лимфоцитах циклических нуклеотидов (3).

За рубежом для оценки биологической активности препаратов из предстательной железы обязательным является выходной контроль в тесте его влияния на сократимость гладкой мускулатуры подвздошной кишки морской свинки (4). Этот метод тестирования основан на способности препаратов из ткани предстательной железы оказывать тонизирующее действие на гладкую мускулатуру периферических вен, мочевого пузыря и предстательной железы (5), но требует постановки большого количества опытов (не менее 6 повторностей), из которых отбирают не менее 3 типичных килограмм (4).

Биологическая активность выпускаемых в нашей стране препаратов из ткани предстательной железы контролируется физико-химическим методом по реакции восстановления активности щелочной фосфатазы, ингибированной цистеином (6, 7), свойственное всем тканям, что не отражает специфики и потенциал их биологических свойств. Кроме того, он не может быть использован для суппозиториев, содержащих в основе желатин.

Все выше перечисленные методы контроля биологической активности трудоемки, требуют высокого профессионального уровня исполнителя - микробиолога и постановки большого количества опытов.

Задачей изобретения является разработка метода количественного определения биологической активности различных лекарственных форм препаратов из ткани предстательной железы, позволяющего за короткий промежуток времени по четко контролируемым параметрам получать достоверные результаты с высокой точностью и повторяемостью.

Основанием для разработки метода явилось известное положение, что простата - железа половой системы мужского организма, тесно связанная в своем развитии и функционировании с состоянием гормонообразования в системе гипофиз-половые железы, обладает широким спектром воздействия на клетки Лейдинга и кору надпочечников, продуцирующих тестостерон (8).

Сущность изобретения заключается в следующем. Биологическую активность препаратов из ткани предстательной железы оценивают по способности стимулировать выброс тестостерона, определение которого в сыворотке крови проводят через 72 часа после однократного введения половозрелым мышам-самцам одной тест дозы 25 мкг общих пептидов в объеме 0,5 мл при параллельном введении контрольной группе стерильного изотонического раствора хлорида натрия в том же объеме.

Результат может быть оценен различными известными методами количественного определения тестостерона, в частности методом иммуноферментного анализа (ИФА) при длине волны 405 нм с использованием коммерческих тест-систем.

Биологически активным считается препарат, введение которого в тест-дозе 25 мкг/мл общих пептидов в объеме 0,5 мл, стимулирует выброс тестостерона в сыворотку крови мышей-самцов, уровень которого должен превышать уровень гормона у контрольных животных не менее чем в 4 раза.

В отличие от известных методов предлагаемый способ определения биологической активности препаратов из ткани предстательной железы может быть использован для контроля полуфабрикатов и различных коммерческих лекарственных форм препарата. Он позволяет за короткий промежуток времени по четко инструментально контролируемым параметрам получать достоверные результаты. Применение коммерческих тест-систем и стандартного оборудования стандартизирует сам метод исследования.

Способ осуществляется следующим образом. Белым беспородным, достигшим половой зрелости, мышам-самцам массой 20-22 г внутрибрюшинно вводят однократно тест-дозу 25 мкг/мл общих пептидов в объеме 0,5 мл в виде жидкого очищенного экстракта, или ректальных суппозиториев или сухого инъекционного препарата. Контрольной группе вводят стерильный изотонический раствор хлорида натрия. Через 72 часа кровь забирают тотальным кровопусканием. Сыворотку отделяют от форменных элементов крови общепринятым методом (9).

Исследование содержания тестостерона в сыворотках крови проводят любым из доступных методов, например методом ИФА, с использованием отечественных или импортных коммерческих тест-систем при 405 нм.

Пример 1. Определение биологической активности жидкого экстракта-полуфабриката. В асептических условиях 3 мл полуфабриката, содержащего 5 мг/мл общих пептидов, помещают в стерильную стеклянную бутылку вместимостью 50 мл с (23,70,3) мл стерильного раствора натрия хлорида изотонического, получая исходное разведение 1:10, из которого стерильно готовят разведения препарата до содержания 25 мкг/мл общих пептидов. Мышам-самцам (не менее 5 голов в группе) вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл полученного раствора. Контрольной группе вводят стерильный изотонический раствор натрия хлорида в том же объеме. Через 72 часа у мышей каждой группы тотально забирают кровь (общий пул) в стерильные конические пробирки и отделяют сыворотку общепринятым методом (9).

Нативную сыворотку разливают по мелким аликвотам, замораживают и хранят при температуре минус 20^oС. Размороженную разведенную сыворотку хранят при температуре (62)^oС не более одних суток. Консервант не используют (8). Определение тестостерона проводят согласно Инструкции, прилагаемой к коммерческой тест-системе.

Биологически активным считают препарат, после введения которого в тест-дозе, не меньшей, чем 25 мкг/мл общих пептидов по 0,5 мл на мышь, содержание тестостерона в нативной сыворотке увеличивается в 4 и более раз по сравнению с контролем.

При необходимости повторения определения используют новую порцию замороженной нативной сыворотки.

Пример 2. Определение биологической активности суппозиториев. В асептических условиях 3 суппозитория помещают в стерильную стеклянную бутылку вместимостью 50 мл с (23,70,3) мл стерильного раствора натрия хлорида изотонического, закрывают резиновой пробкой и растворяют их при температуре (371)^oС (получают исходное разведение 1:10). Далее по примеру 1.

Пример 3. Определение биологической активности сухих препаратов из ткани предстательной железы. В асептических условиях стерильно вскрывают 3 ампулы с препаратом и растворяют содержимое ампул в 3 мл стерильного раствора натрия хлорида изотонического и переносят в стерильную стеклянную бутылку вместимостью 50 мл с (23,70,3) мл стерильного раствора натрия хлорида изотонического, закрывают резиновой пробкой и тщательно перемешивают полученный раствор встряхиванием, получая разведение исходного препарата 1:10. Далее по примеру 1.

В таблице представлены данные по исследованию биологической активности различных лекарственных форм препарата из ткани предстательной железы в тесте усиления выброса тестостерона.

Источники информации

1. Яковлев Г.М., Новиков B.C., Смирнов B.C., Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. "Механизмы биорегуляции". Санкт-Петербург, "Наука", 1992, с. 6-10.

2. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Роль клеточных медиаторов (цитомединов) в регуляции генетической активности. Сер. биологическая, 1985, 4, с. 339, 582.

3. Кузник Б.И., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Цитомедины и их роль в регуляции физиологических функций. Успехи современной биологии, 1995, вып. 3, т. 115, с. 355.

4. Robapharm LTD. CH/4006 Basle. Контроль качества. Нrо-Cf/900212/R. Т-8-242 00328 31.01.75. Продукция: Раверон в ампулах. Досье контрольной документации, с 5.

5. Хавинсон В. Х. , Серый С.В., Кожемякин А.Л., Валеев Р.И. Средство, обладающее тонизирующим действием на гладкую мускулатуру вен, мочевого пузыря и предстательной железы. Патент 2058780 6, А 61 К 35/42, 38/02 от 27.04.96.

6. Введение. ГФ X1, Москва, "Медицина", 1987 г., т. 1, с 221-251.

7. ВФС 42-2077-91 "Простатилен". С. 4-6.

8. Петровский Б.В. "БМЭ", М., изд. 3, с. 46.

9. А. С. Лабинская. "Микробиология с техникой микробиологических исследований". Изд. 4, Москва, "Медицина", 1978 г., с. 103-104.

10. Петровский Б.В. "БМЭ", М., изд. 3, с. 46.

11. 8. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзайтиев Б.Г., Гаврилова Е.М.. "Теория и практика иммуноферментного анализа", Москва, "Высшая школа", 1991, с. 281.