способ получения контрольной сыровотки для диагностики сифилиса

Формула изобретения

Способ получения контрольной сыворотки для диагностики сифилиса, включающий интратестикулярное заражение кроликов весом 3-3,5 кг патогенным штаммом Никольса, обескровливание животных, получение сыворотки, определение титров антител к кардиолипиновому и ультраозвученному трепонемному антигенам, отличающийся тем, что зараженных кроликов через 7-8 сут дополнительно внутривенно дважды иммунизируют КСТ-антигеном с интервалом 7-8 сут, при этом доза 1-й инъекции составляет 0,01293-0,01295 г, 2-й - 0,02303-0,02305 г, обескровливание животных осуществляют через 30 сут.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению диагностических препаратов, и может быть использовано в производстве диагностических сывороток для контроля РСК на сифилис.

Изобретением решается задача организации промышленного производства недорогой диагностической сыворотки для контроля результатов РСК на сифилис.

При сифилисе иммунитет существенно отличается по своему характеру от иммунитета при других заболеваниях. Перенесение болезни сопровождается выработкой двух видов антител: неспецифических (реагинов) и специфических (противотрепонемных). Реагины продуцируются всеми больными сифилисом, но не обладают защитным действием, они вступают в реакцию in vitro с кардиолипиновым антигеном, экстрагированным из мышц бычьего сердца. Специфические противотрепонемные антитела (JgG и JgM) вырабатываются под влиянием протеиновых антигенов, возбудителей сифилиса. Выздоровевшие могут вторично заразиться и заболеть. Иммунитет при сифилисе является инфекционным и характеризуется клеточными и гуморальными защитными реакциями, обуславливающими образование первичного шанкра, генерализацию инфекции с выработкой антител в крови больного. (К. Д. Пяткин, Ю.С. Кривошеин, Микобиология, М.: Медицина, 1980, с. 362).

В настоящее время сифилис приобрел эпидемическое распространение как в развитых, так и в развивающихся странах. Поэтому очень важна своевременная диагностика. Однако промышленный выпуск недорогих и эффективных диагностических препаратов налажен недостаточно.

Известен способ получения противосифилисной диагностической сыворотки, который включает интратестикулярное заражение кроликов патогенным штаммом Никольса, получение взвеси трепонем из больного яичка кролика через 7 суток после заражения с последующей перевивкой кроликам для производства сыворотки. (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М.О. Биргера. М.: Медицина, 1973, с. 303).

Этот способ дорогостоящий при промышленном производстве сывороток, так как требует большого количества животных для достаточного выхода продукции.

Известен способ получения диагностической сыворотки преимущественно против зоонозов, использование которого предлагается в биотехнологии. (Пат. РФ 2010577, А 61 К 39/40, 15.04.94, Бюл. 7). По этому способу животным - продуцентам предварительно внутримышечно вводят раствор адьюванта, в качестве которого используют феракрил. На 5-7 день в лимфатические узлы вводят антиген в смеси с адьювантом, через 3 дня такую же смесь вводят внутримышечно трехкратно с интервалом 4 дня. На 30-й день от животных берут пробы крови, получают иммунную сыворотку, добавляют в нее раствор антигена и полученный комплекс вводят четырехкратно с промежутками 3-4 дня внутривенно тому же животному, от которого получена сыворотка. На 7-8 день после инъекций животных обескровливают.

Использование этого способа позволяет получить высокоактивные иммунные сыворотки с достаточно высоким выходом продукции, однако процесс иммунизации животных длителен (2-3 - месяца) и сложен.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ получения контрольной сыворотки для диагностики сифилиса. (Фармакологическая статья "Сыворотка для диагностики сифилиса контрольная, положительная, сухая, для РСК", ФС 42-12ВС-91, утв. Фармакопейным комитетом Минздрава СССР 04.07.91 г. ).

Способ включает интратестикулярное заражение кроликов весом 3-3,5 кг патогенным штаммом Никольса, обескровливание животных, получение сыворотки, определение титров антител к кардиолипиновому и ультраозвученному трепонемному антигенам, стандартизацию, разливку, сушку препарата.

Этот способ по сравнению с известными обеспечивает получение сывороток для контроля результатов РСК на сифилис, однако он не эффективен для организации экономически целесообразного промышленного выпуска сывороток. Это обусловлено тем, что титры полученных антител к антигенам не превышают 1/10-1/15, и серийное производство сывороток требует большого количества животных-продуцентов.

Целью изобретения является возможность организации промышленного выпуска и снижение затрат на производство контрольных сывороток для диагностики сифилиса за счет увеличения титров антител иммунизированных животных к антигенам и соответственно уменьшения количества используемых животных-продуцентов.

Поставленная цель достигается тем, что кроликов весом 3-3,5 кг интратестикулярно заражают патогенным штаммом Никольса, через 7-8 суток после заражения животных дополнительно дважды с интервалом 7-8 суток иммунизируют внутривенно 0,0358-0,0360 г клеточных стенок трепонем ( КСТ-антиген), при этом доза 1-й инъекции составляет 0,01293-0,01295 г, 2-й - 0,02303-0,02305 г, затем после 30 суток после заражения животных обескровливают, получают сыворотку, определяют титры антител к кардиолипиновому и ультраозвученному трепонемному антигенам, стандартизируют, разливают и сушат готовый препарат.

КСТ-антиген - клеточные стенки трепонем штаммов 5, 7, 8, 9, Рейтера, выделенные из ультраозвученного дезинтеграта центрифугированием при 1, 10³ по известной методике.

(В. О. Пожарская. Получение некоторых клеточных структур культуральных бледных трепонем и изучение их антигенных свойств в РСК). Вестник дерматологии и венерологии, 9, 1985, с. 16-18.

В. О. Пожарская. Влияние способов дезинтеграции на антигенные свойства клеточных структур бледных трепонем. Вестник дерматологии и венерологии, 3, 1995, с. 14-15).

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Дополнительная иммунизация через 7-8 суток после заражения кроликов КСТ-антигеном, которая осуществляется дважды с интервалом 7-8 суток при дозах инъекции 0,01293-0,01295 г и 0,02303-0,02305 г, что приводит к активизации сифилисной инфекции кроликов и резкому повышению уровня сывороточных антител соответственно к специфическому трепонемному и неспецифическому кардиолипиновому антигенам, что и обеспечивает использование полученных сывороток как контрольных. Таким образом, КСТ-антиген является иммуностимулятором.

Если по прототипу титры антител к кардиолипиновому и ультраозвученному трепонемному антигенам составляют не более 1/19-1/15, по предлагаемому способу - 1/30-1/40.

По требованиям фармацевтических норм выпускаемые производственные сыворотки должны иметь титр 1/10. Таким образом, разбавление полученной по предлагаемому способу сыворотки до титра 1/10 обеспечивает увеличение объема готовой продукции с одного и того же количества животных-продуцентов в 2-4 раза, что значительно снижает производственные затраты.

Возможность практического использования предлагаемого способа подтверждается примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Кроликов-продуцентов весом 3-3,5 кг в количестве 80 животных интратестикулярно заражают патогенной бледной трепонемой штамма Никольса. 40 животных оставляют зараженными в качестве контрольных на 30 суток. Остальным 40 животным через 8 суток после заражения внутривенно вводят 0,01293 г КСТ-антигена, затем через 15 суток после заражения внутривенно вводят 0,02305 г КСТ-антигена. Через 30 суток после заражения контрольных и иммунизированных животных обескровливают, приготавливают сыворотку по известной методике и определяют титры антител к кардиолипиновому и ультраозвученному трепонемному антигенам в РСК.

Средние титры антител контрольных животных составили 1/15, дополнительно иммунизированных КСТ-антигеном - 1/40.

Затем сыворотку стандартизируют до титров 1/10, разливают и сушат.

Пример 2. Выполняют аналогично примеру 1, за исключением того, что 1-ю дополнительную иммунизацию подопытных животных проводят через 7 суток после заражения с дозой 0,01294 г, 2-ю - через 15 суток с дозой 0,02303 г.

Средние титры антител контрольных животных составили 1/15, дополнительно иммунизированных - 1/33.

Пример 3. Выполняют аналогично примеру 1, за исключением того, что 1-ю дополнительную иммунизацию подопытных животных проводят через 7 суток после заражения с дозой 0,01295 г, 2-ю - через 14 суток с дозой 0,02304 г.

Средние титры антител контрольных животных составили 1/15, дополнительно иммунизированных - 1/40.

Как показали эксперименты, проведение дополнительной иммунизации животных ранее, чем через 7 и 14 дней после заражения и позднее, чем через 8 и 16 дней после заражения не обеспечивает выраженной активизации сифилитического процесса, что не обеспечивает повышения титров антител.

Снижение дозы инъекций КСТ-антигена ниже заявленных пределов нежелательно, так как не происходит достаточная иммунизация и не обеспечиваются максимальные титры антител, увеличение же дозы инъекций выше заявленных пределов нецелесообразно, так как не происходит дальнейшее повышение титров антител.

Таким образом, изобретение реально осуществимо, его использование в биотехнологии обеспечит промышленное производство недорогих высокоспецифических контрольных сывороток для РСК, что позволит повысить эффективность контроля диагностики сифилиса.