система восстановления конфермента, набор для ферментативного определения концентрации анализируемого вещества и ферментативный способ определения концентрации анализируемого вещества

Формула изобретения

1. Система восстановления кофермента, используемая в реагенте для ферментативного определения концентрации анализируемого вещества в биологическом образце по степени окисления кофермента, состоящая из пары фермента и субстрата, выбранной так, чтобы обеспечить постоянное восстановление указанного кофермента на всем протяжении срока хранения указанного реагента.

2. Система восстановления кофермента по п. 1, отличающаяся тем, что указанное постоянное восстановление происходит со скоростью в интервале от 0,01 до 0,9 мЕОП/мин при температуре 18-25^oС.

3. Система восстановления кофермента по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанная система восстановления кофермента включает фермент и субстрат, причем указанный фермент обладает неполной специфичностью к указанному субстрату.

4. Система восстановления кофермента по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что указанная пара фермент/субстрат представляет собой глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу/D-глюкозу.

5. Система восстановления кофермента по п. 3 или 4, отличающаяся тем, что степень специфичности между указанным ферментом и указанным субстратом меньше 50% на эквимолярной основе.

6. Система восстановления кофермента по любому из пп. 3-5, отличающаяся тем, что степень специфичности между указанным ферментом и указанным субстратом меньше 10% на эквимолярной основе.

7. Система восстановления кофермента по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что указанное анализируемое вещество является трансаминазой.

8. Система восстановления кофермента по п. 7, отличающаяся тем, что указанная трансаминаза является аспартаттрансаминазой.

9. Система восстановления кофермента по п. 7, отличающаяся тем, что указанная трансаминаза является аланинтрансаминазой.

10. Система восстановления кофермента по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что указанное анализируемое вещество является мочевиной.

11. Система восстановления кофермента по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что указанное анализируемое вещество является аммиаком.

12. Набор для ферментативного определения концентрации анализируемого вещества в биологическом образце по степени окисления кофермента, состоящий из системы восстановления кофермента, по любому одному из пп. 1-11 и других реагентов, необходимых для определения, причем указанная система и другие реагенты находятся в одном флаконе на всем протяжении срока хранения данного набора.

13. Набор по п. 12, отличающийся тем, что указанное постоянное восстановление происходит со скоростью в интервале от 0,01 до 0,9 мЕОП/мин при температуре 18-25^oС.

14. Набор по п. 12 или 13, отличающийся тем, что указанная система восстановления кофермента состоит из фермента и субстрата, причем указанный фермент обладает неполной специфичностью к указанному субстрату.

15. Набор по любому из пп. 12-14, отличающийся тем, что указанная пара фермент/субстрат представляет собой глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу/D-глюкозу.

16. Набор по п. 14 или 15, отличающийся тем, что степень специфичности между указанным ферментом и указанным субстратом меньше 50% на эквимолярной основе.

17. Набор по любому из пп. 14-16, отличающийся тем, что степень специфичности между указанным ферментом и указанным субстратом меньше 10% на эквимолярной основе.

18. Набор по любому из пп. 12-17, отличающийся тем, что указанное анализируемое вещество является трансаминазой.

19. Набор по любому из пп. 12-17, отличающийся тем, что указанная трансаминаза является аспартаттрансаминазой.

20. Набор по любому из пп. 12-17, отличающийся тем, что указанная трансаминаза является аланинтрансаминазой.

21. Набор по любому из пп. 12-17, отличающийся тем, что указанное анализируемое вещество является мочевиной.

22. Набор по любому из пп. 12-17, отличающийся тем, что указанное анализируемое вещество является аммиаком.

23. Ферментативный способ определения концентрации анализируемого вещества в биологическом образце по степени восстановления кофермента, используя набор по любому из пп. 12-22.

24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что постоянное восстановление указанного кофермента происходит со скоростью в интервале от 0,01 до 0,9 мЕОП/мин при температуре 18-25^oС.

25. Способ по п. 23 или 24, отличающийся тем, что указанная система восстановления кофермента включает фермент и субстрат, причем указанный фермент обладает неполной специфичностью к указанному субстрату.

26. Способ по любому из пп. 23-25, отличающийся тем, что указанная пара фермент/субстрат представляет собой глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу/D-глюкозу.

27. Способ по п. 25 или 26, отличающийся тем, что степень специфичности между указанным ферментом и указанным субстратом меньше 50% на эквимолярной основе.

28. Способ по любому из пп. 25-27, отличающийся тем, что степень специфичности между указанным ферментом и указанным субстратом меньше 10% на эквимолярной основе.

29. Способ по любому из пп. 23-28, отличающийся тем, что указанное анализируемое вещество является трансаминазой.

30. Способ по любому из пп. 23-28, отличающийся тем, что указанное анализируемое вещество является аспартаттрансаминазой.

31. Способ по любому из пп. 23-28, отличающийся тем, что указанное анализируемое вещество является аланинтрансаминазой.

32. Способ по любому из пп. 23-28, отличающийся тем, что указанное анализируемое вещество является мочевиной.

33. Способ по любому из пп. 23-28, отличающийся тем, что указанное анализируемое вещество является аммиаком.

Описание изобретения к патенту

Данное изобретение относится к реагентам для ферментативного определения концентрации анализируемых веществ в пробах биологических жидкостей. В частности, данное изобретение относится к реагентам для количественного определения окисленного кофермента, содержание которого в прореагировавшей пробе соответствует концентрации анализируемого вещества в исходной пробе. Это изобретение относится также к усовершенствованным методам определения концентрации анализируемого вещества.

С помощью реагентов согласно изобретению можно определять концентрации таких веществ, как трансаминазы, аммиак, мочевина, лактатдегидрогеназа, триглицериды и салицилат.

Аспартатаминотрансфераза является ферментом, который в больших количествах присутствует в сердце, печени, эритроцитах и скелетных мышцах. Этот фермент катализирует следующую реакцию



Установлено, что содержание аспартатаминотрансферазы в сыворотке увеличивается в случае многих заболеваний печени, связанных с разрушением клеток печени, например, при гепатите. Концентрация этого фермента увеличивается также после инфаркта миокарда и при мышечных заболеваниях.

Такой фермент, как аланинаминотрансфераза, также обнаружен в больших концентрациях в печени и в меньшей степени в сердце, почках и скелетных мышцах. Он катализирует следующую реакцию



Установлено, что концентрация этого фермента в сыворотке увеличивается в случае заболеваний печени, в частности при гепатите.

Непрямое количественное определение ферментов, в частности трансаминаз, аспартатаминотрансферазы и аланинамино-трансферазы, в пробах биологических жидкостей заключается в установлении различия между контрольной пробой и пробой анализируемого вещества, соответствующий фермент которого был подвергнут ферментативному превращению.

Для ферментативного превращения анализируемого вещества субстрат, используемый для количественного определения представляющего интерес фермента, подвергают воздействию субстратспецифического фермента (трансаминазы). Изменения, произошедшие в реакционной смеси по сравнению с контрольной пробой, можно определить при помощи разных методов, которые применяют для измерения оптической плотности веществ. Изменение оптической плотности непосредственно связано с количеством трансаминазы, присутствующей в пробе.

Хотя традиционные методы, такие как колориметрическое определение, можно считать вполне приемлемыми, установлено, что ферментативный анализ является гораздо точным, надежным и простым по сравнению с другими методами, когда его используют для определения содержания трансаминазы.

Обычно используемым методом количественного определения трансаминаз в пробе является кинетическое определение посредством сопряженной ферментативной реакции.

В случае определения аспартатаминотрансферазы (AST) оксалоацетат, образующийся под действием этого фермента, превращается в малат под действием малатдегидрогеназы (MDH), включаемой в реагент. Этот процесс сопровождается окислением кофермента, такого как никотинамидадениндинуклеотид (NADH в NAD⁺), которое можно определить спектрофотометрическим путем при длине волны 340 нм. Таким образом, имеет место следующая последовательность реакций







Третья реакция необходима для устранения пирувата, который может присутствовать в больших количествах в пробах субъектов. Использование в большом количестве такого фермента, как лактатдегидрогеназа (LDH), можно теоретически обосновать следующим образом: если в пробе биологической жидкости субъекта присутствует большое количество пирувата, то благодаря высокой концентрации лактатдегидрогеназы в реагенте под действием NADH и LDH он быстро превращается в лактат и не мешает ходу реакции. Необходимость введения в реагент лактатдегидрогеназы с целью устранения указанной побочной реакции может повлиять на стабильность реагента из-за увеличения загрязняющих примесей.

В случае определения аланинаминотрансферазы (ALT) пируват, образующийся под действием этого фермента, превращается в лактат под действием лактатдегидрогеназы, включаемой в реакционную смесь. Этот процесс сопровождается окислением кофер-мента NADH в NAD⁺, которое можно также определить спектрофотометрическим путем при длине волны 340 нм. Таким образом, при использовании этого реагента имеет место следующая последовательность реакций







Теоретическое обоснование и методика измерения аланинаминотрансферазы аналогичны определению аспартатаминотрансферазы за исключением того, что в случае определения аланинаминотрансферазы необходим лишь один эндогенный фермент, а именно лактатдегидрогеназа (в отличие от определения аспартатаминотрансферазы, когда необходимо использовать лактатдегидрогеназу и малатдегидрогеназу). В этом случае реагенты для определения аланинаминотрансферазы содержат гораздо меньше загрязняющих примесей, что, как правило, означает увеличение срока их хранения по сравнению с реагентами для определения аспартатаминотрансферазы.

Для обоих реагентов скорость образования NAD⁺ соответствует концентрации трансаминазы, присутствующей в исходной пробе.

Мочевина является основным азотсодержащим продуктом караболизма белка, который образуется в печени гепатитными ферментами и выводится, главным образом, через почки. Повышенное содержание мочевины в сыворотке может быть следствием плохого функционирования почек, заболевания печени, изменения режима питания, застойной сердечной недостаточности, диабета и инфекционных болезней.

Концентрацию мочевины в сыворотке и моче человека можно определить прямыми и косвенными методами. Прямыми методами обычно являются модификации реакции Фирона. В этой реакционной системе диацетил взаимодействует с мочевиной с образованием хромогенного диазина, концентрацию которого можно измерить спектрофотометрическим путем, исходя из его наибольшей оптической плотности при длине волны 540 нм. Наиболее распространенный метод измерения мочевины в сыворотке и моче человека предполагает применение сопряженной ферментативной реакционной системы непрямого типа. Уреазу, первый фермент в реакционной системе, используют для превращения мочевины в ионы аммония и бикарбоната. Глутаматдегидрогеназа (GLDH), второй фермент в этой реакционной системе, обеспечивает взаимодействие NADH и ионов аммония с образованием NAD⁺ и глутамата. В ходе этой реакции происходит превращение NADH в NAD⁺, которое контролируют спектрофотометрическим путем при длине волны 340 нм. Альтернативно, можно произвести количественное определение ионов аммония посредством потенциометрии или измерения электропроводимости.

Таким образом, для определения концентрации мочевины используют следующую последовательность реакций





По мере превращения NADH в NAD⁺ измеряют уменьшение оптической плотности при длине волны 340 нм, которое пропорционально концентрации мочевины в исходной пробе.

Аммиак в основном циркулирует в желудочно-кишечном тракте. В процессе обмена веществ аммиак преобразуется в печени, где он превращается в мочевину в соответствии с циклом Кребса-Генселейта. Повышенная концентрация аммиака в сыворотке человека чаще всего связана с прогрессирующим заболеванием печени. Гипераммониемия оказывает токсическое действие на центральную нервную систему.

Концентрацию аммиака в сыворотке человека обычно измеряют при помощи прямого одностадийного ферментативного метода с использованием глутаматдегидрогеназы. В ходе этой реакции происходит превращение аммиака, -кетоглутарата и NADH (или NADPH) в глутамат и NAD⁺ (или NADP⁺), которое измеряют спектрофотометрическим путем при длине волны 340 нм.

Концентрацию аммиака в пробе обычно определяют с помощью следующей реакции



По мере превращения NSDPH в NADP⁺ измеряют уменьшение оптической плотности при длине волны 340 нм, которое пропорционально концентрации аммиака в пробе биологической жидкости субъекта.

Как указывалось выше, реагенты для определения трансаминазы характеризуются плохой стабильностью. Эти реагенты, особенно если все их компоненты соединяют в одном флаконе, обычно сохраняют стабильность максимум в течение одного месяца при хранении в холодильнике. Причиной такой нестабильности может быть разрушение эндогенных ингредиентов в этих реагентах, а также нестабильность NADH в растворе. Основные причины нестабильности NADH в растворе непосредственно связаны с присутствием эндогенных ферментов, в частности лактатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы в реагенте для определения аспартатаминотрансферазы и лактатдегидрогеназы в реагенте для определения аланинаминотрансферазы. Выпускаемые промышленностью препараты эндогенных ферментов MDH и LDH независимо от того, имеют они животное или бактериальное происхождение, содержат загрязняющие примеси, которые, в конечном счете, влияют на стабильность никотинамидадениндинуклеотида (NADH), а следовательно, и на стабильность реагентов. Этими загрязняющими примесями обычно являются AST и ALT, содержащиеся в небольших количествах и представляющие собой ферменты, для определения концентрации которых и выполняют измерение, а также NADH-оксидаза, которые все вместе вызывают окисление NADH в реагенте.

Показатель рН реагента может также влиять на стабильность NADH, так как NADH быстро разлагается в растворе, особенно в кислой среде. Большинство реагентов для определения трансаминазы имеет рН в интервале от 7,3 до 8,0. Чем более щелочным является реагент, тем выше стабильность NADH в растворе.

Реагенты для определения аммиака и мочевины также характеризуются плохой стабильностью; они сохраняют стабильность при хранении в одном флаконе в холодильнике в течение максимум одного месяца в случае аммиака и двух месяцев в случае мочевины. Причиной такой нестабильности является разрушение эндогенных ингредиентов в реагентах, нестабильность NADH или NADPH в растворе и загрязнение аммиаком, присутствующим в воде, используемой для восстановления порошкообразного реагента.

Основные причины нестабильности NADH или NADPH в растворе непосредственно связаны с присутствием в реагенте эндогенных ферментов. Показатель рН реагента может также влиять на нестабильность NADH или NADPH, так как NADH и NADPH быстро разрушаются в растворе, особенно в кислой среде.

В реагентах для определения аммиака обычно используют никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADPH) (который предпочтителен по сравнению с NADH), чтобы устранить интерференцию эндогенной лактатдегидрогеназы в сыворотке субъекта. Эндогенная лактатдегидрогеназа и пируват, содержащиеся в пробе субъекта, взаимодействуют с NADH в соответствии со следующей реакцией



На стабильность NADPH в растворе влияет также наличие загрязняющих примесей в выпускаемых промышленностью препаратах глутаматдегидрогеназы, которые вызывают окисление NADPH в реагенте для определения аммиака. Загрязняющие примеси, присутствующие в выпускаемых промышленностью препаратах уреазы и глутаматдегидрогеназы, точно также вызывают окисление NADH в реагенте для определения мочевины.

Одним из способов устранения трудностей, связанных с нестабильностью NADH и NADPH в растворе, является восстановление кофермента в реагенте непосредственно перед его применением.

Один такой метод описан в заявке на патент Австралии AU-A-61906/90, поданной на имя Ф.Хофмана Ла Роше АГ (F.Hoffmann La Roche AG), который предназначен для использования аналогичных ферментативных систем с целью измерения концентрации бикарбоната и аммиака в сыворотке. В описании этого изобретения указывается, что восстановленный кофермент получают in situ одновременно или перед повторным окислением кофермента анализируемым веществом, субстратом или специфическими ферментами. Это достигается путем включения в реакционную смесь фермента и ферментного субстрата, восстанавливающих окисленный кофермент. Ф. Хофман Ла Роше АГ описывает и подтверждает примерами следующую реакцию, осуществляемую для достижения указанного результата



Эта реакция позволяет получить восстановленный никотинаминаденозиндинуклеотид.

В случае такого восстановления NADH возникает проблема, связанная с невозможностью получения стабильного реагента в одном флаконе.

Ф. Хофман Ла Роше АГ смог до некоторой степени устранить эту проблему, получив систему реагентов в двух флаконах. Для количественного определения аммиака первый реагент содержит NADP⁺ и G-6-P, и второй реагент содержит -кетоглутарат, G6PDH и GLDH. При этом процедуру определения анализируемого вещества выполняют следующим образом



где (А) и (В) обозначают альтернативные эквивалентные способы выполнения этого метода.

Однако трудности остаются и при использовании этой системы реагентов. Даже если не принимать во внимание тот факт, что в этом случае нужны два флакона с реагентами, что увеличивает их стоимость, инвентары и отходы, необходимо также очень точно дозировать глюкозо-6-фосфат, и, кроме того, применение этой системы ограничено конкретными химическими анализаторами. Сразу после объединения реагентов начинается образование NADH из NAD⁺ за счет расходования глюкозо-6-фосфата. Поскольку содержание глюкозо-6-фосфата уменьшается, это сильно влияет на стабильность полученного реагента, если два реагента не были сразу же использованы после их объединения. Если концентрация глюкозо-6-фосфата будет неточной или избыточной, время выдерживания реагента приобретает критическое значение. В результате этого могут быть получены ложные результаты изменения оптической плотности, а следовательно, и совершенно неточные результаты анализа.

Ранее предложенный метод измерения концентрации анализируемого вещества, описанный в патенте США 4394449, на имя Модровича, предлагает использование пары субстрата и фермента, предназначенной для восстановления кофермента, как это происходит в растворе Роше; однако в этом случае глюкозо-6-фосфат получают из глюкозы в соответствии со следующей реакцией



NAD⁺ затем взаимодействует с образовавшимся глюкозо-6-фосфатом в присутствии такого фермента, как глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, с образованием NADH. Кроме того, Модрович включает в композицию как NADH, так и NAD⁺ с тем, чтобы, когда NADH окисляется или разрушается, NAD⁺, присутствующий в реагенте, способствовал восстановлению NADH. Этот реагент также следует хранить в двух флаконах.

Другой альтернативный метод был предложен Клоузом и др. в патенте США 4019961. Это изобретение основано на применении нескольких отдельных стадий реакции и ферментативной системы восстановления NADH. Недостатком этой системы является недостаточная надежность при выполнении нескольких стадий реакции и отделения полученного продукта, что делает этот анализ достаточно трудоемким. Кроме того, эта система реагентов подходит только для субстратов, которые могут быть фосфорилированы.

Общей проблемой, связанной с механизмом восстановления NADH и NADPH, наличие которой отмечалось во всех указанных выше изобретениях, то есть



является то, что невозможно выполнить одностадийную реакцию с использованием реагента в одном флаконе, так как сразу же после добавления сыворотки субъекта к реагенту одновременно происходят две реакции:

a) уменьшение оптической плотности вследствие превращения NADH (или NADPH) в NAD⁺ (NADP⁺);

b) образование NADH (NADPH) из NAD⁺ (NADP⁺), что ведет к увеличению оптической плотности.

Эти две реакции происходят с одинаковыми скоростями, следствием чего является ошибочно медленное изменение оптической плотности и получение совершенно неточных результатов.

Поэтому целью настоящего изобретения является создание системы реагентов для определения концентрации анализируемого вещества в сыворотке, которая позволяет устранить проблемы, присущие ранее известным системам реагентов, используемым для ферментативного анализа уровней анализируемого вещества в сыворотке на основе окисления кофермента, в частности такие проблемы, которые связаны с эндогенным или экзогенным загрязнением реагента. Другой целью данного изобретения является создание усовершенствованного способа определения концентрации анализируемого вещества в пробе биологической жидкости субъекта, который позволяет преодолеть недостатки, характерные для известных способов, в том числе преждевременное окисление коферментного определителя и необходимость хранения системы в нескольких флаконах, чтобы свести до минимума разрушение реагента.

Таким образом объектом настоящего изобретения является реагент для ферментативного определения концентрации анализируемого вещества в пробе биологической жидкости субъекта путем измерения степени окисления кофермента, отличающийся тем, что указанный реагент стабилизирован против окисления при помощи системы восстановления кофермента, состоящей из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечивать постоянное восстановление указанного кофермента на протяжении всего срока хранения данного реагента.

Предложен также реагент для ферментативного определения концентрации трансаминазы в пробе биологической жидкости субъекта путем измерения степени окисления кофермента, отличающийся тем, что указанный реагент стабилизирован против окисления при помощи системы восстановления кофермента, состоящей из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечить постоянное восстановление указанного кофермента на протяжении всего срока хранения данного реагента.

Предложен также реагент для ферментативного определения концентрации аспартатаминотрансаминазы в пробе биологической жидкости субъекта путем измерения степени окисления кофермента, отличающийся тем, что указанный реагент стабилизирован против окисления при помощи системы восстановления кофермента, состоящей из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечить постоянное восстановление указанного кофермента на протяжении всего срока хранения данного реагента.

Изобретение также относится к реагенту для ферментативного определения концентрации аланинаминотрансферазы в пробе биологической жидкости субъекта путем измерения степени окисления кофермента, отличающийся тем, что указанный реагент стабилизирован против окисления при помощи системы восстановления кофермента, состоящей из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечить постоянное восстановление указанного кофермента на протяжении всего срока хранения данного реагента.

Изобретение также относится к реагенту для ферментативного определения концентрации мочевины в пробе биологической жидкости субъекта путем измерения степени окисления кофермента, отличающийся тем, что указанный реагент стабилизирован против окисления при помощи системы восстановления кофермента, состоящей из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечить постоянное восстановление указанного кофермента на протяжении всего срока хранения данного реагента.

Предложен также реагент для ферментативного определения концентрации аммиака в пробе биологической жидкости субъекта путем измерения степени окисления кофермента, отличающийся тем, что указанный реагент стабилизирован против окисления при помощи системы восстановления кофермента, состоящей из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечить постоянное восстановление указанного кофермента на протяжении всего срока хранения данного реагента.

Система восстановления кофермента предпочтительно состоит из фермента и субстрата, причем указанный фермент обладает неполной специфичностью к указанному субстрату, что снижает перекрестную реактивность.

Этот реагент предпочтительно находится в одном флаконе.

В описании изобретения термин "неполная специфичность" используется в отношении пары фермента и субстрата, в которой выбранный субстрат не является природным субстратом выбранного фермента, поэтому перекрестная специфичность для фермента составляет менее 100%.

В основе этого изобретения лежит открытие того, что при объединении фермента и субстрата с неполной специфичностью в отношении друг друга значительно замедляется скорость восстановления кофермента. Вследствие замедления реакции восстановления основные компоненты реагента можно хранить в одном флаконе, при этом его содержимое стабилизировано против загрязнения благодаря постоянному медленному восстановлению кофермента. В связи с замедлением этого процесса восстановление NADH или NADPH не влияет на точность измерения анализируемых веществ. Восстановление может происходить и в неиспользуемом реагенте, при этом скорость восстановления можно точно регулировать, целенаправленно выбирая пару фермента и субстрата и их количества.

Альтернативным вариантом осуществления данного изобретения предусматривается реагент для ферментативного определения концентрации анализируемого вещества в пробе биологической жидкости субъекта путем измерения степени окисления кофермента, отличающийся тем, что указанный реагент стабилизирован против окисления при помощи системы восстановления кофермента, состоящей из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечить восстановление указанного кофермента со скоростью 0,01-0,9 мЕОП/мин при длине волны 340 нм.

Скорость восстановления реагента по данному изобретению предпочтительно равна 0,05-0,4 мЕОП/мин, наиболее предпочтительно 0,05-0,25 мЕОП/мин при комнатной температуре (18-25^oС) и длине волны 340 нм.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения степень специфичности между субстратом и ферментом в системе восстановления кофермента предпочтительно меньше 100%, более предпочтительно меньше 50% и наиболее предпочтительно меньше 10% на эквимолярной основе. Оптимальной является пара фермента и субстрата с перекрестной реактивностью менее 5% на эквимолярной основе.

Коферментами, предпочтительно используемыми в реагенте по данному изобретению, являются восстановленный никотинамидадениндинуклеотид (NADH) и восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADPH), хотя приемлемы также такие аналоги, как никотинамидгипоксантиндинуклеотидфосфат или тио-NADH.

Установлено, что реагенты согласно изобретению обладают дополнительным преимуществом, в частности, при измерении концентрации аммиака и мочевины. Содержание NADH и/или NADPH снижается в реагентах для определения мочевины и аммиака в присутствии загрязняющего аммиака, который попадает вместе с водой, используемой для восстановления порошкообразных реагентов. Аммиак, содержащийся в воздухе, который растворяется в жидких реагентах для определения мочевины и аммиака, с течением времени снижает уровни NADH и/или NADPH. Присутствие загрязняющего аммиака в реагентах для определения аммиака и мочевины не только вызывает неточное определение концентраций мочевины и аммиака, но и инициирует реакцию с -кетоглутаратом и NADH в присутствии глутаматдегидрогеназы до добавления проб. Это снижает уровни NADH или NADPH и ведет к возникновению ошибок при определении концентраций аммиака и мочевины в пробах. Однако настоящее изобретение позволяет удалить загрязняющий аммиак и восстановить NADH или NADPH, что обеспечивает точное определение концентраций аммиака и мочевины в пробах субъектов.

Ферментами, предпочтительно используемыми в системе восстановления кофермента для определения содержания трансаминазы в пробе сыворотки, являются глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (G-6-P-DH) или глюкозодегидрогеназа.

Ферментами, предпочтительно используемыми в системе восстановления кофермента для определения содержания мочевины или аммиака в пробе сыворотки, являются глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (G-6-P-DH) или глюкозодегидрогеназа.

Кроме того, приемлемы такие ферменты, как формиатдегидрогеназа, глицеролдегидрогеназа, лейциндегидрогеназа, L-аланин-дегидрогеназа, 3-гидроксистероиддегидрогеназа, L-лактатдегидрогеназа (полученная из Lactobacillus sp.) или глицерол-3-фосфатдегидрогеназа. Предпочтительным ферментом, используемым в реагентах для определения трансаминазы, аммиака и мочевины, является глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа. Этот фермент можно получить из любых приемлемых видов бактерий, таких как Leuconostoc mesenteroides, Bacillus stearothermophilus, Zymomonas mobilus, или дрожжей.

Такие ферменты предпочтительно получают из бактерий. Установлено, что введение в реагент ферментов бактериального происхождения сводит до минимума эндогенные загрязняющие примеси, такие как NADH-оксидаза и протеазы, которые ранее сильно влияли на стабильность реагентов. Дополнительным преимуществом бактериальных ферментов являются их более высокая термостойкость, которая продлевает стабильность реагента в растворе.

Более предпочтительным источником глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы является Leuconostoc Mesenteroides. При использовании глюкозо-6-фосфата, полученного из Bacillus Stearothermophilus или Zymomonas Mobilus, замедляется скорость реакции. Аналогичным образом, при использовании глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, полученной из дрожжей, вместо NADH можно использовать кофермент NADPH, так как дрожжевая глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа специфична только к NADP⁺. Количество глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в реагентах согласно изобретению может быть различным в зависимости от требуемой скорости восстановления. Однако в реагенте для определения аспартатаминотрансферазы это количество предпочтительно должно составлять около 2000 ед/д, чтобы продлить время хранения в растворе. В реагенте для определения аланинаминотрансферазы концентрация этого фермента равна 2000 ед/д. Предпочтительная концентрация в реагенте для определения мочевины составляет 2000 ед/л и предпочтительная концентрация в реагенте для определения аммиака равна 35000 ед/л.

С учетом того, что субстрат и фермент необходимо выбирать так, чтобы в системе восстановления кофермента они обладали неполной специфичностью в отношении друг друга, приемлемыми субстратами для использования в реагенте согласно изобретению являются рибозо-5-фосфат, глюкозо-1-фосфат, 6-фосфоглюконовая кислота, 2-дезоксиглюкозо-6-фосфат, 2-дезокси-2-фторглюкозо-6-фосфат, 2-дезокси-2-хлорглюкозо-6-фосфат, 2-дезокси-2,2-дифторглюкозо-6-фосфат, 2-О-метилглюкозо-6-фосфат, маннозо-6-фосфат, глюкозамин-6-фосфат, 3-дезокси-глюкозо-6-фосфат, 3-дезокси-3-фторглюкозо-6-фосфат, 3-О-метилглюкозо-6-фосфат, аллозо-6-фосфат, арозо-6-фосфат, 4-дезокси-4-фторглюкозо-6-фосфат, галактозо-6-фосфат, 5-тиоглюкозо-6-фосфат, аналоги фосфоната, глюкозо-6-сталлат, -D-глюкоза, D-галактоза, 2-дезоксиглюкоза, арабиноза, ксилоза, 1-сорбоза, D-манноза, D-фруктоза, D-лактоза, D-сорбит, D-маннит, сахароза, инозит, мальтоза.

При использовании в реагенте NADH в качестве предпочтительного кофермента предпочтительной парой фермента и субстрата является глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (G-6-P-DH) и D-глюкоза. Предпочтительными альтернативными субстратами для D-глюкозы являются такие субстраты, для которых при специфичности между глюкозо-6-фосфатом (G-6-P) и G-6-P-DH скорость реакции между ферментом G-6-P-DH и выбранным субстратом меньше 50%, более предпочтительно меньше 10% и наиболее предпочтительно меньше 5%. Кроме того, с учетом требуемой скорости восстановления наиболее подходящее содержание D-глюкозы в реагентах по настоящему изобретению, а следовательно, и наиболее предпочтительное, составляет около 100 ммоль/л, хотя можно использовать до 1000 ммоль/л. Проблема растворимости D-глюкозы в реагенте возникает при более высокой концентрации.

При использовании предпочтительной комбинации из D-глюкозы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в нее можно ввести ионы фосфата калия в виде двухосновного фосфата калия. Содержание ионов фосфата зависит от требуемой скорости восстановления. Однако, когда концентрация D-глюкозы равна примерно 100 ммоль/л (но может быть от 10 до 200 ммоль/л) и количество глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы составляет около 2000 ед/л (но может быть от 500 до 3500 ед/л), приемлемое содержание ионов фосфата может быть от 2,0 ммоль/л до 20 ммоль/л. Повышение концентрации ионов фосфата увеличивает скорость восстановления. Ионы фосфата предпочтительно добавляют в количестве около 10 ммоль/л для определения аспартатаминотрансферазы и около 5 ммоль/л для определения аланинаминотрансферазы. В реагенте для определения мочевины предпочтительная концентрация ионов фосфата составляет около 5 ммоль, и в реагенте для определения аммиака концентрация указанных ионов также равна около 5 ммоль.

При использовании предпочтительной комбинации из D-глюкозы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы или в любой системе, в которой не образуется свободный фосфат, в реагент нужно ввести свободные ионы фосфата. В частности свободные ионы фосфата необходимы для образования нерассматриваемого комплекса с D-глюкозой для инициации восстановления в присутствии глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

Вместо комбинации из D-глюкозы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы можно использовать глюкозодегидрогеназу (GLD), которая катализирует следующую реакцию, где D-глюкоза является 100% реагирующим субстратом



Если в качестве фермента используется глюкозодегидрогеназа, предпочтительными субстратами для восстановления кофермента NAD и относительными значениями перекрестной реактивности по сравнению D-глюкозой являются:

Субстрат - Относительная активность, %

Ксилоза - 8,9

L-сорбоза - 0,3

D-манноза - 2,4

D-фруктоза - 0,8

D-галактоза - 0,1

D-лактоза - 1,2

D-сорбит - 0,1

Инозит - 0,2

Мальтоза - 3,9

где процентные значения обозначают скорость реакции по сравнению с глюкозодегидрогеназой в присутствии ее природного субстрата 1-D-глюкозы.

Альтернативно, при использовании в качестве фермента глицеролдегидрогеназы (GLY.DH) приемлемыми субстратами при осуществлении реакции



и значениями их активности (%) по сравнению с глицеролом (100%) являются

Субстрат - Относительная активность

Глицерол--монохлоргидрин - 48,5

Этиленгликоль - 7,8

2,3-Бутандиол - 52,6

В тех случаях, когда в качестве фермента в нижеследующей реакции используют лейциндегидрогеназу (L.D)



приемлемыми субстратами и значениями их относительной активности (%) по сравнению с L-лейцином (100%) являются

Субстрат - Относительная активность

L-валин - 74

L-изолейцин - 58

L-норвалин - 41

L-норлейцин - 10

L-метионин - 0,6

L-цистеин - 0,3

Если в реакционной системе, аналогичной той, в которой используют лейциндегидрогеназу, в качестве фермента служит L-аланиндегидрогеназа (A.D), приемлемым субстратом и значением его относительной активности (%) по сравнению с L-аланином (100%) является

Субстрат - Относительная активность

L-серин - 5

3-Гидроксистероиддегидрогеназу (H. DH) можно также использовать в качестве фермента в сочетании с перечисленными ниже субстратами. Здесь также указаны значения их относительной активности (%) по сравнению с холевой кислотой.

Субстрат - Относительная активность

Литохолевая кислота - 96

Этиохолевая кислота - 60

Если в следующей реакции в качестве фермента используется L-лактатдегидрогеназа (LDH), полученная из Lactobacillus sp.

приемлемыми субстратами и значениями их относительной активности (%) по сравнению с L-лактатом являются:

Субстрат - Относительная активность

2-Оксоглутарат - 0,09

Оксолоацетат - 96

Если NADP⁺ является коферментом, полученным, например, из дрожжей, предпочтительные комбинации субстрата и фермента включают, %:

G-6-P-DH / галактозо-6-фосфат - 25

G-6-P-DH / 2-дезоксиглюкозо-6-фосфат - 18

G-6-P-DH / глюкозамин-6-фосфат - 2

Процентные значения, указанные справа, означают относительную реактивность по сравнению с реактивностью пары G-6-P-DH / G-6-P.

Кроме того, NADP⁺ можно использовать в качестве кофермента для такой пары фермента и субстрата, как глицерол-3-фос-фатдегидрогеназа и дигидроксиацетонфосфат.

Как указывалось в вводной части описания изобретения, реагент для определения концентрации аспартатаминотрансферазы в сыворотке должен содержать лактатдегидрогеназу, восстановленный никотинамидадениндинуклеотид (NADH), малатдегидрогеназу (MDH), аспартат и 2-оксоклутарат. При определении аланинаминотрансферазы малатдегидрогеназа не нужна, а вместо аспартата следует использовать L-аланин. Реагент для определения мочевины должен содержать уреазу и -кетоглутарат, а реагент для определения аммиака должен также включать -кетоглутарат.

Аспартат можно использовать в виде разных солей, таких как натриевые и калиевые соли. Предпочтительной солью согласно изобретению является калиевая соль, так как она лучше растворяется и менее гидратирована, чем натриевая соль. В реагентах по данному изобретению концентрация этого компонента составляет 180-240 ммоль/л. Наиболее предпочтительна конечная концентрация около 200 ммоль/л, причем следует отметить, что именно такая концентрация рекомендована Международной федерацией химиотерапии (МФХ).

Концентрация 2-оксоглутарата, которая предпочтительна для реагентов согласно изобретению, составляет около 1-15 ммоль/л, однако известно, что высокие концентрации этого субстрата могут ограничивать количество NADH, добавляемого в композицию, так как 2-оксоглутарат поглощают свет при длине волны 340 нм, перекрывая оптическую плотность NADH. Если ограничить количество 2-оксоглутарата, добавляемого в композицию, этот реагент можно без каких-либо затруднений использовать в большинстве спектральных анализаторов. Предпочтительная концентрация этого субстрата в реагентах для определения аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы составляет около 12 ммоль/л, что также соответствует уровню, рекомендованному МФХ. В реагентах для определения мочевины и аммиака предпочтительная концентрация составляет около 7,5 ммоль/л.

Количество аланина в реагенте для определения аланинаминотрансферазы определяется до некоторой степени растворимостью этого компонента. В частности, предпочтительная концентрация равна 200-500 ммоль/л, хотя при более высокой концентрации не наблюдается значительного увеличения каталитической активности. Наиболее предпочтительная концентрация этого субстрата равна около 400 ммоль/л, что связано с растворимостью этого вещества.

Уровень кофермента в реагенте может изменяться в зависимости от следующих факторов:

линейность результатов, требуемая при выполнении измерения;

выбранная длина волны;

соотношение между объемом пробы и реагента;

фотометрическая система выбранного анализатора.

Как правило, увеличение объема пробы улучшает чувствительность, но уменьшает линейность получаемых показаний, поэтому уменьшение объема пробы улучшает линейность за счет снижения чувствительности.

Предпочтительная длина волны для выполнения изменений равна 320-400 нм, однако содержание используемого кофермента необходимо отрегулировать так, чтобы оптическая плотность предпочтительно не превышала 2,0 ЕОП. Предпочтительная длина волны поглощения согласно изобретению равна 340 нм.

Малатдегидрогеназу предпочтительно получают из бактерий, чтобы сократить вероятность эндрогенного загрязнения, а также потому, что такая малатдегидрогеназа отличается более высокой термостойкостью. Предпочтительные уровни этого фермента составляют 150-1500 ед/л, более предпочтительно 200-800 ед/л. Наиболее предпочтительное содержание согласно изобретению равно около 250 ед/л.

В реагенте для определения аспартатаминотрансферазы лактатдегидрогеназа участвует в процессе удаления эндогенного пирувата, содержащегося в пробе. Лактатдегидрогеназу предпочтительно вводят в реагент для определения аспартатаминотрансферазы по данному изобретению в таком количестве, чтобы 1,0 ммоль/л пирувата в пробе можно было удалить в течение 1 минуты при соотношении между объемом пробы и реагента 1:10. Этот уровень приблизительно равен 2000 ед/л.

В реагенте для определения аланинаминотрансферазы лактатдегидрогеназа участвует в двух реакциях: (i) сопряженная ферментативная реакция для измерения аланинаминотрансферазы и (ii) удаление эндогенного пирувата в пробе. Реагент для определения аспартатаминотрансферазы должен содержать лактатдегидрогеназу в таком количестве, чтобы в течение 1 минуты можно было удалить 1,0 ммоль/л пирувата в пробе. Через 1 минуту можно производить измерение без интерференции со стороны эндогенного пирувата в пробе. Установлено, что минимальный уровень лактатдегидрогеназы, необходимый для удаления эндогенного пирувата, равен примерно 1500 ед/л. Предпочтительное количество этого компонента, вводимого в реагент для определения аланинаминотрансферазы согласно изобретению, равно примерно 2000 ед/л.

В реагенте для определения мочевины минимальная активность уреазы при рН 8,5, используемой в качестве не ограничивающего скорость реакции фермента в кинетическом режиме анализа, в количественном отношении равна примерно 5000 ед/л. В реагент можно вводить большие количества этого компонента для более длительного сохранения его стабильности.

Предпочтительный режим измерения анализируемого вещества в реагентах для определения мочевины и аммиака определяется кинетическими принципами. Поскольку глутаматдегидрогеназа (GLDH) является в этом препарате ферментом, ограничивающим скорость реакции, то уровень активности глутаматдегидрогеназы, входящей в состав реагента, имеет критическое значение для линейности анализа. Уровень активности глутаматдегидрогеназы может изменяться в зависимости от рН системы реагентов. Приемлемая активность глутаматдегидрогеназы находится в пределах 250-10000 eд/л. Наиболее предпочтительные ферменты имеют бактериальное происхождение, так как выпускаемые промышленностью препараты, содержащие глутаматдегидрогеназу животного происхождения, обычно менее стабильны и содержат большее количество NADH-оксидазы в качестве загрязняющей примеси. Предпочтительная активность глутаматдегидрогеназы в реагенте для определения мочевины при рН 8,50 составляет около 500 ед/л, а в реагенте для определения аммиака при рН 8,50 она равна около 8500 ед/л.

Реагенты согласно изобретению помимо системы восстановления кофермента могут содержать другие важные субстраты и ферменты, необходимые для определения концентрации анализируемого вещества, консерванты, хелатообразователи, ингибиторы протеазы, буферы, коферменты, антибактериальные вещества и другие компоненты, которые увеличивают стабильность, но не влияют на характеристики реагента по данному изобретению.

Основным критерием выбора буфера является то, что он должен обладать хорошей буферной емкостью при выбранном значении рН и минимальным связыванием двухвалентного катиона. Показатель рН и буферную систему реагентов для определения аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы выбирают в соответствии с рекомендациями Международной федерации химиотерапии (МФХ) для измерения концентраций трансаминаз. Общее эмпирическое правило заключается в том, что буфер считается эффективным в том случае, если показатель рКа равен выбранному значению рН1,0. Предпочтительное значение рН реагента по данному изобретению равно 7-9. В случае определения аспартатаминотрансаминазы оптимальная каталитическая активность имеет место при рН 7,0-8,2 и температуре 30^oС. Наиболее предпочтительное значение рН реагента для определения аспартатаминотрансферазы равно примерно 8,10,1 при температуре 20^oС, так как при этом значении рН NADH сохраняет стабильность. В случае реагента для определения аланинаминотрансферазы максимальная каталитическая активность имеет место при рН в интервале от около 7,3 до 7,9 при температуре 20^oС. Наиболее предпочтительное значение рН реагента для определения аланинаминотрансферазы равно примерно 7,7 при температуре 20^oС. При этих предпочтительных значениях рН достигается компромисс между оптимальной активностью фермента и стабильностью ферментов и коферментов в растворе. Более низкий показатель рН может усилить разрушение кофермента.

Предпочтительной буферной системой реагента для определения мочевины является трис-буфер при рН 8,50, хотя интервал значений рН 7,5-9,5 можно также считать приемлемым. Предпочтительная концентрация трис-буфера для достижения эффективной буферной емкости равна 100 ммоль, хотя можно использовать 20-200 ммоль. В этой системе реагентов можно использовать целый ряд других буферов, которые обеспечивают эффективную буферную емкость в интервале значений рН 7,5-9,5.

Предпочтительной буферной системой реагента для определения аммиака является трис-буфер при рН 8,5-9,0, хотя интервал значений рН 7,5-9,5 можно также считать приемлемым. Предпочтительная концентрация буфера для достижения эффективной буферной емкости равна 100 ммоль, хотя можно использовать 20-200 ммоль.

Приемлемыми буферами реагентов для определения аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы являются N-2-гидроксиэтилпиперазин-N "-2-этансульфоновая кислота (HEPES), 4-морфолинпропансульфоновая кислота (MOPS), 2-[трис(гидроксиметил)метиламино] -1-этансульфоновая кислота (TES), диэтаноламин или другие хорошие буферы, трицин, бицин, триэтаноламин (TEA) и трис(гидроксиметил)метиламинопропансульфоновая кислота (TAPS), 3-[N-трис(гидроксиметил)метиламино] -2- гидроксипропансульфоновая кислота (TAPSO) и POPSO. Предпочтительным буфером согласно изобретению является трис-буфер, общая концентрация которого предпочтительно составляет 30-150 ммоль/л, более предпочтительно примерно 70-100 ммоль/л, хотя наиболее предпочтительной является концентрация около 80 ммоль/л. При более высоких концентрациях буфера происходит более интенсивное ингибирование аспартатаминотрансферазы. Следует отметить, что фосфатные буферы, по-видимому, увеличивают скорость разрушения NADH и ингибируют взаимодействие пиридоксаль-5-фосфата (Р-5-Р) с таким апоферментом, как трансаминаза. Анализируемую пробу можно при желании разбавить любым приемлемым разбавителем, таким как деионизированная вода или физиологический раствор. Помимо вышеуказанных буферов, пригодных для реагентов для определения аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы, для реагентов для определения аммиака и мочевины пригодны следующие хорошие буферы: CAPSO, CHES и AMPSO.

Можно использовать такие консерванты, как азид натрия (NaN₃), гидроксибензойная кислота, гентамицин, тимол и не содержащие ртути консерванты, выпускаемые фирмой Boehringet Mannheim, такие как метилизотиазолон. Консерванты вводят в реагенты в таком количестве, которое позволяет сохранить стабильность препарата в течение по крайней мере 6-8 месяцев при температуре 2-8^oС, не подавляя при этом ферменты в реагенте. Приемлемое количество консерванта, удовлетворяющее этому критерию, равно 0,1-1,0 г/л.

В качестве неспецифических стабилизаторов можно также использовать разные хелатообразователи, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), этиленгликольтетрауксусная кислота (EGTA), N-(2-гидроксиэтил)- этилендиаминтриуксусная кислота (НЕРТА) и тому подобные. В реагентах для определения аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы по данному изобретению этилендиаминтетрауксусную кислоту предпочтительно используют в количестве около 2,0-10,0 ммоль/л для стабилизации 2-оксоглутарата. Ее можно использовать в виде тетранатриевой соли, а также калиевой соли, но предпочтительной солью по данному изобретению является двунатриевая соль. В реагентах для определения мочевины и аммиака этилендиаминтетрауксусную кислоту используют в количестве 0,2-10 ммоль. Наиболее предпочтительная концентрация этилендиа-минтетрауксусной кислоты равна 1 ммоль.

Реагенты согласно изобретению могут также содержать стабилизаторы ферментов. Предпочтительным стабилизатором является

бычий сывороточный альбумин без протеазы. Другими приемлемыми стабилизаторами могут быть бычий гамма-глобулин, N-ацетилцистеин и глицерин.

В реагенты согласно изобретению можно при желании добавить приемлемые противовспенивающие вещества. Приемлемыми поверхностно-активными веществами являются цвиттерионные и неионные поверхностно-активные вещества, которые вводят в реагенты в количестве, не подавляющем ферменты.

Другим объектом данного изобретения является усовершенствованный ферментативный способ определения концентрации анализируемого вещества в пробе биологической жидкости путем измерения степени окисления кофермента, заключающийся в стабилизации реагента, содержащего указанный кофермент, против окисления при помощи системы восстановления кофермента, состоящей из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечить постоянное восстановление указанного кофермента на протяжении всего срока хранения данного реагента.

Предложен также способ ферментативного определения концентрации трансаминазы в пробе биологической жидкости путем измерения степени окисления кофермента, заключающийся в стабилизации реагента, содержащего указанный кофермент, против окисления при помощи системы восстановления кофермента, состоящий из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечить постоянное восстановление указанного кофермента на протяжении всего срока хранения данного реагента.

Предложен также способ ферментативного определения концентрации трансаминазы в пробе биологической жидкости путем измерения степени окисления кофермента, заключающийся в стабилизации реагента, содержащего указанный кофермент, против окисления при помощи системы восстановления кофермента, состоящей из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечить постоянное восстановление указанного кофермента на протяжении всего срока хранения данного реагента.

Изобретение относится также к ферментативному способу определения аспартатаминотрансферазы в пробе биологической жидкости путем измерения степени окисления кофермента, заключающемуся в стабилизации реагента, содержащего указанный кофермент, против окисления при помощи системы восстановления кофермента, состоящей из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечить постоянное восстановление указанного кофермента на протяжении всего срока хранения данного реагента.

Изобретение относится также к ферментативному способу определения аланинаминотрансферазы в пробе биологической жидкости путем измерения степени окисления кофермента, заключающемуся в стабилизации реагента, содержащего указанный кофермент, против окисления при помощи системы восстановления кофермента, состоящей из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечить постоянное восстановление указанного кофермента на протяжении всего срока хранения данного реагента.

Изобретение относится также к ферментативному способу определения концентрации мочевины в пробе биологической жидкости путем измерения степени окисления кофермента, заключающемуся в стабилизации реагента, содержащего указанный кофермент, против окисления при помощи системы восстановления кофермента, состоящей из пары фермента и субстрата, которые выбирают так, чтобы обеспечить постоянное восстановление указанного кофермента на протяжении всего срока хранения данного реагента.

Изобретение относится также к ферментативному способу определения концентрации аммиака в пробе биологической жидкости путем измерения степени окисления кофермента, заключающемуся в стабилизации реагента, содержащего указанный кофермент, против окисления при помощи системы восстановления кофермента, состоящей из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечить постоянное восстановление указанного кофермента на протяжении всего срока хранения данного реагента.

В соответствии с предпочтительным способом согласно изобретению фермент, входящий в пару фермента и субстрата, обладает неполной специфичностью к указанному субстрату, благодаря чему уменьшается скорость перекрестной реактивности между ферментом и субстратом.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения система восстановления кофермента состоит из фермента и субстрата, обладающих специфичностью в отношении друг друга, которая по сравнению со специфичностью данного фермента к его природному субстрату составляет менее 100%, предпочтительно менее 50% и наиболее предпочтительно менее 10%. Предпочтительнее всего, если специфичность фермента и субстрата в отношении друг друга по сравнению со специфичностью фермента к его природному субстрату равна менее 5%, в частности примерно 2%.

Кофермент, субстрат и фермент можно выбрать из указанных выше для реагентов согласно изобретению в зависимости от анализируемого вещества.

В соответствии с одним вариантом осуществления этого изобретения предпочтительными компонентами системы восстановления кофермента, используемой для определения концентрации анализируемого вещества, являются NADH, G-6-P-DH и D-глюкоза, которые делают возможным осуществление следующей реакции восстановления



Благодаря низкой специфичности G-6-P-DH к D-глюкозе эта реакция восстановления протекает медленно и, таким образом, не влияет на основные реакции, выполняемые в процессе определения концентрации анализируемого вещества.

Предпочтительные варианты осуществления изобретения

В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения реагент для определения ала-нинаминотрансферазы имеет следующий состав:

Глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа (G-6-P-DH)} система восстановления кофермента,

D-глюкоза}

L-аланин субстрат,

Лактатдегидрогеназа субстратспецифический фермент,

Никотинамидадениндинуклеотид восстановленный (NADH) кофермент,

К₂НР0₄ активатор,

2-оксоглутарат субстрат.

Кроме того, реагент предпочтительно содержит трис-буфер, трис-HCl, динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, бычий сывороточный альбумин и азид натрия.

Один из реагентов для определения аланинаминотрансферазы согласно изобретению имеет состав, указанный в табл.1.

Один предпочтительный реагент для определения аланинаминотрансферазы имеет, в частности, состав, указанный в табл.2.

В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения реагент для определения аспартатаминотрансферазы имеет следующий состав:

Глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа (G-6-P-DH)} система восстановления кофермента,

D-глюкоза}

L-аспартат субстрат,

Лактатдегидрогеназа}

Малатдегидрогеназа} субстратспецифические ферменты,

Никотинамидадениндинуклеотид восстановленный (NADH) кофермент,

К₂НРО₄ активатор,

2-оксоглутарат субстрат,

Кроме того, реагент предпочтительно содержит трис-буфер, трис-HCl, динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, бычий сывороточный альбумин и азид натрия.

Один из реагентов для определения аспартатаминотрансферазы по настоящему изобретению имеет состав, указанный в табл.3.

Один предпочтительный реагент для определения аспартатаминотрансферазы имеет, в частности, состав, указанный в табл.4.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения реагент для определения мочевины содержит следующие компоненты:

Глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа G-6-P-DH} система восстановления кофермента,

D-глюкоза}

Уреаза фермент, специфичный для анализируемого вещества,

-Кетоглутарат субстрат,

Никотинамидадениндинуклеотид фосфат (NADPH) восстановленный кофермент,

К₂НРO₄ активатор,

Глутаматдегидрогеназа субстратспецифичсский фермент.

Один из реагентов для определения мочевины согласно изобретению имеет состав, указанный в табл.5.

Предпочтительный реагент для определения мочевины согласно изобретению имеет, в частности, состав, указанный в табл.6.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения реагент для определения аммиака имеет следующий состав:

Глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа (G-6-P-DH)} система восстановления кофермента,

D-глюкоза}

-Кетоглутарат субстрат,

Никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADPH) восстановленный кофермент,

К₂НРO₄ активатор,

Глутаматдегидрогеназа субстратспецифичсский фермент

Кроме того, реагент предпочтительно содержит трис-буфер, трис-НСl, динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, бычий сывороточный альбумин и азид натрия.

Один из реагентов для определения аммиака по настоящему изобретению имеет состав, указанный в табл.7.

Один предпочтительный реагент для определения аммиака имеет, в частности, состав, указанный в табл.8.

Хотя реагенты согласно изобретению желательно хранить в одном флаконе, их можно хранить в двух флаконах. При этом восстановитель необходимо ввести только в один из флаконов. В частности, согласно рекомендациям МФХ 2-оксоглутарат, используемый в реагентах для определения аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы, получают в виде отдельного компонента, который следует хранить отдельно от остальной части препарата. Реагент А (за исключением 2-оксоглутарата) можно ввести в пробу биологической жидкости субъекта на 5-10 минут; за это время происходят все побочные реакции. По истечении этого периода времени можно добавить 2-оксоглутарат, который инициирует основную реакцию. Вместо 2-оксоглутарата в качестве инициатора реакции можно также использовать аспартат или аланин, так как подобно 2-оксоглутарату они предотвращают инактивацию аспартатаминотрансферазу и аланинаминотрансферазу во время побочных реакций. Систему восстановления, состоящую из пары фермента и субстрата с неполной специфичностью, нужно ввести во второй флакон, где находится никотинамидадениндикуклеотид.

При использовании препарата в двух флаконах рекомендуется ввести в него пиридоксаль-5-фосфат (Р-5-Р), так как во время выдержания реагента с пробой добавления пиридоксаль-5-фосфата к сыворотке активирует апоферменты и позволяет в полном объеме измерять концентрации аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в сыворотке при условии полного насыщения пиридоксаль-5-фосфатом. Количество пиридоксаль-5-фосфата, используемого в системе реагентов в двух флаконах, равно около 80-120 мкммоль/л, более предпочтительно 100 мкмоль/л.

Пример 1

Выполняли следующие испытания стабильности четырех реагентов, полученных в соответствии с настоящим изобретением.

Состав:

Реагент для определения аспартатаминотрансферазы (см. табл. 9 и 10)

Реагент для определения аланинаминотрансферазы (см. табл.11 и 12)

Условия хранения:

Хранение в холодильнике (2-8^oС) во флаконе, закупоренном пробкой.

Спектрофотометрические параметры (Шимадзу PC2101):

Температура реакции 37^oС

Соотношение между объемом пробы и реагента от 1:10 до 1:25

Длина волны 340 нм

Длина перемещения кюветы 1 см

Лаг-фаза измерения равна примерно 1 минуте или меньше, а время измерения после лаг-фазы составляет до 3 минут. Эти спектрофотометрические параметры использовали для определения следующих показателей:

исходная оптическая плотность реагента при длине волны 340 нм

скорость восстановления при температуре 20^oС (выраженная в мЕОП/мин)

В качестве эталонов для определения восстановления использовали Cobas Mira.

Были получены результаты, приведенные в табл.13 и 14.

В таблицах 15 и 16 приведены функциональные характеристики реагентов для определения аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы на протяжении 7 месяцев. В каждой серии испытаний использовали сыворотку с высоким и низким содержанием аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы, производя измерение требуемого компонента свежеприготовленным реагентом и реагентом, который хранили при температуре 8^oС в течение разных периодов времени.

Приведенные результаты показывают, что восстановленные реагенты для определения аспартатаминотрансферазы и аланин-аминотрансферазы сохраняют стабильность в течение по крайней мере 6-7 месяцев при хранении в закрытом крышкой флаконе при температуре 2-8^oС. Чтобы сохранить функциональные характеристики, реагент должен иметь первоначальную оптическую плотность, равную 1,0 ЕОП.

Результаты, приведенные в таблицах 15 и 16, показывают, что не существует значительных различий между результатами, полученными для контрольной пробы сыворотки при использовании свежего реагента и реагента, который перед этим хранили при температуре 8^oС в течение 29 недель. Результаты, приведенные в таблицах 17 и 18, показывают, что реагенты для определения аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы, содержащие систему восстановления кофермента, по-прежнему удовлетворяют требованиям, предъявляемым к линейности результатов, после хранения в течение 31 недели при температуре 8^oС.

Введение в реагент системы восстановления кофермента по настоящему изобретению привело к увеличению стабильности восстановленного реагента для определения аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в сыворотке, который хранили в закрытом крышкой флаконе в течение периода времени от 1 до 6-8 месяцев при температуре 2-8^oС.

Пример 2

Реагенты для определения мочевины получали, используя ингредиенты, указанные в приведенной выше таблице 6, за исключением того, что в препараты вводили 0,33 ммоль NADH и содержание D-глюкозы было снижено до 20 ммоль для одного из реагентов.

Полученные препараты имели рН 8,5. В качестве контрольного реагента использовали обычный препарат для измерения концентрации мочевины. В качестве загрязняющей примеси в систему реагентов (конечная концентрация) вводили 0,15 ммоль аммиака. Такое количество аммиака достаточно для поглощения 0,15 ммоль NADPH в соответствующих реагентах, что эквивалентно 0,93 единице оптической плотности (ЕОП) при длине волны 340 нм. После окончания реакции (т.е. после удаления аммиака из реагента) с помощью спектрофотометра Шимадзу с длиной волны 340 нм при температуре 0^oС на протяжении определенного периода времени измеряли оптическую плотность разных растворов (находящихся в герметично закрытых кюветах).

Результаты, приведенные на фигуре 1, показывают восстановление NADH из NAD⁺ в зависимости от времени в реагенте для определения мочевины по настоящему изобретению после загрязнения реагента 0,15 ммоль аммиака.

Фигура 1:

На фиг. 1А показано восстановление NADH в обычном реагенте для определения мочевины.

На фиг 1В показано восстановление NADH в реагенте для определения мочевины, содержащем 5 ммоль фосфата натрия, 2000 ед/л глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G-6-PDH) и 20 ммоль D-глюкозы.

На фиг.1С показано восстановление NADH в реагенте для определения мочевины, содержащем 5 ммоль фосфата калия, 2000 ед/л глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G-6-PDH) и 100 ммоль D-глюкозы.

Через 48 часов при температуре 20^oС в обычном реагенте прекратилось восстановление NADH, израсходованного после загрязнения реагента аммиаком. На протяжении такого же периода времени в реагенте для определения мочевины согласно изобретению, который содержал 20 ммоль D-глюкозы, было восстановлено 0,23 единицы оптической плотности или 0,04 ммоль NADH. Через 48 часов в реагенте для определения мочевины согласно изобретению, содержащему 100 ммоль D-глюкозы, было восстановлено 0,70 единицы оптической плотности или 0,11 ммоль NADH. Эти результаты свидетельствуют о способности рассматриваемого здесь реагента восстанавливать никотинамидадениндинуклеотид (NADH), израсходованный в связи с загрязнением указанного реагента аммиаком.

Максимальные скорости восстановления NADH в соответствующих реагентах для определения мочевины приведены в таблице 19. У обычного реагента для определения мочевины оптическая плотность медленно снижалась с течением времени после удаления загрязняющего аммиака. В препарате согласно изобретению скорость восстановления NADH увеличивалась с увеличением концентрации D-глюкозы в реагенте.

Реагенты для определения аммиака получали, используя ингредиенты, указанные в приведенной выше таблице 8, за исключением того, что соотношение между трис-буфером и трис-НС1 (общий объем буфера 100 ммоль) изменяли так, что значения рН реагентов находились в интервале рН 8,0-9,3. Кроме того, в полученных реагентах для определения аммиака конечная концентрация никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADPH) была равна 0,2 ммоль. Был получен также контрольный реагент для определения аммиака без D-глюкозы, фосфата калия или глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (G-6-PDH). В качестве загрязняющей примеси в систему реагентов (конечная концентрация) вводили 0,1 ммоль аммиака. Такое количество загрязняющего аммиака достаточно для поглощения 0,1 ммоль NADPH в соответствующих реагентах, что эквивалентно 0,62 единице оптической плотности при длине волны 340 нм. После окончания реакции (т.е. после полного удаления аммиака из реагентов) при помощи спектрофотометра Шимадзу с длиной волны 340 нм при температуре 20^oС в течение определенного периода времени измеряли оптическую плотность разных растворов (находящихся в герметично закрытых кюветах).

Результаты, приведенные на фигуре 2, показывают восстановление NADPH из NADP в зависимости от времени в реагентах для определения аммиака с рН 8,0-9,3 по настоящему изобретению после загрязнения 0,1 ммоль аммиака. Восстановление NADPH после удаления загрязняющего аммиака прекратилось через 24 часа при температуре 20^oС. Максимальные скорости восстановления NADPH в соответствующих реагентах для определения аммиака приведены в таблице 20. В обычном реагенте для определения аммиака с рН 8,0 оптическая плотность раствора медленно уменьшалась до 0,6-0,65. В испытанных препаратах по настоящему изобретению со всеми значениями рН скорость восстановления NADPH была практически такой же. Максимальная скорость восстановления NADPH имела место при рН 8,50. Эти результаты ясно свидетельствуют о способности реагентов по настоящему изобретению восстанавливать NADPH после загрязнения аммиаком.

Пример 3

Скорости расходования NAD(P)H в реагентах для определения аммиака и мочевины

А. Реагент для определения мочевины

Реагенты для определения мочевины имели состав, указанный в таблице 6, за исключением следующих изменений. Конечная концентрация NADH в реагентах была равна 0,25 ммоль. Показатель рН реагента для определения мочевины регулировали путем изменения соотношения между трис-буфером и трис-НС1 (общее содержание буфера 100 ммоль). Растворы контрольных реагентов для определения мочевины получали без D-глюкозы, фосфата и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (G-6-PDH).

Оптическую плотность растворов реагентов, хранившихся в герметично закрытых кюветах при температуре 202^oС, измеряли при длине волны 340 нм.

Результаты уменьшения с течением времени оптической плотности растворов реагентов для определения мочевины, хранившихся при температуре 202^oС, которые были измерены при длине волны 340 нм, приведены в таблице 21. Полученные результаты свидетельствуют о том, что как при наличии, так и отсутствии системы восстановления кофермента по настоящему изобретению, оптическая плотность растворов быстрее уменьшается при рН 8,0, чем при рН 8,5. Однако в препаратах по данному изобретению скорость уменьшения оптической плотности растворов реагентов была гораздо более медленной. Другими словами, более высокий показатель рН и введение системы восстановления кофермента значительно уменьшают скорость расходования NADPH в растворе реагента для определения мочевины.

Необходимо отметить, что увеличение рН свыше 8,5 будет также способствовать повышению стабильности NADH, но при этом выпускаемые промышленностью ферменты, такие как уреаза и глутаматдегидрогеназа, становятся гораздо менее стабильными и менее активными в реагенте. Поэтому показатель рН нужно выбирать с таким расчетом, чтобы сохранить необходимую активность и стабильность фермента и при этом обеспечить приемлемую стабильность NADH. В связи с этим предпочтительным является реагент с показателем рН, равным примерно 8,5.

В. Реагент для определения аммиака

Реагенты для определения аммиака имели состав, указанный в таблице 8, за исключением следующих изменений. Показатель рН реагента для определения аммиака регулировали путем изменения соотношения между трис-буфером и трис-НС1 (общее содержание буфера 100 ммоль). Конечная концентрация NADPH в растворах реагентах для определения аммиака была равна 0,2 ммоль. Растворы контрольных реагентов для определения аммиака получали без D-глюкозы, фосфата и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа (G-6-PDH).

Оптическую плотность растворов реагентов, хранившихся в герметично закрытых кюветах при температуре 202^oC, измеряли при длине волны 340 нм.

Результаты уменьшения с течением времени оптической плотности растворов реагентов для определения мочевины хранившихся при температуре 202^oС, которые были измерены при длины волны 340 нм, приведены в таблице 22. Полученные результаты свидетельствуют о том, что как при наличии, так и отсутствии системы восстановления кофермента по настоящему изобретению, оптическая плотность растворов быстрее снижается при меньшем значении рН. Однако в препаратах по данному изобретению скорость уменьшения оптической плотности растворов реагентов была гораздо более медленной. Другими словами, более высокий показатель рН и введение системы восстановления кофермента значительно уменьшают скорость расходования NADPH в растворе реагента для определения аммиака.

Необходимо отметить, что увеличение рН способствует повышению стабильности NADPH, но при этом выпускаемая промышленностью глутаматдегидрогеназа становится гораздо менее стабильной и менее активной в реагенте с рН выше 8,5. Поэтому показатель рН нужно выбирать с таким расчетом, чтобы сохранить необходимую активность и стабильность фермента и при этом обеспечить приемлемую стабильность NADPH. В связи с этим предпочтительным является реагент с показателем рН 8,5-9,0.

Пример 4

Функциональные характеристики реагентов для определения аммиака и мочевины

А. Реагенты для определения мочевины

Реагент для определения мочевины имел состав, указанный в таблице 6, в который включали или не включали D-глюкозу, фосфат и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу (G-6-PDH). Однако конечная концентрация никотинамидадениндинуклеотида (NADH) в реагентах была равна 0,25 ммоль. Линейность результатов реагентов сравнивали с верикемом, с нормальными и анормальными контрольными пробами в приборе Roche Cobas Mira^ТМ при наличии указанных ниже параметров:

температура реакции: 37^oС

соотношение между объемом пробы и реагента: 1:100

длина волны: 340 им

Из таблицы 23 видно, что результаты, полученные при использовании реагента для определения мочевины с рН 8,50 по настоящему изобретению, соответствуют показателям контрольной пробы мочевины вплоть до самой высокой концентрации анализируемого вещества (верикем, уровень Е, концентрация мочевины 37,4 ммоль) при отклонении в пределах 5% от указанной концентрации. Результаты реагента для определения мочевины по настоящему изобретению хорошо согласуются с отклонением величин для нормальных и анормальных контрольных проб мочевины.

Реагент для определения аммиака

Реагент для определения аммиака имел состав, указанный в таблице 8, в который включали или не включали D-глюкозу, фосфат и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу (G-6-PDH). Линейность результатов реагентов сравнивали с водными растворами контрольных проб аммиака в приборе Roche Cobas Mira^ТМ при наличии указанных ниже параметров:

температура реакции: 37^oC

соотношение между объемом пробы и реагента: 1:100

длина волны: 340 нм

Из таблицы 24 видно, что результаты, полученные при использовании реагента для определения аммиака с рН 8,50 по настоящему изобретению, соответствуют показателям контрольной пробы аммиака вплоть до самой высокой концентрации анализируемого вещества (1200 мкмоль аммиака) при отклонении в пределах 5% от указанной концентрации.

Пример 5

Реагент для определения мочевины можно получить в двух флаконах в соответствии с составом, приведенным в таблицах 25 и 26. Реагенты, находящиеся во флаконах А и В, необходимо добавлять с соотношением между объемом их содержимого 5:1.

Реагент для определения аммиака в 2 флаконах

Реагент для определения аммиака можно получить в двух флаконах в соответствии с составом, приведенным в таблицах 27 и 28. Реагенты, находящиеся во флаконах А и В, следует добавлять с соотношением между объемом их содержимого 5:1. В приведенном примере состава вместо NADPH использован NADH. Вследствие этого лактатдегидрогеназу вводят во флакон А для удаления интерферирующего пирувата в пробе биологической жидкости субъекта до начала основной реакции анализа.

Важным преимуществом реагента и способа согласно изобретению является то, что этот реагент можно получить в наиболее предпочтительной форме в одном флаконе, что позволяет устранить проблемы, связанные с хранением большого количества флаконов, которые были характерны для известных реагентов, кроме того, этот препарат можно использовать для выполнения анализов в разных измерительных приборах.

Заслуживает внимания тот факт, что имеется множество "неспецифических" пар субстрата и фермента, которые можно использовать для замедления процесса восстановления кофермента в реагенте и при осуществлении способа по настоящему изобретению. Помимо вышеуказанных пар существуют и другие пары, которые не выпускаются промышленностью или являются слишком дорогими.

Кроме того, важным является то, что это изобретение можно использовать для стабилизации не только реагентов для определения аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, аммиака и мочевины, но, например, и реагентов для определения лактатдегидрогеназы (превращение пирувата в лактат), триглицерида и салицилата. Настоящее изобретение не ограничивается примерами, приведенными в этом описании изобретения, в которых рассматриваются реагенты для определения аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, аммиака и мочевины.