замещенные бенз/а/акридины, фармацевтическая композиция, терапевтический способ ингибирования роста раковых клеток

Формула изобретения

1. Соединение формулы II



в которой R₁ и R₂ представляют независимо ОН, NO₂, NH₂, галоген, NHCO(C₁-C₈)алкил или (C₁-C₈)алкокси или R₁ и R₂ вместе представляют -ОСН₂О-; R₃ представляет Н;

R₅ и R₆ представляют независимо Н, ОН, NO₂, NH₂, галоген, NНСО(С₁-С₈)алкил или (С₁-С₈)алкокси; или R₅ и R₆ вместе представляют -ОСН₂О-;

R₇ представляет Н или (С₁-С₈)алкил;

или R₁, R₂, R₃, R₅ и R₆ независимо представляют Н, ОН, NO₂, NH₂, галоген, NНСО(С₁-С₈)алкил или (С₁-С₈)алкокси;

R₁ и R₂ вместе представляют -ОСН₂О-; R₂ и R₃ вместе представляют -ОСН₂O-;

R₅ и R₆ вместе представляют -ОСН₂О-;

R₇ представляет Н или (С₁-С₈)алкил,

при условии, что один из R₁ и R₂ представляет (С₁-С₈)алкокси, или R₁ и R₂ вместе представляют -ОСН₂О-;

или R₁, R₅ и R₆ независимо представляют Н, ОН, NO₂, NH₂, галоген, NHСО(С₁-С₈)алкил или (С₁-С₈)алкокси;

R₂ и R₃ вместе представляют -ОСН₂О-;

R₇ представляет Н или (C₁-C₈)aлкил,

или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение формулы



в которой R₁ и R₂ представляют независимо NO₂, галоген, NHCO(C₁-C₈)алкил или (C₁-C₈)алкокси или R₁ и R₂ вместе представляют -ОСН₂О-;

R₃ представляет Н;

R₅ и R₆ представляют независимо Н, ОН, NO₂, NH₂, галоген, NHCO(C₁-C₈)алкил или (C₁-C₈)алкокси; или R₅ и R₆ вместе представляют -ОСН₂О-;

R₇ представляет Н или (C₁-C₈)алкил;

или R₁, R₂, R₃, R₅ и R₆ независимо представляют Н, ОН, NO₂, NH₂, галоген, NHCO-(C₁-C₈)алкил или (C₁-C₈)алкокси; R₁ и R₂ вместе представляют -OCH₂O-;

R₂ и R₃ вместе представляют -OCH₂O-;

R₅ и R₆ вместе представляют -ОСН₂О-;

R₇ представляет Н или (C₁-C₈)алкил,

при условии, что один из R₁ и R₂ представляет (C₁-C₈)алкокси или R₁ и R₂ вместе представляют -OCH₂O-;

или R₁, R₅ и R₆ независимо представляют Н, ОН, NO₂, NH₂, галоген, NНСО(C₁-C₈)алкил или (C₁-C₈)алкокси;

R₂ и R₃ вместе представляют -ОСН₂О-;

R₇ представляет Н или (C₁-C₈)алкил,

или его фармацевтически приемлемая соль.

3. Соединение по п.1 или 2, в котором один или оба R₁ и R₂ представляют (C₁-C₈)алкокси.

4. Соединение по п. 1 или 2, в котором оба из R₁ и R₂ представляют (C₁-C₈)алкокси.

5. Соединение по п.1 или 2, в котором один или оба R₁ и R₂ представляют метокси.

6. Соединение по п.1 или 2, в котором R₁ и R₂ оба представляют метокси.

7. Соединение по п. 1 или 2, в котором R₁ и R₂ вместе представляют -OCH₂O-.

8. Соединение по п. 1 или 2, в котором R₂ и R₃ вместе представляют -OCH₂O-.

9. Соединение по п. 1 или 2, в котором R₅ и R₆ вместе представляют -OCH₂O-.

10. Соединение по п. 1 или 2, в котором R₅ и R₆ каждый независимо представляет ОН или (C₁-C₈)алкокси или R₅ и R₆ вместе представляют -OCH₂O-.

11. Соединение по п. 1 или 2, в котором R₅ и R₆ каждый независимо представляет ОН или (C₁-C₈)алкокси.

12. Соединение по п.1 или 2, в котором R₅ и R₆ каждый представляет метокси.

13. Соединение по п.1 или 2, в котором R₇ представляет водород, метил или этил.

14. Соединение

2,3,9,10-тетраметокси-5,6-дигидробенз[а]акридин,

2,3-диметокси-9,10-метилендиокси-5,6-дигидробенз[а]акридин,

9,10-диметокси-5,6-дигидробенз[а]акридин,

2,3-диметокси-5,6-дигидробенз[а]акридин,

5,6-дигидро-9,10-диметокси-3,4-метилендиоксибенз[а]акридин,

5,6-дигидро-3,4,9,10-тетраметоксибенз[а]акридин,

2-амино-9,10-диметокси-5,6-дигидробенз[а]акридин,

3-хлор-9,10-диметокси-5,6-дигидробенз[а]акридин,

2,3,9,10-тетраметоксибенз[а]акридин,

2,3-диметокси-9,10-метилендиоксибенз[а]акридин,

9,10-диметоксибенз[а]акридин,

2,3-диметоксибенз[а]акридин,

3-хлор-9,10-диметоксибенз[а]акридин,

2,3,9,10-тетраметокси-7-метилбенз[а]акридиний метосульфат,

2,3,9,10-тетраметокси-7-метил-5,6-дигидробенз[а]акридиний метосульфат,

2,3,9,10-тетрагидрокси-5,6-дигидробенз[а]акридин или

2,3,9,10-тетрагидроксибенз[а]акридин

или его фармацевтически приемлемая соль.

15. Соединение по п.1, которое представляет 5,6-дигидро-9,10-диметокси-3,4-метилендиоксибенз[а]акридин или его фармацевтически приемлемую соль.

16. Фармацевтическая композиция, способная ингибировать рост раковых клеток, включающая соединение по любому из пп.1 - 15, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

17. Терапевтический способ ингибирования роста раковых клеток, включающий введение млекопитающим, пораженным раком, некоторого количества соединения по любому из пп.1 - 15.

18. Способ по п.17, в котором млекопитающим является человек.

19. Способ по п.17, в котором рак представляет лейкоз или меланому.

20. Способ по п.17, в котором рак представляет твердую опухоль.

21. Способ по п.20, в котором опухоль представляет опухоль молочной железы, легких, толстой кишки или яичника.

22. Способ по п.17, в котором соединение вводится в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

Описание изобретения к патенту

ДНК-топоизомеразы являются ферментами, которые присутствуют в ядрах клеток, где они катализируют разрывы и воссоединение нитей ДНК, контролирующих топологическое состояние ДНК. Проведенные недавно исследования предполагают также, что топоизомеразы вовлечены и в регулирование образования матричных суперспиралей во время транскрипции РНК. Имеются два основных класса топоизомераз млекопитающих. ДНК-топоизомераза-I катализирует изменения в топологическом состоянии двойной ДНК путем осуществления временных однонитевых циклов разрыва-соединения. В противоположность этому топоизомераза млекопитающих-II изменяет топологию ДНК за счет того, что она вызывает временный разрыв связанной ферментным мостиком двойной нити, за которым следует переход и запечатывание нитей. Топоизомераза млекопитающих-II в дальнейшем была классифицирована как тип II и тип II. Противоопухолевая активность, связанная с веществами, которые являются ядами топоизомеразы (агентами, придающими ядовитость топоизомеразе), связана с их способностью стабилизировать расщепляемый комплекс фермент-ДНК. Эта вызванная лекарством стабилизация расщепляемого комплекса фермент-ДНК превращает фермент в клеточный яд.

Несколько противоопухолевых веществ, находящихся в клиническом использовании, имеют потенциальную активность в качестве ядов топоизомераз II млекопитающих. Сюда входят адриамицин, актиномицин D, дауномицин, VP-16 и VM-26. В противоположность множеству клинически используемых и экспериментальных лекарственных средств, которые действуют как яды топоизомеразы II, в настоящее время имеется лишь ограниченное количество веществ, которые были идентифицированы как яды топоизомеразы I. К наиболее интенсивно изучаемым ядам топоизомеразы I относятся камптотецин и его структурно-близкие аналоги. В последнее время в качестве ядов топоизомеразы I были идентифицированы би- и тербензимидазолы (Chen et. al., Cancer Res. 1993, 53, 1332-1335; Sun et al., J. Med. Chem. 1995, 38, 3638-3644; Kim et al., 1996, 39, 992-998), некоторые бензо[с] фенантридиновые и протобербериновые алкалоиды и их синтетические аналоги (Makhey et al., Med. Chem. Res. 1995, 5, 1-12; Janin et al., J. Med. Chem. 1975, 18, 708-713; Makhey et al., Bioorg. & Med. Chem. 1996, 4, 781-791), а также метаболиты грибков, булгареин (Fujii et al., J. Biol. Chem. 1993, 268, 13160-13165) и саинтопин (Yamashita et al. Biochemistry 1991, 30, 5838-5845) и индолокарбазолы (Yamashita et al., Biochemistry 1992, 31, 12069-12075).

Исключительное отравление топоизомеразы в случае с коралином, нитидином, 5,6-дигидро-8-десметилкоралином и связанными с ними аналогами, явилось толчком к проведению нескольких последних исследований тех структурных характеристик, которые связаны с их способностью специфически действовать в качестве ядов топоизомеразы I и топоизомеразы II (Gatto et al., Cancer Res. 1996, 56, 2795-2800; Wang et al., Chem. Res. Toxicol. 1996, 9, 75-83; Wang et al., Chem. Res. Toxicol. 1993, 6, 813-818). Общей чертой, характерной для всех этих веществ, является присутствие внутри их структуры 3-фенилизохинолиниевого фрагмента.

Несмотря на наблюдения, показавшие, что некоторые из этих соединений имеют активность, подобную камптотецину как яду топоизомеразы I, или активность, сходную с VM-26 в качестве яда топоизомеразы II, они обладают лишь небольшой цитотоксической активностью. Отсутствие более прямой корреляции с их активностью в качестве ядов топоизомеразы объясняют, частично, вероятностью того, что эти вещества, по-видимому, не так эффективно поглощаются клетками, как камптотецин или VM-26. Наиболее вероятно, что присутствие четвертичной аммониевой группы препятствует клеточному поглощению. Было установлено, что для обеспечения эффективного транспорта таким веществам, как коралин и нитидин, может потребоваться гидролиз с последующей дегидратацией или циклодегидратацией для реформирования исходного четвертично-аммониевого соединения. Этим может объясняться относительно низкая противоопухолевая активность, наблюдавшаяся in vitro с такими агентами, как коралин или нитидин.

Ясно, что существует потребность в противораковых агентах с улучшенной активностью.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩЕСТВА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение представляет соединения формулы (I)

(I)

где R₁, R₂, R₃, R₅ и R₆ независимо представляют H, ОН, NO₂, NH₂, галоген, NHCO(C₁-C₈)алкил или (C₁-C₈)алкокси; R₁ и R₂ вместе представляют -OCH₂O-; R₂ и R₃ вместе представляют -OCH₂O-; или R₅ и R₆ вместе представляют -OCH₂O-;

R₄ и R₇ независимо представляют H, (C₁-C₈) алкил или отсутствуют;

W представляет C или N;

X представляет C или N;

Y представляет -C= , -N= или прямую связь, при условии, что, когда Y представляет -C=, то X представляет N; и

Z представляет -CH=CH-, -(CH₂)₂- или отсутствует; или их фармацевтически приемлемые соли.

В соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления изобретения W представляет N, а Y - прямую связь. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, W представляет C, а Y представляет -C= или -N=.

В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения Z представляет -CH=CH- или -(CH₂)₂-. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения R₅ и R₆ каждый представляет (C₁-C₈)алкокси, предпочтительно -OCH₃, или вместе они представляют -OCH₂O-. Предпочтительно R₃ обозначает Н. В предпочтительном варианте осуществления изобретения один или оба из R₁, R₂ представляют (C₁-C₈)алкокси, предпочтительно -OCH₃, или вместе представляют -OCH₂O-. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения R₂ и R₃ вместе представляют -OCH₂O-.

Предпочтительно, когда X представляет C, R₇ представляет H, метил или этил; или, когда X представляет C, R₇ представляет Н. Предпочтительно, когда X представляет N, R₇ отсутствует или представляет CH₃. Подобным образом, предпочтительно, когда Y представляет -C= , R₄ представляет H; и когда Y представляет -N =, R₄ отсутствует или обозначает CH₃. Понятно, что когда X или Y представляет замещенный N, то N будет иметь положительный заряд.

Предпочтительной группой соединений формулы I являются соединения формулы II

(II)

где R₁, R₂, R₃, R₅, R₆ и R₇ имеют любое из значений или из предпочтительных значений, указанных здесь для соединения формулы I; или их фармацевтически приемлемые соли.

Показано, что соединения формулы (I) являются эффективными цитотоксическими агентами против раковых клеток, включая устойчивые к лекарствам раковые клетки. Кроме того, некоторые соединения формулы I демонстрируют ингибиторную активность против топоизомеразы I.

Таким образом, данное изобретение также представляет способ ингибирования роста раковых клеток in vitro или in vivo, включающий введение млекопитающим, пораженным раком, количества соединения формулы (I), эффективного для ингибирования роста указанных раковых клеток. В соответствии с данным изобретением соединение или его соль могут вводиться в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

Изобретение также касается фармацевтических композиций, включающих соединение по данному изобретению в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, а также способов получения соединений по данному изобретению и новых промежуточных продуктов, полезных для синтеза соединений по данному изобретению.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 иллюстрирует синтез характерных бенз[с]акридинов формулы (I).

Фиг. 2 иллюстрирует синтез характерных бенз[с]акридинов формулы (I).

Фиг. 3 иллюстрирует синтез характерных соединений настоящего изобретения.

Фиг. 4 иллюстрирует синтез промежуточных продуктов, полезных для получения соединений формулы (I).

Подробное описание изобретения

В соответствии с настоящим изобретением раковые клетки раковые клетки ингибируются in vitro и in vivo с помощью введения млекопитающим, пораженным раком, эффективного количества соединения формулы (I). Под используемым здесь выражением "эффективное количество" подразумевается такое количество, которое приводит к ингибированию роста раковых клеток, против которых оно направлено. Как здесь описывается, подходящая доза находится в диапазоне примерно от 0,5 до 100 мг/кг веса тела в день.

Соединения и композиции, описываемые в настоящем описании, эффективны для лечения твердых опухолей млекопитающих и злокачественных заболеваний крови. Эти твердые опухоли включают рак головы и шеи, легких, мезотелиомы, рак средостения, пищевода, желудка, поджелудочной железы, почечно-желчной системы, тонкого кишечника, толстой кишки, прямой кишки, ануса, почек, мочеточников, мочевого пузыря, простаты, уретры, пениса, яичка, женских половых органов, яичников, молочной железы, эндокринной системы, кожи, центральной нервной системы; сарком мягких тканей и костей; а также меланомы кожного и внутриглазного происхождения. Злокачественные болезни крови включают детский лейкоз и лимфомы, болезнь Ходжкина, лимфомы лимфоцитного и кожного происхождения, острый и хронический лейкоз, неоплазму клеток и плазмы, а также рак, связанный со СПИДом. Предпочтительными видами млекопитающих для лечения являются люди и домашние животные.

Бенз[с]акридины формулы I (X представляет собой N, a Y представляет -C=) можно удобно получить способом, проиллюстрированным на фигуре 1. Реакция 2-амино-4,5-диметоксиацетофенона, 4, с 6,7-диметокси-1-тетралоном, 5, дает 5,6-дигидро-2,3,9,10-тетраметоксибенз[с] акридин, 6, который, при нагревании его в виде суспензии в декалине при 190^oC в присутствии палладия на угле может превращаться в 2,3,9,10-тетраметоксибенз[с]акридин, 7. Как 6, так и 7 могут превращаться в их 12-метильные производные по реакции с диметилсульфатом, в результате чего образуются соли четвертичного аммония, соответственно 8 и 9.

Аналоги бенз[а] акридина (X представляет C, a Y представляет -N=) могут получаться с использованием приемов, аналогичных проиллюстрированным на фигуре 2. Конденсация по Knoevenagel соответствующего о-нитробензальдегида с 5,6- или 6,7-дизамещенными -тетралонами, дает 1-(2"-нитробензолиден)-2-тетралоны, 12a-f и j. Восстановление цинком в уксусной кислоте дает желаемые производные 5,6-дигидробенз[а]акридина, 13a-f и j. Нагревание в декалине при 190^oC в присутствии палладия на угле приводит к превращению этих соединений в их бенз[а]акридиновые производные, 14a-d и j. Обработка либо 13а, либо 14а BBr₃ (трехбромистым бором) в метиленхлориде дает тетрагидрокси-аналоги, 13g и 14g соответственно. Реакция 13а или 14а, с диметилсульфатом приводит к образованию их 7-метильных производных, 15а и 16а.

Исходные материалы, 2-нитро-4,5-диметоксибензальдегид и 2-нитро-4,5-метилендиоксибензальдегид коммерчески доступны. Получение 6-хлор--тетралона может быть выполнено, как описано авторами Rosowsky et al., J. Org. Chem. 1968, 33, 4288-4290 (Розовский и др., ЖОХ).

7-Нитро--тетралон получался из 7-нитро--тетралона, с использованием процедуры, подобной описанной авторами Nichols et al. (Organic Preparations and Procedures 1977, 277-280), как проиллюстрировано на фигуре 3. 7-Нитро--тетралон служил в качестве промежуточного вещества при получении соединений 20, 21, 22 и 23, как показано на фигуре 3.

5,6-Метилендиокси-2-тетралон (11e) использовался в качестве необходимого промежуточного продукта для получения 5,6-дигидро-9,10-диметокси-3,4- метилендиоксибенз[а] акридина, 13e. Данный тетралон получался в шесть стадий, как показано на фигуре 4. 2,3-Метилендиоксибензальдегид конденсировался с малоновой кислотой, давая 2,3-метилендиоксикоричную кислоту (J.Koo et al., Org. Synthesis Coll. Vol. IV, 1963, 327-329). 2,3-Метилендиоксикоричная кислота гидрировалась с использованием 10%-ного палладия на угле, давая производное дигидрокоричной кислоты, которое затем трансформировалось в его этиловый эфир, 17 (М.A. Brook; T.N. Chan, Synthesis Comm., 1983, 201-203). Этил-2,3-метилендиоксидигидроциннамат затем превращался в его -кетосульфоксид, 18, (J. G. Cannon et al. , J. Med. Chem., 1977, 20, 1111-1116). Производное -кетосульфоксида, 18, когда его подвергали перегруппировке Пуммерера путем обработки трифторуксусной кислотой, давало 1,2,3,4-тетрагидро-1-метилтио-5,6-метилендиокси-2(1Н)-нафталенон, 19 (Y. Oikawk, Tetrahedron, 1974, 30, 2653-2660). Гидрогенолиз соединения 19 с использованием 10%-ного палладия на угле в ледяной уксусной кислоте давал соединение 11e (D.Е. Nicholes, J. Med. Chem. 1990, 33, 703-710).

Фармацевтически приемлемые соли соединений формулы I также могут использоваться при практическом осуществлении заявленных способов. Фармацевтически приемлемые соли могут получаться с использованием органических и неорганических оснований, таких как NaOH, Na₂CO₃, NaHCO₃, KOH и аналогичных; также как и кислот, таких как соляная кислота, сульфоуксусные кислоты и аналогичные. Хотя описанные здесь соединения и/или их соли могут вводиться в виде чистых химических веществ, но предпочтительно предоставить активный ингредиент в виде фармацевтической композиции. Данное изобретение, кроме того, касается использования фармацевтической композиции (состава), включающего одно или более соединений и/или фармацевтически приемлемых солей, вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, и, необязательно, другими терапевтическимии/или профилактическими ингредиентами. Носитель (носители) должен быть "приемлемым" в том смысле, что он (они) должен быть совместим с другими ингредиентами композиции и не должен (не должны) быть вредным для реципиента.

Фармацевтические составы (композиции) включают такие, которые подходят для перорального приема и для парентерального введения (включая внутримышечное, подкожное и внутривенное введение). Эти составы могут быть, когда это является удобным, представлены в виде отдельных или дискретных форм единичных доз и могут получаться любым из способов, хорошо известных специалистам в области фармакологии. Такие способы включают смешивание активного вещества с жидкими носителями, с твердыми матрицами, полутвердыми носителями, с тонко измельченными твердыми носителями или их сочетанием, а затем, если это необходимо, придание изделию формы в соответствии с желаемой системой доставки лекарственного средства.

Фармацевтические составы, подходящие для приема внутрь, могут быть представлены в виде лекарственных дискретных форм единичных доз, таких как твердые или мягкие желатиновые капсулы, крахмальные капсулы или таблетки, каждая из которых содержит определенную дозу активного ингредиента; в виде порошка или гранул; в виде раствора, суспензии или эмульсии. Активный ингредиент может быть также представлен в виде болюса (шарика), электуария (лекарственной кашки) или пасты. Таблетки и капсулы для приема внутрь могут содержать обычные добавки, такие как связующие агенты, наполнители, смазывающие, дезинтегрирующие или смачивающие агенты. На таблетки может быть нанесено покрытие в соответствии со способами, хорошо известными специалистам в данной области техники, например энтерическое покрытие.

Оральные жидкие препараты могут быть, например, в форме водной или масляной суспензии, растворов, эмульсий, сиропов или эликсиров, или могут быть представлены в виде сухого продукта для смешивания перед использованием с водой или с другими подходящими носителями. Такие жидкие препараты могут содержать обычные добавки, такие как суспендирующие средства, эмульгирующие средства, неводные носители (которые могут включать съедобные масла) или консерванты.

Соединения могут также быть представлены в виде лекарственных форм, предназначенных для парентерального введения (например, путем инъекций; например, путем введения болюса или непрерывного вливания) или могут быть представлены в виде единичных доз в ампулах, предварительно наполненных лекарством шприцов, в виде инфузионных контейнеров для мелких болюсов или в виде контейнеров с множеством доз, с добавкой консервантов. Эти составы могут иметь такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях, и могут содержать такие принятые при изготовлении лекарств агенты, как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. Альтернативно, активный ингредиент может быть в форме порошка, полученного путем асептического выделения стерильного твердого вещества или путем лиофилизации из раствора, для смешивания его перед использованием с подходящими носителями, например со стерильной, свободной от пирогенов водой.

Для топического или местного нанесения на эпидермис составы могут быть приготовлены в виде таких лекарственных форм, как мази, кремы или примочки, или в виде активного ингредиента в трансдермальном пластыре. Подходящие системы трансдермальной доставки описываются, например, в патентах США N 4788603 (Fisher et al.) или N 4931279, 4668504 и 4713224 (Bawas et al). Мази и кремы могут быть, например, изготовлены в форме лекарственных средств на водной или масляной основе, с добавкой подходящих загустителей и/или желирующих средств. Лосьоны могут быть изготовлены в форме лекарственных средств с водной или масляной основой, обычно с содержанием также одного или более эмульгирующих средств, стабилизирующих средств, диспергирующих средств, суспендирующих средств, загустителей или окрашивающих агентов. Активный ингредиент может также доставляться пациенту путем ионофореза, например, как описано в патентах США N 4140122, 4383529 или 4051842.

Составы, подходящие для топического введения в рот, включают формы единичных доз, такие как лепешки, включающие активный ингредиент на основе со вкусовыми добавками, обычно с сахарозой или с акацией или с трагакантом; пастилки, включающие активный ингредиент в инертной основе, такой как желатин и глицерин или сахароза и акация; прилипающие к слизистой оболочке гели, а также жидкости для полоскания рта, включающие активный ингредиент в подходящем жидком носителе.

При желании вышеописанные составы могут быть адаптированы для того, чтобы обеспечить длительное высвобождение используемого активного ингредиента, например, путем его сочетания с определенными гидрофильными полимерными матрицами, например, включающими природные гели, синтетические полимерные гели или их смеси.

Фармацевтические составы в соответствии с настоящим изобретением могут также содержать другие вспомогательные вещества, такие как ароматизаторы, красящие агенты, антимикробные агенты или консерванты.

Кроме того, очевидно должно быть понятно, что количество соединения или его активной соли или его производного, требуемое для использования при лечении, будет варьировать не только в зависимости от конкретной выбранной соли, но также и от способа введения, характера состояния, подвергаемого лечению, а также от возраста и состояния пациента, и это количество в конечном счете подбирает лечащий врач.

Обычно, однако, подходящая доза находится в диапазоне примерно от 0,5 до 100 мг/кг, например, примерно от 10 до 75 мг на килограмм веса тела в день, или например от 3 до 50 мг на килограмм веса тела реципиента, предпочтительно в диапазоне от 6 до 90 мг/кг/день, наиболее предпочтительно в диапазоне от 15 до 60 мг/кг/день.

Соединение удобно вводится в виде единичной дозированной формы, например, содержащей от 5 до 1000 мг, более удобно от 10 до 750 мг, наиболее удобно от 50 до 500 мг активного ингредиента на единичную дозу.

В идеале, активный ингредиент должен вводиться так, чтобы достичь пика концентрации активного соединения в плазме примерно от 0,5 до 75 мкМ, предпочтительно примерно от 1 до 50 мкМ, наиболее предпочтительно от около 2 до около 30 мкМ. Этого можно достичь, например, путем внутривенного введения 0,05 - 5% раствора активного ингредиента необязательно в солевом (физиологическом) растворе, или перорального введения в виде болюса, содержащего около 1-100 мг активного ингредиента.

Желаемые уровни лекарства в крови могут поддерживаться непрерывным вливанием, обеспечивающим около 0,01-5,0 мг/кг/час, либо посредством прерывистых вливаний, содержащих около 0,4-15 мг/кг активного ингредиента (ингредиентов).

Желаемая доза удобно может быть представлена в виде однократной (разовой) дозы или в виде разделенных доз, вводимых через определенные интервалы, например, в виде двух, трех, четырех или более суб-доз в день. Эта суб-доза сама по себе тоже может быть еще разделена, например, на ряд произвольно разделенных введений; таких, как многократные ингаляции из инсуффлятора или путем применения множества капель, закапываемых в глаз.

Данное изобретение иллюстрируется с помощью нижеприведенных примеров, но не ограничивается ими.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР I - Общий

Точки плавления определяли с помощью капиллярного прибора Томаса-Гувера для определения точки плавления. Спектральные данные инфракрасного излучения (ИК) получались на спектрофотометре с Фурье-преобразованием Перкина-Элмера 1600 и представлены в см^-1. Протонный (¹H ЯМР) и углеродный ядерно-магнитный резонанс (¹³C ЯМР) регистрировались с помощью спектрометра с Фурье-преобразованием Вариан-Джемини-200. Спектры ЯМР (200 МГц ¹H и 50 МГц ¹³C) регистрировались в CDCl₃ (за исключением особо оговоренных случаев), с химическими сдвигами, выраженными в единицах , в сторону слабого поля от тетраметилсилана (ТМС). Константы взаимодействия выражены в герцах. Масс-спектры были получены из данных по биомедицинской и биоорганической спектрометрии Вашингтонского Университета. Колоночная хроматотрафия относится к флэш-хроматографии, проводившейся на СилиТек 32-63 мкм (компании ICN Биомедикалз, Eschwegge, Германия), с использованием указанных систем растворителей. Анализы сжигания проводились компанией Атлантик Микролабс Инк., Норкросс, Джорджия, и результаты их находились в пределах 0,4%.

2,3,9,10-Тетраметокси-7-метил-5,6-дигидробенз[с] акридин (6). 2-Амино-4,5-диметоксиацетофенон (1,0 г, 5,1 ммоль) растворялся в 10 мл CH₂Cl₂ и добавлялся хлористый водород (1,0 М раствор ангидрида в эфире) при энергичном перемешивании при комнатной температуре. Хлористоводородная соль аминоацетофенона выпала в осадок. Растворитель удаляли под вакуумом и полученный твердый осадок сушили под вакуумом в течение часа. Сухую хлористоводородную соль затем растирали в ступке с 6,7-диметокси-1-тетралоном (1,59 г, 7,68 ммоль), а затем смесь переносили в запечатанную трубку и нагревали при 140^oC в течение 1 часа. Полученную расплавленную пробку затем растворяли в кипящем метаноле (300 мл). Данный раствор затем концентрировали до 200 мл и оставляли на ночь, давая игольчатые кристаллы. Кристаллы отфильтровывались, промывались тремя порциями (5 мл) ацетона и сушились, давая золотисто-желтые иглы производного бенз[с] акридин гидрохлорида с выходом 99%. Хлористоводородную соль растворяли в 200 мл кипящего метанола. После того, как раствор охлаждался до комнатной температуры, добавлялась по каплям концентрированная NH₄OH до получения pH 10. Начинали образовываться светло-желтые кристаллы. Суспензия затем разбавлялась 200 мл воды и экстрагировалась три раза 100 мл порциями CH₂Cl₂. Объединенные экстракты один раз промывались 50 мл рассола, сушились с помощью безводного Na₂SO₄, фильтровались и растворитель удалялся под вакуумом, давая свободное основание; т.пл. 240^oC; ИК (нуйол): 2922, 1620; ¹H ЯМР: 2,52 (3Н, с.), 2,86 (2Н, с.), 3,02 (2Н, т.), 3,90 (3Н, с.), 3,98 (3Н, с.), 4,03 (3Н, с.), 4,05 (3Н, с.), 6,70 (1Н, с.), 7,08 (1Н, с.), 7,43 (1Н, с.), 8,04 (1Н, с.); ¹³C ЯМР: 16,5, 25,4, 28,0, 56,6, 56,7, 57,8, 58,3, 102,3, 102,7, 110,9, 111,8, 119,5, 123,2, 127,7, 134,7, 135,6, 146,3, 148,5, 149,7, 151,3, 151,5 155,2; HRMS (масс-спектрометрия высокого разрешения): вычислено для C₂₂H₂₃NO₄: 365,1630; найдено: 365,1628.

5,6-Метилендиокси-2-тетралон (11e): 0,669 г (2,83 мМ) соединения 19 брали в 10 мл ледяной уксусной кислоты в колбе для гидрирования. Добавлялось 0,46 г 10%-ного палладия на угле и смесь встряхивалась в аппарате Парра при давлении водорода в 40 фунт/кв.дюйм (275,7904 Па) в течение 40 часов. Реакционную смесь фильтровали через слой целита, который трижды промывался 5-миллилитровыми порциями ледяной уксусной кислоты. Ледяная уксусная кислота подвергалась ротационному выпариванию, давая сырой тетралон, 11e. Сырой тетралон затем обрабатывался бисульфитом натрия для превращения его в более стабильный аддукт (продукт присоединения) бисульфита. Чистый тетралон получался из его бисульфитного аддукта посредством обработки 10%-ным раствором карбоната натрия, с последующим экстрагированием дихлорметаном; т. пл. 90-91^oC (лит. ³⁶ 88-91^oC); ИК (нуйол), 1715; ¹H ЯМР: 2,50 (2Н, т.), 2,98 (2Н, т.), 3,50 (2Н, с.), 5,93 (2Н, с), 6,56 (1Н, д. J=6), 6,65 (1H, д. J=6); ¹³C ЯМР: 21,6, 37,9, 45,0, 101,5, 107,4, 118,5, 121,1, 127,8, 144,1, 146,2, 211,2; Анал. (C₁₁H₁₀O₃)C,H.

ПРИМЕР II - Общая процедура синтеза производных 1-(2"-нитробензилиден)-2-тетралона (фигура 2).

Раствор 2,45 ммоль соответствующего 2-тетралона, 2-нитробензальдегида и ацетата натрия в ледяной уксусной кислоте (10 мл) нагревался в колбе с обратным холодильником в атмосфере азота в течение 3-8 часов. 3атем реакционной смеси давали охладиться до комнатной температуры. Смесь осторожно пропускали через силикагельную (75 г) колонку и подвергали хроматографии, с использованием смеси этилового эфира и гексанов (1:1). Окрашенное в желтый цвет соединение, обычно элюирующееся четвертым с колонки, собиралось, давая соответствующие производные тетралона, с выходом 20-25%.

1- (2"Нитро-4", 5"-диметоксибензилиден)-6,7-диметокси-2-тетралон (12а). Получался из 6,7-диметокси-2-тетралона и 6-нитровератральдегида; т. пл. 65-66^oC; ИК (нуйол), 2855, 1720, 1540; ¹H ЯМР: 2,71 (2Н, т.), 2,98 (2Н, т. ), 3,35 (3Н, с), 3,66 (3Н, с.), 3,89 (3Н, с.), 3,97 (3Н, с.), 6,41 (1Н, с.), 6,62 (1Н, с.), 6,73 (1Н, с.), 7,74 (1Н, с.), 7,91 (1Н, с.); ¹³C ЯМР: 28,4, 39,7, 56,5, 56,6 56,8, 56,9, 107,7, 108,6, 111,2, 113,1, 128,1, 129,3, 130,3, 132,2, 133,3, 148,9, 149,0, 150,0, 153,3, 200,7.

1-(2"-Нитро-4", 5"-диметилендиоксибензилиден)-6,7- диметокси-2-тетралон (12b). Получен из 6,7-диметокси-2- тетралона и 6-нитропиперонала; точка плавления 76-77^oC; ИК (нуйол): 2875, 1723, 1553; ¹H ЯМР: 2,68 (2Н, т.), 3,00 (2Н, т.), 3,41 (3Н, с.), 3,90 (3Н, с.), 6,08 (2Н, с.), 6,37 (1Н, с.), 6,51 (1Н, с.), 6,73 (1Н, с.), 7,68 (1Н, с.), 7,83 (1Н, с.), ¹³C ЯМР: 28,0, 38,0, 56,1, 56,4, 103,7 105,9, 110,1, 111,3, 112,6, 124,3, 130,8, 131,1, 132,2, 133,8, 147,6, 148,4, 149,7, 152,5.

1-(2"-Нитро-4", 5"-диметоксибензилиден)-2-тетралон (12c). Получен из 2-тетралона и 2-нитро-4,5-диметоксибензальдегида; точка плавления 58-60^oC; ИК (нуйол): 1724, 1540; ¹H ЯМР: 2,71 (2Н, т), 3,08 (2Н, т.), 3,56 (3Н, с.), 4,02 (3Н, с.), 6,51 (1Н, с.), 6,92-6,96 (2Н, м.), 7,17-7,24 (2Н, м.), 7,73 (1Н, с. ), 8,00 (1Н, с.); ¹³C ЯМР: 28,3, 27,8, 56,7, 56,9, 108,3, 112,5, 126,7, 127,6, 128,5, 128,8, 129,9, 132,3, 133,4, 134,5, 138,8, 141,6, 149,4; 153,5.

1-(2"-Hитробензилиден)-6,7-димeтoкcи-2-тетралон (12d).

Получен из 6,7-диметокси-2-тетралона и 2-нитробензальдегида; точка плавления 63-64^oC; ИК (нуйол): 1712, 1540; ¹H ЯМР: 2,69 (2Н, т.), 3,01 (2Н, т. ), 3,25 (3Н, с.), 3,88 (3Н, с.), 6,26 (1Н, с.), 6,72 (1Н, с.), 7,25-7,26 (1Н, м.), 7,44-7,50 (2Н, м.), 7,87 (1Н, с.), 8,12-8,17 (1Н, м.); ¹³C ЯМР: 28,0, 37,9, 55,7, 56,3, 108,6, 111,3, 112,5, 124,2, 124,9, 125,4, 129,3, 130,1, 131,8, 133,5, 133,9, 134,7, 147,5; 149,6, 200,7.

1-(2"-Нитро-4", 5"-диметоксибензилиден)-5,6-метилендиoкси- 2-тетралон (12e). Получен из 5,6-метилендиокси-2-тетралона и 2-нитро-4,5-диметоксибензальдегида; точка плавления 66-68^oC; ИК (нуйол): 1710, 1533; ¹H ЯМР: 2,98 (2Н, т.), 3,19 (2Н, т.), 4,02 (3Н, с.), 4,03 (3Н, с.), 6,03 (2Н, с.), 6,82 (1Н, д. , J=8,1), 7,07 (1Н, с.), 7,29 (1H, д., J=8,1), 7,49 (1H, c.), 8,20 (1H, с. ); ¹³C ЯМР: 21,8, 30,8, 56,5, 56,7, 101,8, 105,7, 107,6, 117,9, 119,1, 123,9, 125,9, 126,9, 128,7, 143,4, 145,4, 147,7, 150,1; 152,9, 156,1, 176,4; Анал. (C₂₀H₁₇NO₇) C, H, N.

1-(2"-Нитро-4", 5"-диметоксибензилиден)-5,6-диметокси-2-тетралон (12f). Получен из 5,6-диметокси-2-тетралона и 2-нитро-4,5-диметоксибензальдегида; точка плавления 70-72^oC; ИК (нуйол): 1715, 1550; ¹H ЯМР: 2,59 (2Н, т.), 3,06 (2Н, т.), 3,78 (3Н, с.), 3,86 (3Н, с.), 3,88 (3Н, с.), 3,92 (3Н, с.), 6,47 (1H, с. ), 6,77 (1H, д., J=8,2), 7,41 (1H, д., J=8,2), 7,67 (1H, с.); ¹³C ЯМР: 19,7, 32,0, 56,3, 56,7, 56,8, 56,85, 108,1, 121,9, 125,6, 126,1, 128,0, 129,2, 132,1, 132,9, 133,7, 140,3, 141,4; 149,3, 152,9, 153,5, 200,9; Анал. (C₂₁H₂₁NO₇) C, H, N.

1-(2"-Нитро-4", 5"-диметоксибензилиден-6-хлор-2-тетралон (12j). Получен из 6-хлор-2-тетралона и 2-нитро-4,5-диметоксибензальдегида; точка плавления 56-58^oC; ИК (нуйол): 2922, 1730, 1100; ¹H ЯМР: 2,68 (2Н, т.), 3,05 (2Н, т. ), 3,62 (3Н, с. ), 3,98 (3Н, с.), 6,48 (1Н, с.), 6,82 (1Н, д., J=8,4), 6,90-6,96 (1Н, дд., J=8,4, 2,1), 7,26 (1Н, д., J=2,1), 7,74 (1Н, с.), 8,01 (1Н, с. ); ¹³C ЯМР: 28,2, 37,4, 56,8, 56,9, 108,3, 112,2, 127,0, 127,2, 128,6, 130,9, 131,1, 133,3, 134,2, 134,5, 140,5, 141,5, 149,6; 153,7.

1-(2"-Нитро-4", 5"-диметоксибензилиден)-7-нитро-2- тетралон (фигура 3). Получен из 7-нитро-2-тетралона и 2-нитро-4,5-диметоксибензальдегида; точка плавления 125^oC;

ИК (нуйол): 1724, 1540; 1545; ¹H ЯМР: 2,69 (2Н, т.), 3,16 (2Н, т.), 3,59 (3Н, с.), 4,01 (3Н, с.), 6,45 (1Н, с.), 7,41 (1Н. д., J=8,1), 7,68 (1Н, д. , J=2,2), 7,72 (1Н, c.), 7,94-7,99 (1H, дд., J=8,4, 2,2), 8,08 (1Н, с.); ¹³C ЯМР: 28,4, 36,9, 56,9, 57,0, 108,7, 111,6, 123,2, 124,2, 126,1, 129,7, 132,5, 133,9, 135,8, 141,4, 145,8, 146,8, 150,1; 154,1, 198,4.

ПРИМЕР III - Общая процедура синтеза производных 5,6-дигидробенз[а]акридина (фигура 2).

Соответствующее производное 1-(2"-нитробензилиден)-2-тетралона (0,3 ммоль) растворялось в 10 мл ледяной уксусной кислоты и нагревалось в колбе с обратным холодильником с цинковой пылью (1,64 ммоль) в атмосфере азота в течение 1-4 часов. Реакционной смеси давали охлаждаться до комнатной температуры и затем вся смесь осторожно пропускалась через силикагельную (100 г) колонку и хроматографировалась сначала с 500 мл этилового эфира для удаления уксусной кислоты с последующим элюированием смесью гексан/этилацетат. Полярность подвижной фазы уменьшалась, если необходимо, подмешиванием подходящих пропорций гексанов. Соответствующие фракции сливались и концентрировались под вакуумом, давая 83-95% соответствующих 5,6-дегидробенз[а]акридинов.

2,3,9,10-Тетраметокси-5,6-дигидробенз[а] акридин (13а). Получен из 1-(2"-нитро-4", 5"-диметоксибензилиден)-6,7- диметокси-2-тетралона; точка плавления 182-183^oC; ИК (нуйол): 3210, 1615; ¹H ЯМР: 2,99 (2Н, т.), 3,23 (2Н, т. ), 3,94 (3Н, с.), 4,00 (3Н, с.), 4,02 (3Н, с.), 4,04 (3Н, с.), 6,79 (1Н, с. ), 7,10 (1Н, с.), 7,31 (1Н, с.), 7,54 (1Н, с.), 8,17 (1Н, с.); ¹³C ЯМР: 28,8, 32,3, 56,5, 56,7, 105,7, 107,2, 107,5, 111,8, 123,9, 125,8, 127,1, 128,0, 130,5, 143,1, 148,8, 149,6, 152,8, 156,7; 176,7; HRMS вычислено для C₂₁H₂₁NO₄: 351,1471; найдено 351,1475/

2,3-Диметокси-9,10-метилендиокси-5,6-дигидробенз[а]акридин (13b). Получен из 1-(2"-нитро-4",5"-метилендиоксибензилиден)-6,7-диметокси-2-тетралона; точка плавления 218-219^oC; ИК (нуйол): 2780, 1630; ¹H ЯМР: 2,97 (2Н, т.), 3,17 (2Н, т.), 3,93 (3Н, с.), 4,00 (3Н, с.), 6,07 (2Н, с.), 6,79 (1Н, с.), 7,07 (1Н, с.), 7,29 (1Н, с.), 7,32 (1Н, с.), 8,07 (1Н, с.); ¹³C ЯМР: 29,0, 33,1, 56,5, 56,7, 102,1, 103,3, 105,7, 107,6, 111,8, 125,2, 125,9, 127,0, 128,0, 130,6, 145,0, 147,9, 148,8, 149,6; 150,8; 156,9, HRMS вычислено для C₂₀H₁₇NO₄: 335,1158; найдено: 335,1162.

9,10-Диметокси-5,6-дигидробенз[а] акридин (13с). Получен из 1-(2"-нитро-4", 5"-диметоксибензилиден)-2-тетралона; точка плавления 95-96^oC; ИК (нуйол): 1633, 1516; ¹H ЯМР: 3,06 (2Н, т.), 3,24 (2Н, т.), 4,02 (3Н, с.), 4,03 (3Н, с.), 7,10 (1Н, с.), 7,28-7,37 (3Н, м.), 7,50 (1Н, с.), 7,82 (1Н, д. , J=7,0), 8,29 (1Н, с.); ¹³C ЯМР: 29,2, 32,3, 56,5, 56,7, 105,9, 107,4, 124,0, 124,3, 127,3, 127,7, 128,5, 128,9, 129,1, 133,8, 137,6, 144,2, 150,5, 153,1; HRMS вычислено для C₁₉H₁₇NO₂: 291,1259; найдено: 291,1250.

2,3-Диметокси-5,6-дигидробенз[а] акридин (13d). Получен из 1-(2"-нитробензилиден)-6,7-диметокси-2-тетралона; точка плавления 55-56^oC; ИК (нуйол): 2815, 1615; ¹H ЯМР: 2,96 (2Н, т.), 3,23 (2Н, т.), 3,90 (3Н, с.), 3,98 (3Н, с. ), 6,75 (1Н, с.), 7,30 (1Н, с.), 7,44 (1Н, т.), 7,60 (1Н, т.), 7,80 (1Н, д. , J= 10,2), 8,0 (1Н, д., J=10,2), 8,19 (1Н, с.); ¹³C ЯМР: 27,3, 28,9, 56,5, 56,6, 106,2, 110,7, 125,2, 125,5, 127,6, 127,8, 131,2, 132,4, 133,7, 133,9, 134,2, 136,3, 151,3, 153,6, 157,8; HRMS вычислено для C₁₉H₁₇NO₂: 291,1259; найдено: 291,1246.

5,6-Дигидро-9,10-диметокси-3,4-метилендиоксибенз[а] акридин (13e). Получен из 1-(2"-нитро-4",5"-диметоксибензилидин)-5,6-метилендиокси-2-тетралона; точка плавления 220-222^oC; ИК (нуйол): 1715, 1532; ¹H ЯМР: 3,02 (2Н, т. ), 3,19 (2Н, т.), 4,02 (3Н, с.), 4,03 (3Н, с.), 6,03 (2Н, с.), 6,83 (1Н, д. , J= 8,1), 7,07 (1Н, с.), 7,34-7,38 (2Н, м.), 8,19 (1Н, с.); ¹³C ЯМР: 30,2, 32,3, 56,5, 56,6, 101,8 105,8 107,5 107,8 117,9 119,2 123,8, 126,9 128,3 128,7, 143,2 145,4 147,6 149,9 152,7, 156,3; Анал. (C₂₀H₁₇NO₄) C, H, N.

5,6-Дигидро-3,4,9,10-тетраметоксибенз[а] акридин (13f). Получен из 1-(2"-нитро-4", 5"-диметоксибензилидин)-5,6- диметокси-2-тетралона; точка плавления 195-196^oC; ИК (нуйол): 1730, 1515; ¹H ЯМР: 2,82 (2Н, т.), 3,20 (2Н, т. ), 3,86 (3Н, с.), 3,91 (3Н, с.), 4,03 (3Н, с.), 4,04 (3Н, с.), 6,93 (1Н, д. , J=8,6), 7,10 (1Н, с.), 7,52 (1Н, с.), 7,56 (1H, д., J=8,6), 8,27 (1H, с. ); ¹³C ЯМР: 21,8, 31,6, 56,4, 56,6, 56,8, 61,1, 105,8, 106,4, 106,5, 107,6, 111,4, 111,9, 120,4, 124,1, 127,1, 129,3, 131,6, 150,3, 150,4, 153,4, 156,3. Анал. (C₂₁H₂₁NO₄) C, H, N.

2-Амино-9,10-диметокси-5,6-дигидробенз[а]акридин (фигура 3, 20). Получен из 1-(2"-нитро-4",5"-диметоксибензилиден)-7- нитро-2-тетралона; точка плавления 185^oC; ИК(нуйол): 3345, 2895, 1330; ¹H ЯМР (CD₃DO): 2,96 (2Н, т.), 3,36 (2Н, т.), 3,98 (3Н, с.), 4,02 (3Н, с.), 7,24 (1H, д., J=10,0), 7,32-7,38 (2H, м.), 7,88 (1H, с.), 8,17 (2H, с.); ¹³C ЯМР: (CD₃DO): 24,5, 27,7, 57,0, 57,1, 99,4, 107,9, 117,1, 121,9, 123,2, 125,9, 128,9, 130,1, 133,2; HRMS вычислено для C₁₉H₁₈N₂O₂: 306,1369; найдено 306,1369.

3-Хлор-9,10-диметокси-5,6-дигидробенз[а] акридин (13j). Получен из 1-(2"-нитро-4", 5"-диметоксибензилиден)-6-хлор-2- тетралона; точка плавления 197^oC; ИК (нуйол): 2895, 1105; ¹H ЯМР: 2,96 (2Н, т.), 3,12 (2Н, т.), 3,97 (3Н, с.), 3,98 (3Н, 2 с.), 7,00 (1Н, с.), 7,20-7,26 (2Н, м.), 7,32 (1Н, с.), 7,64 (1Н, д. , J= 8,1), 8,11 (1Н, с.); ¹³C ЯМР: 29,1, 32,6, 56,5, 56,6, 105,8, 107,8, 123,6, 125,6, 125,8, 127,7, 128,6, 128,8, 132,3, 133,9, 139,3, 144,4, 150,0, 153,0 156,6; HRMS вычислено C₁₉H₁₆CINO₂: 325,0869; найдено: 325,0887.

ПРИМЕР IV - Общая процедура синтеза бенз[а]акридинов и бенз[с]акридинов из их 5,6-дигидро-производных (фигура 2).

Соответствующие производные 5,6-дигидробенз[а] акридина или 5,6-дигидробенз[с] акридина (0,22 ммоль) нагревались с обратным холодильником в 15 мл декалина с 76 мг 10%-ного палладия на угле, в атмосфере азота в течение 2-9 часов. 3атем реакционная смесь быстро, пока она еще была горячей, фильтровалась с отсасыванием через слой целита с использованием воронки из спекшегося стекла. Фильтровальный слой тщательно промывался трижды 20-миллилитровыми порциями кипящего хлороформа, а затем двумя 20 мл порциями кипящего этилацетата. Объединенный фильтрат затем концентрировался под вакуумом и сушился под вакуумом, давая соответствующие производные бенз[а]акридина.

2,3,9,10-Тетраметокси-7-метилбенз[с] акридин (фигура 1, 7). Получен из соединения 6; точка плавления > 250^oC; ИК (нуйол): 3520, 1633, 1610; ¹H ЯМР: 2,87 (3Н, с.), 4,03 (3Н, с.), 4,04 (3Н, с.), 4,13 (3Н, с.), 4,23 (3Н, с.), 7,17 (1Н, с.), 7,20 (1Н, с.), 7,52 (1Н, д., J=9,2), 7,59 (1Н, с.), 7,80 (1Н, д., Т=9,2), 8,87 (1Н, с.); ¹³C ЯМР: 14,4, 56,4, 56,7, 101,7, 106,0, 108,2, 108,3 120,8, 122,1, 122,4, 125,5, 125,8, 126,9, 128,6, 135,7, 139,0, 145,2, 149,8, 150,9, 153,3; HRMS вычислено для C₂₂H₂₁NO₄: 363,1470; найдено: 363,1472.

2,3,9,10-Тетраметоксибенз[а] акридин (14а). Получен из соединения 13а; точка плавления 247-249^oC; ИК (нуйол): 2810, 1630; ¹H ЯМР: 3,99 (3Н, с.), 4,01 (3Н, с.), 4,03 (3Н, с.), 4,08 (3Н, с.), 7,08 (1Н, с.), 7,12 (1Н, с.), 7,41 (1Н, с.), 7,74 (1Н, д., J=9,3), 7,81 (2Н, м.) 8,82 (1Н, с.); ¹³C ЯМР: 56,3, 56,4, 56,5, 56,6, 103,9, 104,8, 106,8, 109,2, 122,8, 123,0, 124,5, 126,2, 126,4, 127,7, 130,7, 145,7, 147,2, 149,8, 149,9, 150,3, 153,9; HRMS вычислено для C₂₁H₁₉NO₄: 349,1314; найдено: 349,1314.

2,3-Диметокси-9,10-метилендиоксибенз[а]акридин (14b).

Получен из соединения 13b; точка плавления 245-246^oC; ИК (нуйол): 2790, 1630; ¹H ЯМР: 4,06 (3Н, с.), 4,16 (3Н, с.), 6,15 (2Н, с.), 7,25 (2Н, с.), 7,48 (1Н, с.), 7,84 (1Н, д., J=8,2), 7,99 (1Н, с.), 8,99 (1Н, с.); ¹³C ЯМР: 56,5, 56,6, 102,3, 102,4, 104,1, 104,9, 109,4, 112,8, 122,9, 124,4, 126,5, 126,7, 128,5, 130,9, 135,7, 147,0, 147,4 148,4, 150,1; 152,0; HRMS вычислено для C₂₀H₁₅NO₄: 333,1002; найдено 333,1004.

9,10-Диметоксибенз[а] акридин (14с). Получен из соединения 13с; точка плавления 181-182^oC, ИК(нуйол): 2883, 1621; ¹H ЯМР: 4,09 (6Н, с.), 7,26 (1Н, с. ), 7,54 (1Н, с.), 7,60-7,71 (2Н, м.), 7,89-7,96 (3Н, м.), 8,69 (1Н, д., J=8,1), 9,23 (1Н, с.); ¹³C ЯМР: 56,6, 56,7 105,1, 107,1, 122,9, 123,3, 123,4, 125,5, 127,6, 128,5, 128,7, 129,3, 130,4, 131,5, 131,6, 135,7, 146,4, 148,0, 150,6, 154,3. HRMS вычислено для C₁₉H₁₇NO₂: 289,1104; найдено: 289,1104.

2,3-Диметоксибенз[а] акридин (14d). Получен из соединения 13d; точка плавления 190-192^oC, ИК(нуйол): 2881, 1632; ¹H ЯМР: 4,02 (3Н, с.), 4,13 (3Н, с. ), 7,18 (1Н, с.), 7,51-7,59 (1Н, м.), 7,72-7,81 (1Н, м.), 7,83 (1Н, с.), 7,89 (1Н, с.), 7,93-8,22 (2Н, м.), 8,23 (1Н, д., J=8,5), 9,13 (1Н, с.); ¹³C ЯМР: 56,5, 56,6, 104,4, 109,5, 124,2, 124,5, 126,3, 126,4, 126,8, 126,9, 128,5, 129,4, 130,0, 130,1, 130,2, 132,3, 148,1, 149,2, 150,1, 150,2; HRMS вычислено для C₁₉H₁₅NO₂: 289,1104; найдено 289,1099.

3-Хлор-9,10-диметоксибенз[а] акридин (14j). Получен из соединения 13j; точка плавления 241-243^oC; ИК (нуйол): 2893, 1108; ¹H ЯМР: 4,04 (3Н, с.), 4,06 (3Н, с. ), 7,09 (1Н, с.), 7,43 (1Н, с.), 7,51-7,57 (1Н, дд., J=8,8, 2,2), 7,68 (1H, д., J=9,1), 7,75 (1H, д., J=2,2), 7,90 (1H, д., J=9,1), 8,42 (1H, д., J=8,8), 8,92 (1H, с.); ¹³C ЯМР: 56,6, 56,7, 104,9, 106,9, 122,7, 123,3, 124,3, 127,8, 128,2, 128,3, 128,6, 129,7, 130,2, 132,5, 133,2, 146,4, 147,4, 150,7, 154,4; HRMS вычислено для C₁₉H₁₄CINO₂: 323,0713, найдено 323,0713.

ПРИМЕР V - Общая процедура N-метилирования бенз[а]акридинов и бенз[с] акридинов

Диметилсульфат (4 мл) добавлялся к 0,27 ммоль соответствующего бенз[а] акридина или бенз[с] акридина и эта смесь нагревалась в атмосфере азота на масляной бане при 150^oC в течение от 20 минут до 5 часов. К реакционной смеси добавлялся безводный этиловый эфир (10 мл) при интенсивном перемешивании, после чего смесь охлаждалась до комнатной температуры. Выпавшая в осадок четвертичная соль фильтровалась отсасыванием, трижды промывалась 10-миллилитровыми порциями этилового эфира и сушилась. Четвертичные соли кристаллизовались из кипящего метанола, с выходом 90%.

2,3,9,10-Тетраметокси-7,12-диметил-5,6-дигидро- бенз[с]акридиний метосульфат (фигура 1, 8). Получен из соединения 6, точка плавления > 250^oC; ИК (нуйол): 3510, 1645, 1613; ¹H ЯМР (CD₃OD): 2,90 (3Н, с.), 2,96 (2Н, т.), 3,08 (2Н, т.), 3,93 (3Н, с.), 4,00 (3Н, с.), 4,10 (3Н, с.), 4,18 (3Н, с.), 4,62 (3Н, с.), 7,17 (1H, с.), 7,42 (1H, с.), 7,61 (1H, с.), 7,63 (1H, с.), ¹³C ЯМР: 16,6, 27,2, 29,0, 46,2, 57,0, 57,2, 57,3, 57,4, 100,7, 105,5, 112,5, 115,2, 121,2, 125,1, 133,4 138,5, 139,7 149,7 150,5, 152,7 152,9 154,8, 157,4; HRMS вычислено для C₂₃H₂₆NO₄+: 380,1858; найдено 308,1856.

2,3,9,10-Тетраметокси-7,12-диметилбенз[с] акридиний метосульфат (фигура 1, 9). Получен из соединения 7, точка плавления > 240^oC; ИК (нуйол): 3495, 1640, 1615; ¹H ЯМР (DMSO-d₆): 2,53 (3Н, с.), 3,39 (3Н, с.), 3,97 (3Н, с.), 4,03 (3Н, с. ), 4,16 (3Н, с.), 4,17 (3Н, с.), 7,69 (1Н, с.) 7,75 (1Н, с.), 7,91 (1Н, с.), 7,99 (1Н, д., J=9,5), 8,24 (1Н, д., J=9,5); ¹³C ЯМР: 15,5, 55,4, 56,4, 56,5, 56,6, 56,7, 102,1, 106,3, 110,3, 111,2, 125,8, 123,2, 122,5, 128,8, 129,0, 130,9, 133,3, 139,0, 141,1, 147,6, 152,1, 153,8, 155,3; HRMS вычислено для C₂₃H₂₄NO₄+: 378,1698; найдено: 378,1695.

2,3,9,10-Тетраметокси-7-метил-5,6-дигидробенз[а] акридиний метосульфат (15а). Получен из соединения 13а; точка плавления > 250^oC; ИК (нуйол): 3490, 1620; ¹H ЯМР (DMCO-d₆): 3,06 (2Н, т.), 3,37 (5Н, т.), 3,85 (3Н, с.), 3,93 (3Н, с. ), 4,02 (3Н, с.), 4,05 (3Н, с.), 7,04 (1Н, с.), 7,45 (1Н, с.), 7,62 (1Н, с. ), 7,63 (1Н, с.), 9,29 (1Н, с.); ¹³C ЯМР: 25,9, 27,8, 53,1, 56,0, 56,1, 56,7, 56,8, 99,6, 106,6, 106,7, 107,9, 112,2, 112,3, 122,0, 124,4, 127,3, 129,1, 148,8, 150,3, 151,1, 153,0, 155,3; HRMS вычислено для C₂₂H₂₄NO₄+: 366,1706; найдено: 366,1706.

2,3,9,10-Тетраметокси-7-метилбенз[а]акридиний метосульфат (16а). Получен из соединения 14а, точка плавления > 250^oC, ИК (нуйол): 2820, 1620; ¹H ЯМР (ДМСО-d₆): 3,39 (3Н, с.), 3,96 (3Н, с.), 3,97 (3Н, с.), 4,03 (3Н, с.), 4,07 (3Н, с.), 7,59 (1Н, с.), 7,67 (1Н, с.), 7,85 (1Н, д., J=9,2), 8,25 (1Н, с. ), 8,31 (1H, д., J=9,2), 8,75 (1Н, с.), 10,18 (1H, с.); ¹³C ЯМР: 54,4, 56,8, 56,9, 57,5, 57,9, 105,7, 106,7, 107,9, 110,4, 123,2, 125,3, 125,4, 127,8, 127,9, 128,3, 131,4, 146,8, 149,3, 152,0, 158,5, 159,9; HRMS вычислено для C₂₂H₂₂NO₄+: 364,1549; найдено: 364,1542.

ПРИМЕР VI - Общая процедура для синтеза 2,3,9,10-тетрагидрокси-5,6-дигидробенз[а]акридина (фигура 2, 13g) и 2,3,9,10-тетрагидроксибенз[а]акридина (фигура 2, 14g).

Соответствующие производные бенз[а]акридина (0,195 ммоль) растворялись в 2 мл CH₂Cl₂ и раствор охлаждался до -50^oC, с использованием охлаждающей ванны с изопропанолом и сухим льдом. Добавлялось 1,95 ммоль раствора трибромида бора (1,0 М) в CH₂Cl₂ в атмосфере азота. Реакционная смесь перемешивалась при -50^oC в течение часа, а затем ей дали медленно подогреться до комнатной температуры в течение 4 часов. Затем реакционную смесь охлаждали до -10^oC и гасили добавлением 5 мл насыщенного раствора хлорида аммония. Полученный раствор упаривался досуха, а полученный остаток трижды экстрагировался 20-мл порциями кипящего ацетона. Получаемые в результате желтые суспензии каждый раз

отфильтровывались. Нерастворившийся осадок растворялся в 5 мл кипящего метанола и оставлялся на ночь. Образовались игольчатые кристаллы соответствующих тетрагидроксибенз[а]акридинов с выходом 95%.

2,3,9,10-Тетрагидрокси-5,6-дигидробенз[а]акридин (13g). Получен из соединения 13а; точка плавления > 220^oC; ИК (нуйол): 3361, 3164, 2719, 1620; ¹H ЯМР (CD₃OD): 2,97 (2Н, т.), 3,35 (2Н, т.), 6,77 (1Н, с.), 7,45 (3Н, м.), 8,83 (1H, с. ); ¹³C ЯМР (CD₃OD): 27,4, 29,2, 102,9, 110,9, 112,5, 116,6, 122,9, 126,5, 128,5, 129,4, 134,8, 135,6, 146,6, 148,6, 151,1, 152,9, 156,0; HRMS вычислено для C₁₇H₁₃NO₄: 295,0845; найдено: 295,0842.

2,3,9,10-Тетрагидроксибенз[а] акридин (14g). Получен из соединения 14а; точка плавления > 270^oC; ИК (KBr): 3361, 3164, 1620, 1516; ¹H ЯМР (CD₃OD): 7,26 (1H, с.), 7,37 (1H, с.), 7,56 (1H, с.), 7,61 (1H, д., J=9,2), 8,05 (2Н, м. ), 9,61 (1H, с.); ¹³C ЯМР (CD₃OD): 101,1, 108,7, 110,3, 114,3, 114,7, 122,9, 124,4, 124,8, 126,7, 137,6, 137,8, 138,3, 139,0, 149,4, 150,7, 150,8, 159,3; HRMS вычислено для C₁₇H₁₁NO₄: 293,0688; найдено: 293,0685.

ПРИМЕР VII - Синтез 7-нитро-2-тетралона из 7-нитро-1-тетралона (фигура 3).

7-Нитро-1,2,3,4-тетрагидро-1-нафталинол. К суспензии из 2,88 г (15 ммоль) 7-нитро-1-тетралона в 60 мл абсолютного этанола добавлялось 0,58 г (15 ммоль) боргидрида натрия. 3атем реакционная смесь перемешивалась при комнатной температуре в течение 2 часов. Полученная смесь подвергалась ротационному выпариванию досуха, а остаток суспендировался в 100 мл воды. Добавлялась по каплям 3N соляная кислота, до тех пор, пока показатель pH смеси не составил 7. Полученная суспензия затем экстрагировалась пятью 50-мл порциями этилового эфира и объединенный эфирный слой затем промывался один раз водой (100 мл). Эфирный слой сушился над безводным сульфатом натрия, фильтровался и подвергался ротационному выпариванию, давая не совсем белый остаток, который перекристаллизовывался из смеси (1:1) абсолютного этанола и воды, давая 2,68 г (92%) нафталинола; точка плавления 112-113^oC; ИК (KBr): 3300; ¹H ЯМР: 1,73-2,26 (4Н, м.), 2,29 (1Н, с.), 2,78-2,91 (2Н, с.), 4,83 (1Н, м.), 7,24 (1Н, д. , J=8,1), 8,00-8,04 (1Н, д.д., J=8,1, 2,4), 8,35 (1Н, д., J= 2,4); ¹³C ЯМР: 19,2, 29,9, 32,5, 68,3, 122,7, 124,1, 130,3, 140,9, 145,4.

7-Нитро-3,4-дигидронафталин. Смесь 2,89 г (14,9 ммоль) 1-нафталинола, 3,5 г катионообменной смолы Амберлист-15 и 120 мл бензола нагревалась в колбе с обратным холодильником в атмосфере азота в течение 2 часов. 3атем реакционную смесь охлаждалась при комнатной температуре и сушилась с использованием безводного сульфата натрия и фильтровалась. 3атем фильтрат подвергался ротационному выпариванию досуха, давая продукт в виде масла с выходом 92%. Продукт был достаточно чистым и использовался на следующей стадии без дальнейшей очистки; ИК (KBr): 1545; ¹H ЯМР: 2,25-2,36 (2Н, м.), 2,77-2,86 (2Н, т.), 6,08-6,17 (1Н, м.), 6,40-6,45 (1Н, м.), 7,14 (1Н, д., J= 8,1), 7,72 (1Н, д. , J=2,3), 7,83-7,89 (1Н, д.д., J=8,1, 2,3); ¹³C ЯМР: 23,0, 27,9, 120,6, 122,1, 126,7, 128,6, 131,9, 135,6, 143,5, 147,3.

1,2-Эпoкcи-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидронафталин. К раствору 0,5 г (2,85 ммоль) 7-нитро-3,4-дигидронафталина в 9 мл хлороформа добавлялось 0,677 г m-хлорпероксибензойной кислоты одной порцией. Полученный раствор нагревался в колбе с обратным холодильником в течение 45 минут. 3атем смесь охлаждалась до 0^oC и выпавшая в осадок m-хлорбензойная кислота удалялась фильтрованием. Хлороформный слой подвергался ротационному выпариванию, давая бледно-желтое твердое вещество, которое хроматографировалось на силикагеле (50 г) и элюировалось дихлорометаном. Соответствующие фракции объединялись и подвергались ротационному выпариванию, давая 0,487 г (89,5%) эпоксида; точка плавления 73-74^oC, ИК (KBr): 3300; ¹H ЯМР: 1,70-1,86 (1Н, м.), 2,42-2,52 (1H, м. ), 2,54-2,90 (2Н, м. ), 3,75-3,77 (1H, т.), 3,91-3,93 (1Н, д., J=4,2), 7,22-7,26 (1H, д., J= 8,4), 8,05-8,11 (1H, д.д., J=8,4, 2,4), 8,24 (1H, д., J= 2,4); ¹³C ЯМР: 21,6, 25,1, 52,3, 55,2, 123,8, 124,8, 129,8, 134,9, 145,0.

7-Нитро-2-тетралон. К раствору 0,5 г (2,6 ммоль) вышеописанного эпоксида в 5 мл сухого бензола добавлялось 0,37 г (1,1 ммоль) безводного иодида цинка. Смесь перемешивалась при комнатной температуре в атмосфере азота, в темноте. После фильтрации и удаления растворителя при пониженном давлении полученное желтое масло бралось в 3 мл абсолютного этанола, когда продукт кристаллизовался. Повторная кристаллизация из концентрированного маточного раствора давала общий выход 0,415 г (83%); точка плавления 96-97^oC; ИК (KBr): 1710, 1330, 1500; ¹H ЯМР: 2,59-2,66 (2Н, т.), 3,15-3,21 (2Н, т.), 3,72 (2Н, с. ), 7,38-7,43 (1H, д., J=8,3), 7,98 (1H, д., J=2,2), 8,02-8,03 (1H, д.д., J=8,3, 2,2).

ПРИМЕР VIII - Анализы - Материалы.

Плазмида pET11a и штамм E.coli BL21(DE3), использовавшиеся для экспресии ферментов, закупались у фирмы Новаген. IPTG закупался у компании Сигма. Система ECL, использовавшаяся для анализа вестерн-блотирования бактериальных лизатов, поставлялась фирмой Амершем (Великобритания). Все рестрикционные ферменты и Vent-полимераза были получены из Нью Инглэнд Биолэбз. Топоизомераза II млекопитающих изолировалась из тимуса теленка, в соответствии с опубликованной процедурой (Halligan et al., J. Biol. Chem. 260: 2475-2482 (1985)). Однокопийные плазмиды дрожжей YCpGAL1, экспрессирующие различные гены топоизомеразы I в штамме дрожжей JN2-134, любезно предоставлена д-ром М. -А. Бьорнсти (Университет Томаса Джефферсона, Филадельфия, РА). Все среды для культивирования бактерий и дрожжей были получены из фирмы Дифко (Детройт, МI), а среды для культивирования клеток закупались в компании Гибко-БРЛ (Гейтерсберг, MD).

ПРИМЕР IX - Экспрессия топоизомеразы I E.coli.

Чтобы получить большое количество человеческой топоизомеразы I, кДНК (комплементарная ДНК) человеческой топоизомеразы I клонировалась в вектор pET-11a, в котором транскрипция кДНК находится под контролем индуцируемого промотора Т7 (Studier et al., Methods in Enzymol., Vol. 185:60-89, San Diego: Academic Press (1990)). Кратко говоря, 3,4 кб фрагмента ДНК, содержащего всю кодирующую последовательность человеческой топоизомеразы I, и приблизительно 1 кб нетранслированного участка, расположенного ниже терминирующего кодона, изолировались из плазмиды YCpGAL1-hTOP1 (Bjornsti et al., Cancer Res. 49:6318-6323 (1989)) путем разрезания по сайтам BamHI и EcoRI. Вектор pET-11a вырезался с помощью тех же рестрикционных ферментов, дефосфорилировался и сшивался со вставкой в соответствующей рамке считывания ниже сайта клонирования вектора. Ангирующая смесь использовалась для трансформации E. coli, изолировался правильный клон pET1B и его идентичность подтверждалась с помощью рестрикционного картирования. Поскольку запуск трансляции в рЕТ расположен кверху от сайта Ndel, экспрессированная топоизомераза I имеет 15-аминокислотное слияние в своем N-конце. 3атем pET1B трансформировалась в BL21(DE3) E.coli, и после индукции 0,4 мМ IPTG в течение 1 часа, бактериальный лизат проанализировался с помощью 10%-ного SDS-PAGE. Экспрессия подтверждалась с помощью вестерн-блотирования, с использованием антител кролика против топоизомеразы I человека. Выделение экспрессированного белка выполнялось с помощью простой процедуры. Кратко говоря, клетки E.coli лизировались с помощью повторных ультразвуковых ударов. Получение экстракта под воздействием ультразвука проводили в 1M NaCl и 6%-ном полиэтиленгликоле (PEG) для удаления нуклеиновых кислот. Надосадочную жидкость PEG подвергли хроматографии непосредственно на гидроксиапатитовой колонке. Экспрессированная топоизомераза I ДНК человека элюировалась на стадии с 0,6 М фосфата калия. Элюированный фермент затем подвергался диализу против 50%-ного глицерина, 30 мМ фосфата калия (pH 7,0), 1 мМ дитиотрейта (ДТТ) и 0,1 мМ ЭДТА и хранился при температуре -20^oC. Релаксационная активность очищенного фермента имела удельную активность примерно на 2 порядка ниже, чем топоизомераза I тимуса теленка.

ПРИМЕР Х - Экспрессия камптотецин-устойчивой (СРТ-К5) топоизомеразы I в E.coli.

Синтезировались два комплементарных олигонуклеотида, содержащих точечную мутацию CAG (Asp533)- > CGG(Gly), ответственную за фенотип устойчивости у СРТ-5, и с помощью методов генетической инженерии включались в последовательность, кодирующую топоизомеразу 1, с использованием метода PCR (Current Protocols in Molecular Biology, в публикации Ausubel et al. (eds.),. Vol.1, стр. 8, 5, 7. Boston: Wiley Interscience (1991)). Двумя нуклеотидами являются: 5"-CTTCCTCGGGAAGGGCTCCATCAGATAC-3" (праймер XI) (идентификационный N последовательности: 1) и 5"-GTATCTGATGGAGCCCTTCCCGAGGAAG-3" (праймер X2) (идентификационный номер последовательности: 2), где подчеркнутая последовательность представляет собой мутированный кодон. Каждый олигонуклеотид использовался в отдельных реакциях PCR, для амплификации двух сегментов ДНК, соседних с сайтом мутации, с использованием олигонуклеотидов 5"-ACTGTGATCCTAGGG-3" ("A") (идентификационный номер последовательности: 3) и 5"-CTTCATCGACAAGCTTGCTCTGAG-3" ("H") (идентификационный номер последовательности: 4) в качестве родственных праймерных пар для X1 и Х2, соответственно. "А" и "H" комплементарны к последовательности человеческой топоизомеразы I, вокруг уникальных рестрикционных сайтов AvrII и HindIII. После первого раунда PCR два амплифицированных продукта - Х1-Н и Х2-А - денатурировались и гибридизировались с помощью их комплементарной последовательности из 15 пар оснований, благодаря перекрыванию олигонуклеотидов X1 и Х2. Этот короткий фрагмент секвенирования сегмента двунитевой ДНК затем увеличивался с помощью Vent-полимеразы при 72^oC в течение 2 минут в продукт А-Н, имеющий полную длину в 748 пар оснований. Два внешних праймера, "А" и "Н", затем использовались для амплификации фрагмента ДНК полной длины, содержащего мутированный фрагмент топоизомеразы I. 3атем кДНК амплифицированной мутантной топоизомеразы I разлагали с помощью AvrII и HindIII и клонировалась в pET1B с помощью замены соответствующего фрагмента AvrII/HindIII в последовательности кДНК топоизомеразы I. Плазмида pET1B-CPTK-5, которая содержала кДНК мутантной топоизомеразы I СРТ-К5, вместо кДНК человеческой топоизомеразы I дикого типа, трансформировалась в BL21 (DE3) E.coli, для экспрессии. После индукции посредством IPTG наличие белка в лизатах подтверждалось с помощью вестерн-блотирования. Топоизомераза I СРТ-К5 затем очищалась от бактериального лизата, как описано для фермента дикого типа.

ПРИМЕР XI - Анализ расщепления топоизомеразы I и топоизомеразы II.

Анализы расщепления рекомбинантных топоизомераз I и топоизомераз I и II тимуса теленка проводились, как описано (Liu et al., J.Biol.Chem.258: 15365-15370 (1983)). ДНК плазмиды YEpG, использованной для анализов расщепления, получалась и маркировалась на ее 3"-конце, с помощью опубликованных методик.

ПРИМЕР XII - Анализ цитотоксичности дрожжей.

Установлено, что дрожжи могут выжить, когда функция топоизомеразы I стерта, и что яды топоизомеразой I убивают только клетки, имеющие функциональную топоизомеразу I (Bjornsti et al. Cancer Res. 49: 6318-6323 (1989)). Таким образом, сравнение относительных размеров прироста каждого из испытуемых штаммов в присутствии различных лекарств, с контрольными вариантами, в которых лекарство отсутствует, показывает: 1) оказывает ли данное лекарство какое-либо цитотоксическое влияние на дрожжи, 2) является ли эта цитотоксичность топоизомераза I-специфичной, 3) имеется ли какая-либо дифференциальная специфичность данного лекарства для дрожжей, по сравнению с топоизомеразой I человека.

Анализ на топоизомераза I-специфичную цитотоксичность in vivo адаптировался на основе методики Кнаба и др. (Knab et al., J. Biol. Chem. 268: 22322-22330 (1993)). В данной системе различные гены топоизомеразы I, клонированные в вектор однокопийной плазмиды дрожжей, YCpGAL1 (Knab et al., J. Biol. Chem. 268: 22322-22330 (1993)), экспрессируются под контролем промотора GAL1 в штамме JN2-134 дрожжей S. cerevisiae (МАТа, rad52::LEU2, trp1, ade2-1, his7, ura3-52, ise1, top1-1, leu2) (Bjornsti et al. Cancer Res. 49: 6318-6323(1989)). Топоизомеразы I, которые встраиваются в вектор, являются, соответственно, топоизомеразой I дрожжей дикого типа (YCpGAL-ScTOP1), нефункциональной топоизомеразой дрожжей 1, в которой активный сайт тирозин-727 в результате мутации превратился в фенилаланин (YCpGAL 1-Sctop1Y727F) (Knab et al. , J. Biol. Chem. 268: 22322-22330 (1993)), и человеческой топоизомеразой I дикого типа (YCpGAL-hTOP1) (Bjornsti et al., Cancer Res. 49: 6318-6323 (1989)). Для качественного анализа цитотоксичности и топоизомераза I-специфичности лекарств, клетки дрожжей, содержащие специфическую плазмиду, серийно разбавлялись (в 5 раз) и выращивались в раскапанной среде с добавкой урацила и 2% галактозы. Кроме того, планшеты, предназначенные для положительного и отрицательного контроля, содержали: A: Контроль - без лекарства; B: Камптотецин (СРТ), 0,5 мкМ, C: Коралин, 1 мкМ; D: Метилендиокси-дигидро-деметил- коралин (MDD-коралин), 1 мкМ; и E: Нитидин, 1 мкМ. Планшеты культивировали в течение 3 дней при 30^oC для анализа летального эффекта разных соединений и испытуемого лекарства на различные ферменты топоизомеразы I, экспрессированные в S.cerevisiae.

ПРИМЕР XIII - Анализ цитотоксичности.

Ингибирующую концентрацию ИК₅₀ испытуемых лекарств определяли с помощью тетразолиниевого метода анализа цитотоксичности в МТТ-микротитровых планшетах (метод МТА). (Mosmann, Т., J Immunol. Methods, 65:55-63 (1983); Denizot et al., J. Immunol. Methods 89: 271-277 (1986). Клетки лимфобластов человека RPMI 8402 и их камптотецин-устойчивые клетки СРТ-К5 (Andoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5565-5569 (1987)) были любезно предоставлены д-ром Тосиво Андо (Центральный научно-исследовательский институт рака Аити, Нагойя, Япония). Клеточная линия А2780 и устойчивое к камптотецину производное СРТ-2000 были щедрым даром д-ра Jaulang Hwang (Институт молекулярной биологии. Академия наук, Тайвань). Клетки (по 2000 клеток на лунку, высеянные в 200 мл ростовой среды) выращивали суспензии при 37^oC в атмосфере 5% CO₂ и поддерживали путем регулярного пассирования в среду RPMI с добавкой 10% инактивированной теплом фетальной бычьей сыворотки, L-глютамина (2 мМ), пенициллина (100 Е/мл) и стрептомицина (0,1 мг/мл). Клетки в течение 4 суток постоянно подвергались воздействию концентраций лекарства в диапазоне от 100 мкг/мл до 1,0 нг/мл в 10-кратных разбавлениях и анализировались в конце четвертых суток. Каждая концентрация и контроль (без лекарств) повторялись, по крайней мере, дважды, по 6 лунок в каждой повторности. Результаты наносились на график и затем измерялась ИК₅₀. Чувствительная к лекарству клеточная линия эпидермоидной карциномы человека - линия KB 3-1 - и ее отселектированный с помощью винбластина вариант с множественной устойчивостью к лекарствам - клеточная линия KB-VI (Akiyama et al. Genetics 11: 117-126 (1985)) были любезно предоставлены д-ром Микаэлом Готтсманном (Национальный институт рака). Их выращивали в виде однослойных культур при 37^oC в атмосфере 5% CO₂ и поддерживали путем регулярного пассирования в минимальной основной среде Дульбекко, с добавкой 10% инактивированной повышенной температурой фетальной бычьей сыворотки. Клетки KB-VI поддерживали в присутствии 1 мг/мл винбластина.

Таблицы 1, 2, перечень последовательностей и рецептуры приведены в конце описания.