способ получения уриказы

Формула изобретения

1. Способ получения уриказы, включающий измельчение исходного сырья, отделение примесных белков, экстракцию фермента, отделение осадка центрифугированием, осаждение уриказы из надосадочной жидкости сульфатом аммония, растворение образовавшегося осадка водным раствором карбоната натрия и последующую очистку целевого продукта, отличающийся тем, что экстракцию фермента проводят водой при pH 10,0 - 10,5 в присутствии неионного детергента в концентрации 0,8 - 1,5% в течение не менее 14 ч при 20 - 25^oC, осаждают уриказу 9,5 - 11%-ным сульфатом аммония, а очистку целевого продукта осуществляют переосаждением сульфатом аммония при конечной концентрации последнего в растворе 9,5 - 11%.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что неионный детергент выбирают из группы полиоксиэтилированных алкилфенолов.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве неионного детергента используют АФ 9-12.5

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биохимии, а именно к способам получения ферментов из животного сырья.

Получаемые препараты могут быть использованы для работ в области биохимии, при изучении свойств уриказы, в области биохимического анализа, для ферментативного определения мочевой кислоты в биохимических жидкостях и в пищевых продуктах. Кроме того, уриказа может быть использована в технологии получения пищевых продуктов для удаления мочевой кислоты из них и в медицине в виде конъюгатов с полиэтиленгликолем для лечения подагры.

Известны различные способы получения уриказы из микробного сырья [Agr. Biol.Chem., v. 31, N 11, рр. 1256-1264, 1967; J. of chromatogr., v. 497, рр. 268-275, 1989]. Основным недостатком данных способов является то, что выращивание микроорганизмов необходимо проводить на среде, содержащей мочевую кислоту, а очистка фермента включает 2-3 стадии хроматографической очистки, в том числе и аффинной, что сильно удорожает и усложняет процесс.

Известны способы получения уриказы из печени различных животных: рыб, в частности форели [Comp. Biochem. Physiol., v. 82B, N4, рр. 621-624, 1985], крыс [Anal. Biochem., v. 89, рр. 343-347, 1978] и верблюда [Comp. Biochem. Physiol. , v. 94B, N3, рр. 469-474, 1989]. Недостатком данных способов является то, что источники сырья не пригодны для получения уриказы в больших количествах, технологии предусматривают использование дорогостоящих аффинных сорбентов или многократного скоростного центрифугирования, более 20000 g.

Ближайшим к заявляемому способу - прототипом является способ получения уриказы из печени свиньи [J. Biol. Chem. , v. 216, рр. 625-641, 1955], включающий следующие последовательные стадии: получение митохондрий, высушивание их ацетоном, экстракцию примесных белков 0,1М фосфатным буфером pH 7,8, центрифугирование при высоких скоростях, экстракцию уриказы из осадка 0,15% карбонатом натрия в течение 30 мин и последующее центрифугирование при высоких скоростях, осаждение сульфатом аммония, центрифугирование, гомогенизацию уриказы с водой, быстрое нагревание в течение 5 мин при 55-60^oC, быстрое охлаждение и центрифугирование, обработку супернатанта Ca-фосфатным гелем, центрифугирование, осаждение уриказы из надосадочной жидкости сульфатом аммония, центрифугирование и растворение фермента в 0,1М карбонате натрия.

После проведения этих стадий получают препарат уриказы с удельной активностью 2,0-8,0 ед. акт./мг белка (0,16-0,65 U/мг белка) и выходом 400-800 ед. акт. (32-65 U) из 100 г митохондрий.

Далее уриказу диализуют 12 ч против 0,02 М бикарбоната натрия, осадок фермента центрифугируют, суспендируют в 1% карбонате натрия, экстрагируют трет-бутиловым спиртом в течение 4-6 ч, замораживают при минус 12^oC ночь, оттаивают, центрифугируют при высоких скоростях.

После проведения этих стадий получают фермент с удельной активностью 20-40 ед.акт./мг белка (1,6-3,2 U/мг белка), выходом 400-500 ед. акт. (32-40 U) из 100 г митохондрий (43% от исходной активности).

Далее препарат уриказы диализуют 18-24 ч против 0,01 М трис-версенового буфера pH 8,1, центрифугируют на высоких скоростях, растворяют осадок в 1% карбонате натрия, фракционируют сульфатом аммония, центрифугируют, растворяют в 1% карбонате натрия и концентрируют 30-35% сульфатом аммония.

В результате получают высокоочищенную уриказу с удельной активностью 100-125 ед. акт. /мг белка (8,13-10,1 U/мг белка) и выходом по активности 150-275 ед.акт. (12,2-22 U) из 100 г митохондрий, что составляет 21% исходной активности в митохондриях. Поскольку выход сухих митохондрий из 1 кг печени (по данным тех же авторов) составляет 40-50 г, то выход уриказы из 1 кг печени составляет не более 6-11 U (где U - международная единица активности, 1 ед.акт. = 0,0813 U).

Недостатками способа-прототипа являются его многостадийность, использование органических растворителей (ацетон, трет-бутиловый спирт) и низкий выход целевого фермента. Кроме этого, быстрое нагревание и быстрое охлаждение делают процесс плохо воспроизводимым.

Технической задачей изобретения является упрощение способа и повышение выхода целевого фермента.

Поставленная цель достигается тем, что в водную суспензию уриказы, имеющую pH 10,0-10,5, добавляют неионный детергент, преимущественно неонол АФ_9-12 в концентрации 0,8-1,5%, выдерживают смесь не менее 14 ч при 20-25^oC и осаждают фермент при 9,5-11% насыщения сульфата аммония, образовавшийся осадок растворяют в 1% карбонате натрия pH 10,0-10,5 и повторно осаждают фермент при 9,5-11% насыщения сульфата аммония.

Предлагаемый способ включает следующие стадии:

1. Измельчение печени свиньи в мясорубке, перемешивание с 2-3 объемами воды в течение 40 мин и центрифугирование.

2. Суспендирование осадка в 2-3 объемах воды pH 5,0-5,5 в течение 30 мин и центрифугирование.

3. Растворение осадка в 2-3 объемах воды (от веса исходного сырья) при pH 10,0-10,5 в течение 1,5-2,5 ч и центрифугирование.

Выход активности на этой стадии принимают за 100%. Он составляет 800-1200 U из 1 кг печени. Удельная активность уриказы не превышает 0.002-0,003 U/мг белка.

4 4. Добавление в надосадочную жидкость неионного детергента, например неонола АФ_9-12, до 0,8-1,5%, выдерживание смеси не менее 14 ч при 20-25^oC, осаждение фермента при 9,5-11% насыщении сульфата аммония, центрифугирование.

5. Растворение осадка в 1% карбонате натрия pH 10,0-10,5 в течение 1 ч и центрифугирование.

На этой стадии получают препараты уриказы с удельной активностью 0,2-0,35 U/мг белка и выходом 60-65%, что составляет, в зависимости от содержания уриказы в исходном сырье, 500-750 U из 1 кг печени.

6. Осаждение уриказы из надосадочной жидкости при 9,5-11% насыщении сульфата аммония и центрифугирование.

7. Растворение осадка в 1% карбонате натрия pH 10,0-10,5 в течение 1,5-3,5 ч и центрифугирование.

На этой стадии получают препараты уриказы с удельной активностью 3,0-6,0 U/мг белка и выходом (от исходной активности) 50-60%, что составляет 500-650 U/кг печени. Препараты такого качества используют для изготовления наборов для определения мочевой кислоты.

Препараты уриказы, полученные на стадиях 5 и 7, стабильны в течение 4-5 месяцев при хранении в 1% карбонате натрия pH 10,0-10,5 и не теряют активности при лиофильной сушке.

Определяющими отличиями заявляемого способа от прототипа являются:

- экстракцию уриказы проводят водой при pH 10,0-10,5, что позволяет работать в отсутствии ионной силы и не вносить в смесь дополнительных реагентов, требующих последующей очистки целевого продукта. При pH раствора меньше 10,0 не обеспечивается полная экстракция уриказы, а при pH больше 10,5 может произойти инактивация фермента и соответственно уменьшение выхода последнего;

- экстракцию уриказы проводят в присутствии неионного детергента, преимущественно неонола АФ_9-12 в концентрации 0,8-1,5%, выдерживают смесь не менее 14 ч при 20-25^oC и осаждают при 9,5-11% насыщении сульфата аммония, что позволяет очистить уриказу в 100-130 раз за одну стадию, обеспечить выход 60-65% и существенно упростить способ. Преимущественное использование неонола АФ_9-12 в качестве неионного детергента обосновано доступностью последнего, так как на территории России освоено его тоннажное производство, и низкой ценой;

- уриказу переосаждают при 9,5-11% насыщении сульфата аммония, что позволяет увеличить степень очистки еще в 10-20 раз, а потери активности не превышают 5%.

Поиск и анализ источников известной научно-технической и патентной информации показал, что заявляемое техническое решение отвечает критериям изобретения "новизна и изобретательский уровень", так как аналогичного способа, имеющего существенные признаки, эквивалентные признакам заявляемого способа, не обнаружено.

Положительный эффект предлагаемого способа получения уриказы не был очевиден, так как использование неионного детергента, преимущественно неонола АФ_9-12, не описано для очистки уриказы из какого-либо источника. Механизм взаимодействия неионного детергента, преимущественно неонола АФ_9-12, и суспензии структур печени, содержащих уриказу, неизвестен, поэтому невозможно было предвидеть, что при обработке неонолом и дальнейшем осаждении сульфатом аммония произойдет очистка уриказы в 100-130 раз и будет получен фермент с выходом 60-65% и удельной активностью 0,2-0,3 5U/MF белка.

Например, использование другого неионного детергента синтанола не дало желаемого эффекта: уриказу получили с выходом 22% и удельной активностью 0,2-0,3 U/мг белка. Использование катионного детергента холевокислого натрия для обработки экстракта позволило получить уриказу с удельной активностью только 0,02 U/мг и выходом 40-50%. Катионные же детергенты додецилсульфат натрия и ДС-РАС в концентрациях 0,1-0,2% инактивируют уриказу полностью за 1-2 ч.

Таким образом, только использование неионного детергента, выбранного из группы полиоксиэтилированных алкилфенолов, преимущественно неонола АФ_9-12, в экспериментально подобранной, оптимальной концентрации 0,8-1,5% и определенном режиме, позволяет получить заявляемый технический результат.

Уменьшение концентрации детергента до 0,5% приводит к тому, что уриказа не осаждается из смеси ни 10%, ни 20% сульфатом аммония. Увеличение концентрации детергента до 2% не приводит к дальнейшему увеличению выхода фермента, поэтому экономически неоправданно. Уменьшение времени экстракции (менее 14 ч) и температуры обработки (менее 20^oC) приводит к уменьшению выхода фермента до 20-30%. Увеличение времени экстракции (более 20 ч) не приводит к дальнейшему повышению выхода фермента, поэтому нецелесообразно.

Изобретение иллюстрируется следующими конкретными примерами выполнения.

Пример 1. 1,5 кг печени пропускали через мясорубку, помещали в стеклянную емкость, вливали 4,5 л дистиллированной воды (температура 4-8^oC) и перемешивали 40 мин механической мешалкой. Смесь центрифугировали при 3000 об/мин 1 ч в центрифуге К-80. Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок суспендировали в 4,5 л воды при pH 5,5, перемешивали 30 мин механической мешалкой и смесь центрифугировали при 3000 об/мин 1 ч. Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок растворяли в 4,5 л холодной воды, доводили pH до 10,5 20% едким натрием, перемешивали механической мешалкой в течение 2 ч и центрифугировали при 3000 об/мин 1 ч. Осадок отбрасывали, в надосадочную жидкость добавляли раствор неонола АФ_9-12 до конечной концентрации 1%, перемешивали и выдерживали 16 ч при 22^oC. Затем всыпали сульфат аммония до 10% насыщения и выдерживали на холоде 6 ч. Смесь центрифугировали при 3000 об/мин 1 ч. Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок растворяли в 600 мл 1% карбоната натрия pH 10,5 в течение 1 ч при перемешивании и центрифугировали при 13000 об/мин 1 ч. Осадок отбрасывали.

В надосадочную жидкость добавляли сульфат аммония до конечной концентрации 10%, выдерживали ночь при 4-8^oC и центрифугировали при 13000 об/мин 1 ч. Надосадочную жидкость отбрасывали, осадок растворяли в 80 мл 1% карбоната натрия pH 10,5 при перемешивании 3 ч и центрифугировали при 13000 об/мин 1 ч. Осадок отбрасывали.

Надосадочную жидкость, содержащую уриказу, собирали в толстостенную стеклянную банку и хранили при 4-8^oC.

Выход фермента составляет 650U/кг печени, удельная активность уриказы - 6,02 U/мг белка.

Пример 2. Получение фермента проводили, как в примере 1, но pH суспензии осадка доводили до 10,0, добавляли неонол АФ_9-12 до 1,5%, смесь выдерживали 14 ч при 25^oC, а осаждение фермента проводили до 11% насыщения сульфатом аммония.

Выход фермента составил 550 U/кг печени, удельная активность уриказы - 4,0 U/мг белка.

Пример 3. Получение фермента проводили, как в примере 1, за исключением того, что в надосадочную жидкость добавляли неонол АФ_9-12 до конечной концентрации 0,8%, смесь перемешивали и выдерживали 22 ч при 25^oC, а осаждение и переосаждение уриказы осуществляли сульфатом аммония до 9,5% насыщения.

Выход фермента составил 580 U/кг печени, удельная активность уриказы - 5,1 U/мг белка.

Пример 4. Получение фермента проводили, как в примере 1, за исключением того, что в качестве неионного детергента использовали неонол АФ_9-12 до конечной концентрации 1%, смесь перемешивали и выдерживали 14 ч при 22^oC.

Выход фермента составил 500 U/кг печени, удельная активность уриказы - 4,0 U/мг белка.

Пример 5. Получение фермента проводили, как в примере 1, за исключением того, что в качестве неионного детергента использовали тритон Х-100 в концентрации 1%. Выход фермента составил 600 U/кг печени, удельная активность уриказы - 5,5 U/мг белка.

Использование предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, позволит:

- сократить длительность процесса;

- исключить из технологии длительные и плохо воспроизводимые стадии, такие, как быстрое прогревание реакционной смеси до 55-60^oC и быстрое охлаждение, две стадии диализа против бикарбоната натрия и трис-версенового буфера;

- повысить экологичность способа, исключив из процесса органические растворители: ацетон и трет-бутиловый спирт;

- повысить выход целевого продукта с 21 до 65% от исходной активности.