способ определения биологической активности препарата

Формула изобретения

Способ определения биологической активности препарата, включающий подготовку проб препарата, выращивание тестируемых клеток на питательной среде, подсчет живых клеток и сравнение их числа с числом в контроле в культурах без добавления препарата, отличающийся тем, что клетки выращивают на среде MEM с эмбриональной телячьей сывороткой до получения монослоя, затем среду культивирования удаляют и добавляют раствор трипсина, после чего в культуру добавляют раствор Версена и инкубируют при 37^oC в течение 10 мин, далее открепившиеся клетки собирают и отмывают 2 раза от раствора Версена путем центрифугирования и подсчитывают число живых клеток, после чего определяют уровень включения ³H-тимидина пролиферирующими клетками, при этом препарат считается обладающим биологической активностью, если степень подавления суммарного включения ³H-тимидина и/или адгезии составляет не менее 50% от контрольного уровня в культурах без добавления препарата.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано в биотехнологической и пищевой промышленности для оценки качества и биологической активности препаратов, изготовленных из растений, преимущественно чистотела большого (Chelidonium majus L.).

Известен способ определения биологической активности растительных клеток под действием неблагоприятных факторов [1].

Однако этот способ не позволяет определить противоопухолевую активность препарата, требует специального оборудования.

Известен также способ тестирования биологически активного препарата [2], который включает подготовку проб препарата, выращивание тестируемых клеток на питательной среде, подсчет живых клеток и сравнение с контролем в культурах без добавления препарата.

Однако этот способ оценки весьма трудоемок и зачастую требует проведения ряда тестов: определение общего числа клеток и числа живых клеток, митотической и оксидазной активности, уровня включения ³H-тимидина пролиферирующими клетками.

Задачей предлагаемого изобретения является определение биологической активности препарата из чистотела большого (Cheltdonium majus L.), в частности "Бластофага" "Рамифара" и др. более простым и дешевым способом и дает количественную характеристику препарату, не зависящую от экспериментатора, который может быть использован в биотехнологической промышленности при производстве и тестировании препарата.

В результате использования предлагаемого изобретения достигается удешевление при тестировании биологической активности препарата из чистотела, в частности противоопухолевой активности бластофага.

Указанный технический результат достигается тем, что определение биологической активности препарата, преимущественно "Бластофага", приготовленного из растений чистотела большого (Chelidomum majus L.), включает подготовку проб препарата, выращивание тестируемых клеток на питательной среде, подсчет живых клеток и сравнение с контролем в культурах без добавления препарата, клетки выращивают на среде МЕМ с 10% эмбриональной телячьей сыворотки до получения монослоя, затем удаляется среда культивирования и добавлялся 0.25% раствор трипсина и воздействуют им в течение 3-10 с, после чего в культуру погружают в 0,02% раствор Версена и инкубируют при 37^oC в течении 10 мин, далее открепившиеся клетки собирают и отмывают 2 раза от раствора Версена путем центрифугирования и подсчитывают число живых клеток и определяют уровень включения ³Н-тимидина пролиферирующими клетками, препарат считается прошедшим тестирование, если степень подавления суммарною включения ³Н-тимидина и/или адгезии составляет не менее 50% от контрольного уровня в культурах без добавления препарата.

На фиг.1 представлены профили подавления адгезии у 5-ти вариантов препарата.

На фиг. 2 представлены зависимость чувствительности клеточных линий к бластофагу.

На фиг.3 представлена суммарная активность каждой испытуемой серии бластофага в отношении всех 20 линий.

Пример конкретного исполнения.

Предложено тестирование вести по уровню включения ³Н-тимидина пролиферирующими клетками, т.к. он дает высокую степень корреляции с другими исследованными методами, прост в реализации и позволяет производить анализ сразу нескольких параметров (адгезии и общего числа пролиферирующих клеток в культуре) и давать количественную характеристику препарату.

Тест проводился на клетках линии CHO, как одной из наиболее чувствительных и неприхотливых клеточных линиях.

Методика тестирования включает 6 этапов.

1. Клетки выращивают на среде МЕМ с 10% эмбриональной телячьей сыворотки до получения монослоя, затем удаляется среда культивирования и добавляется 0,25% раствор трипсина и воздействуют им в течение нескольких секунд (3-10 с), после чего в культуру погружают в 0,02% раствор Версена и инкубируют при 37^oC в течении 10 мин, далее открепившиеся клетки собирают и отмывают 2 раза от раствора Версена путем центрифугирования.

2. Подсчитывают число живых клеток. Для этого смешивают 50 мкл клеточной суспензии с 50 мкл 0,1% раствора трипанового синего и просчитывают число неокрашенных клеток в камере Горяева. Суспензию разводят в среде культивирования до концентрации 250 тыс./мл и разливают по лункам 96-луночного плоскодонного планшета по 0,1 мл. Добавляют 0,1 мл тестируемого препарата в разных концентрациях.

3. Планшеты помещают в СО₂-инкубатор и культивируют в течение 48 часов при 37^oC, 90% влажности и 5% CO₂. После инкубации в каждую лунку вносят по 0,5 мкКи ³Н-тимидина (удельной активностью 37 ГБк/мМ) и инкубируют еще 16 часов.

4. С помощью харвестера неприкрепившиеся клетки переносят на стекловолокнистые фильтры, промывая каждую лунку теплой средой МЕМ (1 смыв). В каждую лунку планшета добавляют 50 мкл pacтвора трипсина и 150 мкл раствора Версена. Планшеты инкубируют 10 мин в инкубаторе и вновь промывают на харвестере дистиллированной водой и этиловым спиртом, перенося открепившиеся клетки на фильтры.

5. Фильтры высушивают в течение нескольких часов и помещают в сцентилляционные флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкости (толуол с 3 г/л РРО и 0,1 г/л РОРОР). Радиоактивность просчитывают на -спектрометре. Отдельно определяют радиоактивность, осажденную на фильтры после 1 и 2 смывов. Для определения суммарного включения изотопов результаты 1 и 2 смывов для каждой лунки суммируют.

6. Препарат считают прошедшим тестирование, если степень подавления суммарного включения ³H-тимидина (2 смыв) и/или адгезии составляет не менее 50% от контрольного уровня в культурах без добавления препарата. Концентрация бластофага должна при этом быть не выше 5 мкл/лунку (25 мкл/мл).

С помощью этого теста были получены профили активности 5 исследованных серий бластофага в дозе 5 мкл/лунку на 20 линиях (фиг. 1). Клеточные линии расположены в порядке увеличения чувствительности к препарату. Можно видеть, что наиболее активным был препарат ПФ2, который ни в одном случае не вызывал стимулирующего эффекта. В то же время именно этот препарат обладал максимальной стимулирующей активностью в отношении интактных лимфоцитов селезенки.

Три клеточные линии оказались практически нечувствительными к бастофагу, а 4 высокочувствительными (фиг. 2). Наименее чувствительной оказалась линия MDCK (клетки почки собаки). Затем следуют две лейкозные линии - МТ4 и Daudi. К группе выскокочувствительных линий относятся клетки опухоли молочной железы (McF-7wt), яичника китайского хомячка (CHO), эмбрионального легкого человека(L41) и эмбриональные фибробласты хомячка (ХЭТР).

Неоднозначный эффект дали и разные серии бластофага (фиг. 3). ПФ2 в целом ингибировал адгезию опухолевых клеток на 78,7%. Препараты 3 и 7 оказались менее активными - степень подавления 60 и 60,2% соответственно. Более слабыми оказались препараты 1D и 8 - 48,9 и 42,1% соответственно.

Предложенный способ определения биологической активности препарата по сравнению с известным дает высокую степень корреляции с другими исследованными методами, прост в реализации и позволяет производить анализ сразу нескольких параметров (адгезии и общего числа пролиферирующих клеток в культуре) и позволяет получить количественную характеристику препарата, не содержит дорогостоящих ингредиентов и более эффективен при оценке лечебных свойств препаратов, например противоопухолевой активности бластофага, и может быть использован в биотехнологической промышленности.

Источники информации:

1. Патент Российской Федерации N 1722313, М.кл. А 01 G 7/06, опубл. Б.И. N 12 за 1992 г.

2. Требования к доклиническому изучению общетоксического действия новых фармакологических веществ (временные методические рекомендации) Москва, МЗ СССР, 1985 г.