способ получения липосом

Формула изобретения

Способ получения липосом, включающий экстракцию фосфолипидов из яичных желтков, растворение яичных фосфолипидов в органическом растворителе, высушивание тонкого слоя липидов на роторном испарителе, добавление буферного раствора, встряхивание до получения однородной суспензии на механической качалке, обработку липидной смеси ультразвуком при водяном охлаждении, центрифугирование смеси и отделение верхних трех четвертей надосадочной жидкости, отличающийся тем, что на этапе растворения яичных фосфолипидов в органическом растворителе к ним добавляют жир байкальской нерпы в соотношении: яичные фосфолипиды : жир байкальской нерпы 4 : 6.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано при производстве лекарственных препаратов, корригирующих иммунную систему организма.

Известен способ получения лецитин-холестериновых липосом, обладающих антиэкссудативной активностью, мембрана которых содержит дополнительное количество ненасыщенных жирных кислот [см. Е.М.Бородулина, В.М.Крейнес. Усиление антиэкссудативной активности липосом с помощью ненасыщенных жирных кислот //Патологич. физиология и эксперим. терапия. 1996 N3. М. Медицина, с. 18-20].

Однако недостатком данного способа является то, что не было выявлено влияние порченных липосом на иммунную систему организма.

Известен способ получения липосомальной формы (фосфатидилхолин : фосфатидилэтаноламии = 4:1) липополисахарида Yersinia Pestis, обладающей стимулирующим действием на функциональную активность лимфоцитов и фагоцитов [см. Г. В. Ермаков, Н.П.Гусева, А.В.Наумов. Показатели миграционной и функциональной активности иммунокомпетентных клеток при введении липополисахарида Yersinia Pestis и его липосомальной формы. //Экологоэпидемиологический надзор за природно-очаговыми инфекциями. Астрахань, 1996, с. 163-164].

Однако недостатком известного способа является то, что полученный продукт применяется только в качестве иммунной вакцины, а не лекарственного средства.

Наиболее близким способом к заявленному изобретению является способ получения липосом из яичных фосфолипидов, включающий экстракцию суммарных фосфолипидов из яичных желтков, растворение яичных фосфолипидов в органическом растворителе, высушивание тонкого слоя яичных фосфолипидов в круглодонной колбе на роторном испарителе, добавление раствора, содержащего 0.25 М сахарозу, 0.01 М трис-буфер, 0.001 М ЭДТА, pH 7.4, встряхивание смеси до получения однородной суспензии на механической качалке в течение 30 минут, обработку смеси в течение 7 минут ультразвуком на диспергаторе УЗДН-2Т при водяном охлаждении при частоте 22 кГц, центрифугирование смеси в течение 90 минут при 105000 g и отделение верхних трех четвертей надосадочной жидкости [см. Биологические мембраны. Методы: Пер. с англ. /Под ред. Дж.Б.Финдлея, У.Г.Эванза. - М.Мир, 1990, с. 188-195].

Недостатком данного способа является то, что полученные липосомы используются только в качестве носителей лекарственных препаратов и не обладают каким-либо самостоятельным фармакологическим воздействием.

Задача, решаемая в предлагаемом изобретении, заключается в изменении фармакологических свойств липосом.

Технический результат, достигаемый при осуществлении заявляемого способа, - это создание липосомального препарата, обладающего иммунокорригирующими свойствами.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что в известном способе, включающем экстракцию фосфолипидов из яичных желтков, растворение яичных фосфолипидов в органическом растворителе, высушивание тонкого слоя липидов на роторном испарителе, добавление буферного раствора, встряхивание смеси на механической качалке до получения однородной суспензии, обработку липидной смеси ультразвуком при водяном охлаждении, центрифугирование смеси и отделение верхних трех четвертей надосадочной жидкости, согласно изобретению к яичным фосфолипидам перед растворением их в органическом растворителе добавляют жир байкальской нерпы в соотношении: яичные фосфолипиды : жир байкальской нерпы 4:6.

Байкальская нерпа - эндемик уникального озера Байкал, относится к отряду ластоногих семейства настоящих тюленей. В данное время нерпа - важнейший объект зверобойного промысла, добывается с единственной целью получения меха животного, а жир и другие виды тканей, в лучшем случае, направляются на зверофермы для откорма животных либо на техническую переработку [В.Д.Пастухов. Нерпа Байкала. - Новосиб. : ВО Наука. 1993, 271 с.]. Согласно современным данным жир байкальской нерпы не обладает токсическим эффектом. Исследования выявили 60 жирных кислот, содержащих от 8 до 22 углеродных атомов. Из них на долю насыщенных кислот приходится 17-19%, мононенасыщенных - 59-60%, полиненасыщенных - 22-23%(в том числе диеновых - 6.1-7.0%, триеновых - 0.2-0.3%, тетраеновых - 3.9-4.1%, пентаеновых - 4.6-5.0%, гексаеновых - 6.2- 7.0%). Высокая биологическая ценность жира нерпы обусловлена в основном содержанием таких высоконенасыщенных кислот, как экозапентаеновой (2.65%) и докозагексаеновой (6.28%). Эти кислоты являются предшественниками особых гормоноподобных веществ - простагландинов и тромбоксанов. В результате исследований фракционного состава жира нерпы было показано, что доминирующей фракцией являются триацилглицериды (до 99%). Свободные жирные кислоты, эфиры стеаринов находятся в следовых количествах (до 0.2%). Количество неомыляемых соединений не превышает 0.3%, остальные 0.5% приходятся на сумму ди- и моноглицеринов. Витамины А, Д, К в жире нерпы не обнаружены. Токоферолы содержатся в следовых количествах.

Таким образом, жир нерпы, содержащий эссенциальные кислоты, обладает лечебно-профилактическим действием. В период выраженных клинических проявлений лучевой болезни жир нерпы способствует сохранению функциональной активности слизистой оболочки желудка, стимулирует лейкопоэз, препятствует снижению гемокоагуляции. Также введение жира нерпы животным обеспечивает защиту слизистой оболочки желудка от изъязвлений [О.В.Пестерева. Теоретическое обоснование и практические рекомендации использования жира нерпы на пищевые цели. Дисс. на соиск. уч. степ. к. техн. н. Улан-Удэ, 1995, с. 148].

Жир нерпы из-за высокого содержания ненасыщенных жирных кислот представляет некоторые трудности при его применении. Чтобы снизить окислительные процессы нами был использован антиоксидант, в частности альфа-токоферол [см. Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2-х томах. Т.2. - 11-е изд стер. - М.: Медицина, 1988. - с. 37-39].

Концентрацию жира нерпы подбирали таким образом, чтобы добиться оптимального соотношения яичных фосфолипидов и жира нерпы, обеспечивающего иммунокорригирующее действие.

Иммунокорригирующую активность изучали в реакциях, ответственных за клеточный (в реакциях "трансплантат против хозяина" - РТПХ и гиперчувствительность замедленного типа - ГЗТ) и гуморальный иммунитет (в реакции антителообразования).

Эксперименты проводились на мышах обоего пола линии FI (CBA x C 57 B 1/6), а также линии CBA, массой 20-22 г. В работе были использованы липосомы, содержащие в своем составе фосфолипиды яичного желтка, антиоксидант альфа-токоферол и триглицериды жира нерпы в концентрации 40%, 60%, 80%. Препараты перорально вводились экспериментальным животным ежедневно в течение 14 дней в объеме 0.2 мл. Действие экстракта было изучено на интактных животных, а также животных, находящихся в состоянии иммунодепрессии. Состояние иммунодепрессии вызывали введением азатиоприна в концентрации 50 мг/кг, что вызывало угнетение показателей клеточного и гуморального иммунитета.

Использование липосомальных препаратов восстанавливало показатели клеточноопосредованных реакций ГЗТ и РТПХ лабораторных животных до уровня показателей клеточного иммунитета у интактных животных. Липосомальные препараты с концентрацией жира нерпы 40%, 60% и 80% вызывало достоверное увеличение индекса реакции ГЗТ соответственно на 21.4%, 34.2% и 29.6%, индекса реакции РТПХ на 31.2%, 33.1% и 29.4%. Липосомальные препараты не оказали значительное влияние на клеточный иммунитет интактных животных

Результаты исследования влияния липосомального препарата на процессы антителообразования показали, что его использование в концентрации жира нерпы 40% не изменяло показатели гуморального иммунитета интактных мышей. Использование липосомальных препаратов с концентрацией жира нерпы 40%, 60%, 80% на фоне иммуносупрессии достоверно увеличивало количество антителообразующих клеток (AOK) как в абсолютных значениях, так и при расчете на 10⁶ спленоцитов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что оптимальной концентрацией жира нерпы, при которой наблюдалось максимальное иммуностимулирующее действие, является 60%.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявляемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, идентичными всем существенным признакам заявляемого изобретения. Сравнение заявляемого способа с прототипом, наиболее близким по совокупности признаков аналога, позволило выявить совокупность существенных отличительных признаков, изложенных в формуле изобретения к усматриваемому заявителем техническому результату.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условиям "новизна" и "изобретательский уровень".

Заявляемый способ получения липосом осуществляется следующим образом.

Фосфолипиды экстрагируют из яичных желтков [см. Практикум по биохимии. Под ред. Н.П. Мешковой и C.E. Северина, М., изд-во МГУ, 1979, с. 87-88], с помощью пипетки вносят раствор яичных фосфолипидов, жира байкальской нерпы [ТУ 407.01 - 95] и антиоксидант альфа-токоферол [см. выше] в соотношении 4: 6: 0.05 (0.1 г смеси) в органическом растворителе (1 мл хлороформа + 1 мл метанола) в толстостенную круглодонную колбу. Испаряют растворитель на роторном испарителе [испаритель ротационный ИР - 1М2 ТУ 25-1173.102-84] так, чтобы дать возможность полученной смеси распределиться в виде тонкой пленки по стенке колбы. В колбу добавляют раствор, содержащий 0.25 М сахарозу, 0.01 М триc-буфер, 0.001 М ЭДТА, pH 7.4, встряхивают до получения однородной суспензии на механической качалке [Установка выращивания микроорганизмов термостатированная УВМТ-12-250] в течение 30 минут. Обрабатывают липидную смесь в течение 7 минут ультразвуком на диспергаторе УЗДН-2Т при водяном охлаждении при частоте 22 кГц. Обработанную смесь центрифугируют в течение 90 минут при 105000 g и отбирают верхние три четверти надосадочной жидкости.

Заявляемый способ подтверждается следующими примерами конкретного выполнения:

Пример 1.

Фосфолипиды экстрагировали из яичных желтков, растворяли яичные фосфолипиды в смеси с жиром нерпы и антиоксидантом альфа-токоферолом в органическом растворителе, высушивали липиды на роторном испарителе, добавляли раствор, содержащий 0.25 М сахарозу, 0.01 М трис-буфер, 0.001 М ЭДТА, pH 7.4, встряхивали смесь на механической качалке в течение 30 минут до получения однородной суспензии, обрабатывали липидную смесь в течение 7 минут ультразвуком на диспергаторе УЗДН-2Т при водяном охлаждении при частоте 22 кГц, центрифугировали смесь в течение 90 минут при 105000 g и отделяли верхние три четверти надосадочной жидкости.

Изучение биологической активности липосом, полученных предложенным способом, проводили на мышах обоего пола линии F1 (CBA x C 57 B 1/6) со средней массой тела 20-22 грамма в реакциях фагоцитоза Staph. aureus перитонеальными макрофагами in vitro и in vivo по методике И.С.Фрейдлин [И.С.Фрейдлин. Использование культуры мышинных перитонеальных макрофагов в качестве моделей для изучения клеток мононуклеарной фагоцитарной системы организма и их применение под влиянием биологически активных веществ. //Метод. рекоменд. -Л., 1976] . В реакциях фагоцитоза подсчитывали два показателя: активность (процент фагоцитирующих клеток от общего числа сосчитанных макрофагов) и интенсивность (среднее количество микроорганизмов, поглощенное одной клеткой). Подавление функций макрофагов моделировали введением классического иммунодепрессанта азатиоприна (в концентрации 500 мкг/мл в культуральную среду в опыте in vitro и перорально в течение 5 дней в дозе 40 мг/кг веса - в опыте in vivo). Действие азатиоприна вызывало снижение как активности, так и интенсивности фагоцитоза в обоих опытах примерно на 50%. Липосомы вводили в среду в опыте in vitro в концентрации 200 мкг/мл (в пересчете на жир нерпы) и перорально в течение 7 дней в дозе 20 мг/кг веса - в опыте in vivo.

Анализ полученных данных показал, что введение в данных опытах препарата липосом повышало как активность, так и интенсивность фагоцитоза по сравнению с интактными. Введение же липосом на фоне предварительного воздействия азатиоприном достоверно превышало оба показателя и восстанавливало их до уровня интактных.

Согласно этим данным можно сделать вывод о стимулирующем действии липосом на фагоцитарную активность макрофагов как in vitro, так и in vivo.

Пример 2.

Фосфолипиды экстрагировали из яичных желтков, растворяли яичные фосфолипиды в смеси с жиром нерпы и альфа-токоферолом в органическом растворителе, высушивали липиды на роторном испарителе, добавляли раствор, содержащий 0.25 М сахарозу, 0.01 М трис-буфер, 0.001 М ЭДТА, pH 7.4, встряхивали смесь на механической качалке в течение 30 минут до получения однородной суспензии, обрабатывали липидную смесь в течение 7 минут ультразвуком на диспергаторе УЗДН-2Т при водяном охлаждении при частоте 22 кГц, центрифугировали смесь в течение 90 минут при 105000 g и отделяли верхние три четверти надосадочной жидкости.

Биологическую активность липосом, полученных предложенным способом, изучали на морских свинках-самцах массой 150-250 граммов в реакции "активного розеткообразования" тимоцитов с эритроцитами кролика, которую проводили по стандартной методике [Временная фармакопейная статья BC 42-1571-85], изучали влияние полученного препарата на экспрессию рецепторов данных иммунокомпетентных клеток. Липосомы вводили в концентрации, аналогичной первому примеру. Из анализа результатов следует, что количество розеткообразующих клеток (РОК) среди интактных тимоцитов составило 39%, а после обработки трипсином - 7.3%. Введение липосом в систему, содержащую обработанные трипсином тимоциты, восстанавливало количество РОК до 32%, что указывает на усиление липосомами экспрессии рецепторов на поверхности тимоцитов морской свинки и ростстимулирующую активность липосом в отношении этих клеток.

По результатам исследований препарата, полученного предложенным способом, видно, что он является стимулятором иммунной системы организма. Это в свою очередь позволяет предполагать эффективность применения полученного препарата при состояниях, сопровождающихся угнетением иммунной системы.

Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют о выполнении при использовании заявляемого изобретения "способа получения липосом", обладающего следующей совокупностью преимуществ по сравнению с прототипом: заявляемый способ позволяет получить липосомальный препарат, обладающий самостоятельным лечебным - иммунокорригирующим - действием и расширить сырьевую базу для получения липосом, используя дешевое местное сырье.

Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "промышленная применимость".