способ получения концентрата белка, способ извлечения изофлавона в концентрат белка, концентрат белка (варианты)

Формула изобретения

1. Способ получения концентрата белка из материала растительного белка, обогащенного изофлавоном аглюкона, включающий промывку материала растительного белка водным раствором, имеющим значение рН у изоэлектрической точки этого растительного материала с получением концентрата растительного белка, содержащего изофлавоны глюкона, отличающийся тем, что проводят реакцию изофлавонов глюкона с достаточным количеством фермента бета-глюкосидазы и процесс ведут в течение времени, при температуре и значении рН, достаточных для преобразования, по крайней мере, большей части изофлавонов глюкона в изофлавоны каглюкона с получением концентрата, обогащенного изофлавонами аглюкона.

2. Способ получения концентрата белка, обогащенного изофлавоном аглюкона, путем промывки материала растительного белка, содержащего изофлавоны, водным раствором с получением концентрата растительного белка, отличающийся тем, что промывают материал растительного белка, содержащий изофлавоны глюкона и достаточное количество остаточного фермента бета-глюкосидазы водным раствором, имеющим значение рН приблизительно у изоэлектрической точки материала растительного белка с получением концентрата растительного белка, содержащего изофлавоны глюкона, а реакцию изофлавонов глюкона проводят с остаточным ферментом в течение времени, при температуре и значении рН, достаточных для преобразования, как минимум, большинства изофлавонов глюкона в концентрате в изофлавоны глюкона с получением концентрата белка, обогащенного изофлавоном аглюкона.

3. Способ получения концентрата белка, обогащенного изофлавоном аглюкона, путем промывки материала растительного белка, содержащего изофлавоны, водным раствором с получением концентрата растительного белка, отличающийся тем, что после промывки материала растительного белка, содержащего изофлавоны глюкона, указанным водным раствором, с получением концентрата растительного белка, содержащего изофлавоны глюкона, в него добавляют дополнительный фермент бета-глюкосидазы в таком количестве, чтобы общая концентрация фермента в концентрате была достаточна для преобразования, как минимум, большинства изофлавонов глюкона в концентрате в изофлавоны аглюкона и затем проводят реакцию изофлавонов глюкона с ферментом в течение времени, при температуре и значении рН, достаточных для преобразования, как минимум, большинства изофлавонов глюкона в концентрате в изофлавоны аглюкона с получением концентрата, обогащенного изофлавоном аглюкона.

4. Способ по пп.1, 2 или 3, отличающийся тем, что указанный период времени составляет приблизительно 2 - 24 ч.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный период времени составляет около 24 ч.

6. Способ по пп.1, 2 или 3, отличающийся тем, что указанная температура составляет приблизительно 40 - 60^oС.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанная температура составляет около 60^oС.

8. Способ по пп.1, 2 или 3, отличающийся тем, что указанное значение рН равно приблизительно 4 - 8.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанное значение рН равно около 4,5.

10. Способ по пп.1, 2 или 3, отличающийся тем, что указанный период времени составляет около 24 ч, указанная температура - около 60^oС и указанное значение рН - около 4,5.

11. Способ по пп.1, 2 или 3, отличающийся тем, что промывку материала растительного белка и реакцию изофлавонов глюкона с ферментом бета-глюкосидазы осуществляют за одну операцию.

12. Способ по пп.1, 2 или 3, отличающийся тем, что обогащенный изофлавоном аглюкона концентрат белка получен из соевых бобов.

13. Способ по пп.1, 2 или 3, отличающийся тем, что материал растительного белка содержит материал соевых бобов.

14. Способ по пп.1, 2 или 3, отличающийся тем, что в принципе все изофлавоны глюкона преобразуют в изофлавоны аглюкона.

15. Способ по пп.1, 2 или 3, отличающийся тем, что рН имеют значение, при котором фермент или остаточный фермент, или дополнительный фермент наиболее активен до реакции с изофлавонами.

16. Способ извлечения в концентрат белка, как минимум, 50% изофлавона из материала растительного белка путем промывки указанного белка водным раствором, имеющим рН приблизительно у изоэлектрической точки материала растительного белка, содержащего изофлавоны, отличающийся тем, что проводят взаимодействие изофлавонов глюкона с достаточным количеством фермента в течении времени, при температуре, и значении рН, достаточных для преобразования, как минимум, изофлавонов глюкона в концентрате в изофлавоны аглюкона с получением концентрата белка, обогащенного изофлавонами аглюкона, содержащего, как минимум, 50% изофлавонов материала растительного белка.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что концентрат содержит, как минимум, 65% изофлавонов материала растительного белка.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что концентрат содержит, как минимум, 80% изофлавонов материала растительного белка.

19. Способ по п.16, отличающийся тем, что материал растительного белка содержит материал соевых бобов.

20. Способ по п.16, отличающийся тем, что фермент представляет собой фермент бета-глюкосидазы.

21. Концентрат белка, отличающийся тем, что он получен способом по пп.18 - 20.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к получению обогащенного изофлавоном глюкона концентрата растительного белка путем промывания материала растительного белка для получения концентрата растительного белка и обработки одним или большим числом ферментов бета-глюкосидазы в условиях, когда большинство изофлавонов глюкона преобразуются в изофлавоны аглюкона, которые удерживаются в обогащенном концентрате белка. Это частичное продолжение заявки на патент США N 08/135.194, поданной 12 октября 1993 г.

Изофлавоны встречаются в разнообразных бобовых растениях, включая такие материалы растительного белка как соевые бобы. Эти соединения включают в себя даидзин, 6""-OAc даидзин, 6""-OMal даидзин, даидзин, генистин, 6""-OAc генистин, 6""OMal генистин, генистеин, глицитин, 6""-OAc-глицитин, 6""-OMal глицитин, глицитеин, биоханин A, формононетин и коуместрол. Обычно эти соединения ассоциируются с горьким привкусом, присушим соевым бобам, и в производстве коммерческих продуктов, таких как выделенные вещества и концентраты, внимание фокусировалось на удалении этих материалов. Например, в обычном процессе получения выделенного вещества белков сои, в котором хлопья сои экстрагируются водной щелочной средой, большинство изофлавонов переводится в экстракте в растворимую форму и остается переведенным в растворимую форму в сыворотке, которая обычно выбрасывается после кислотного осаждения белка для образования выделенного вещества. Остаточные изофлавоны, покинувшие выделенное вещество белка, осажденное в кислоте, обычно удаляются исчерпывающей промывкой выделенного вещества.

Недавно было признано, что изофлавоны, содержащиеся в растительных белках, такие как соевые бобы, могут замедлить рост раковых клеток человека, таких как раковые клетки в груди и раковые клетки предстательной железы, как описано в следующих статьях: "Замедление генистеином роста раковых клеток в груди человека, независимость от рецепторов эстрогена и ген многолекарственного сопротивления" Питерсона и Барнса, Biochemical and Biophysical Research, Communications, Vol. 179, N.l. стр. 661-667, 30 авг. 1991; "Генистеин и Биоханин A замедляют рост раковых клеток предстательной железы человека, но не эпидермический фактор роста рецептора автофосфорилации тирозина " Питерсона и Барнса, The Prostate, Vol. 22, стр. 335-345 (1993); и "Соевые бобы замедляют рост опухоли грудной железы в моделях рака груди" Барнса и др., "Мутагены и карциногены в питании", стр. 239-253 (1990).

Из указанных изофлавонов несколько существуют как глюкосиды или как глюконы с молекулой глюкозы, прикрепленной к 7 позициям, как показано в формуле ниже. Некоторые из глюконов, такие как 6""-OAc генистин, содержат группу ацетата, прикрепленную к 6 позиции самой молекулы глюкозы. Хотя все изофлавоны, включая глюкосиды, представляют интерес для медицинской оценки, конкретные наиболее интересные изофлавоны - это аглюконы, когда молекула глюкозы не прикреплена. Эти изофлавоны не так растворимы в воде, как глюконы или глюкосиды. Конкретные изофлавоны в этой категории - это даидзеин, генистеин и глицитеин. Эти аглюконы имеют следующую общую формулу:



где R₁, R₂, R₃ и R₄ могут выбираться из группы, состоящей из H, OH и OCH₃. Поэтому настоящее изобретение направлено на аглюконы и обогащение концентрата растительного белка этими материалами.

В технике известны способы преобразования изофлавонов глюкона в изофлавоны аглюкона, такие как описанные в заявке на патент Японии N 258.669 на имя Обаты и др. Такие процессы позволяют достигать только умеренной степени преобразования и потому нежелательны, особенно для широкомасштабных коммерческих операций. Кроме того, известные процессы, такие как описаны в заявке 258.669, описывают удаление изофлавонов из материала белка и не описывают, как приготовить обогащенный изофлавоном аглюкона концентрат белка. Таким образом, существует потребность в процессе преобразования как минимум большинства и предпочтительно в принципе всех изофлавонов глюкона в изофлавоны аглюкона и для получения обогащенного изофлавоном аглюкона концентрата белка.

Поэтому целью настоящего изобретения является создание обогащенного изофлавоном аглюкона концентрата белка и процесс его получения. Эта и другие цели конкретно достигаются в подробном описании настоящего изобретения, изложенном ниже.

Это изобретение создает обогащенный изофлавонами аглюкона концентрат растительного белка и процесс его получения. Способы его получения включают в себя промывание материала растительного белка, содержащего изофлавоны глюкона, водным растворителем, имеющим значение pH приблизительно у изоэлектрической точки материала белка с получением концентрата растительного белка. Затем концентрат реагирует с достаточным количеством одного или большего числа ферментов бета-глюкосидазы в течение времени, при температуре и значении pH, достаточных для преобразования большинства изофлавонов глюкона в концентрате в изофлавоны аглюкона с получением обогащенного изофлавонами аглюкона концентрата белка. Это изобретение также создает способы получения таких концентратов, когда дополнительная бета-глюкосидаза добавляется к промывке или концентрату. Затем получившийся обогащенный аглюконом концентрат можно отделить и обезволить. Кроме того, это изобретение создает способы извлечения в относительно высоких пропорциях изофлавонов в концентратах белка из материалов растительного белка.

Хотя это изобретение будет описано в отношении продуктов из соевых бобов и хотя процесс особенно пригоден для получения обогащенных изофлавонами аглюкона концентрированных материалов соевых бобов, тем не менее этот процесс в общем применим для получения обогащенного изофлавонами аглюкона концентрата разных источников растительного белка, содержащих изофлавоны. Пример такого пригодного материала растительного белка - это материал сои, материал соевых бобов или материал растительного белка, содержащий соевые бобы. Термин "материал соевых бобов", как он здесь используется, означает соевые бобы или производную соевых бобов.

Исходный материал в соответствии с предпочтительными примерами осуществления - это хлопья соевых бобов, из которых масло было удалено экстракцией в растворителе. Обычно концентрат соевого белка получается из хлопьев соевых бобов путем промывки хлопьев водным раствором, имеющим значение pH у приблизительно изоэлектрической точки белка, которая в случае соевого белка составляет приблизительно 4,4-4,6. Столовая кислота обычно добавляется в воду для получения изоэлектрической промывки для материала соевого белка.

Изоэлектрическая промывка удаляет большое количество растворимых в воде карбогидратов и других компонентов, но удаляет мало белка, что создает концентрат белка, который обычно имеет содержание белка на сухой основе приблизительно 60-75% по весу. Изофлавоны глюкона, содержащиеся в растительном белке или материале сои, удаляются изоэлектрической промывкой. Но из-за относительно низкого значения pH удаляемые количества меньшие, чем при экстракции с более высоким pH. Поэтому для целей предпочтительного примера осуществления изобретения желательно и для максимального извлечения изофлавонов, чтобы изоэлектрическая промывка ограничивалась одним этапом или самое большое проводилась одна дополнительная промывка, также у изоэлектрической точки. Также предпочтительно, чтобы весовое отношение водного раствора, используемого для промывки материала белка, относительно количества материала белка составляло приблизительно 5:1-10:1.

Получившийся концентрат суспензируется в воде при уровнях твердых веществ приблизительно 10-15% по весу и затем он реагирует с одним или большим числом ферментов бета-глюкосидазы для преобразования как минимум большинства и предпочтительно в принципе всего материала изофлавонов глюкона, содержащегося в концентрате, в изофлавоны аглюкона. Оптимальный диапазон pH для фермента бета-глюкосилазы будет меняться в зависимости от конкретного применяемого фермента бета-глюкосидазы, но обычно будет меняться в диапазоне приблизительно 4-8. Значение pH экстракта обычно устанавливается приблизительно в таком диапазоне pH, в котором конкретный фермент наиболее активен по реакции с ферментом. Значение pH обычно устанавливается добавлением столовой кислоты, такой как уксусная, серная, фосфорная, соляная или другого пригодного реагента.

Фермент бета-глюкосидазы может естественно присутствовать в материале соевых бобов или присутствовать из-за роста микробов, что называется здесь "остаточным" ферментом, или же он может добавляться к концентрату. Добавленный фермент называется здесь "дополнительным ферментом". В общем случае, если концентрация остаточного фермента в концентрате недостаточна для преобразования большинства (предпочтительно в принципе всех) изофлавонов в форме глюкона в форму аглюкона, то нужно добавить дополнительный фермент. Количество фермента, достаточное для осуществления преобразования изофлавонов, меняется от многих факторов, включая виды присутствующих ферментов, распределение концентраций ферментов, значение pH системы и активность присутствующих ферментов. Если достаточные концентрации ферментов имеются, либо посредством остаточных ферментов, либо посредством дополнительных ферментов, либо посредством обоих концентрат реагирует с ферментами бета-глюкосидазы в течение периода времени, при температуре и значении pH достаточных, чтобы преобразовать как минимум большинство изофлавонов глюкона и предпочтительно в принципе их всех, содержащихся в концентрате, в форму аглюкона.

К числу предпочтительных дополнительных ферментов бета-глюкосидазы относятся биопектиназа 100L и 300L, биопектиназа OK 70L, лактаза F и лактозим. Лактаза F поставляется фирмой Amano International Enzyme Co., Inc., а/я 1000, Трой, Вирджиния 22974, она имеет оптимальный диапазон pH приблизительно 4-6, а лактозим поставляется фирмой Novo Industries, Enzyme Division, Ново Алле, DK-2880. Багсвэрд, Дания, и имеет оптимальный диапазон pH около 7. Биопектиназа 100L, биопектиназа 300L и биопектиназа OK 70L поставляются фирмой Quest International, Сарасота, Флорида. Дополнительные ферменты добавляются в количествах, достаточных для преобразования как минимум большинства изофлавонов глюкона и предпочтительно в принципе их всех, в аглюконы. В тех случаях, когда необходимо добавить дополнительные ферменты, количество добавляемого фермента составляет приблизительно 0,5-5% по весу от твердых веществ концентрата на сухой основе.

Другой класс пригодных ферментов для добавления в качестве дополнительных ферментов - это ферменты эстеразы. Считается, что эти ферменты хорошо подходят для процессов предпочтительных примеров осуществления, описанных здесь, так как они преобразуют сопряжения ацетата и малоната в изофлавоны глюкона путем удаления групп ацетата и малоната из сопряжений изофлавона. В самом предпочтительном примере используются оба типа ферментов, ферменты глюкосидазы и эстеразы.

Процессы в предпочтительных примерах осуществления - это предпочтительно одноэтапные процессы, и они достигают очень высоких степеней преобразования изофлавонов (из формы глюкона в форму аглюкона) за относительно короткое время и с относительной легкостью и экономичностью. Используемый здесь термин "одноэтапный" процесс реакции означает процесс реакции, в котором определенные значения параметров процесса обычно поддерживаются в ходе процесса реакции. К числу этих параметров процесса относятся pH и температура.

Очень высокие степени преобразования - это такие, что как минимум большинство изофлавонов в форме глюкона и предпочтительно в принципе все они, присутствующие в концентрате, преобразуются в форму аглюкона. Термин " большинство " обозначает степень преобразования изофлавонов глюкона в изофлавоны аглюкона как минимум около 50%. Термин "в принципе все" обозначает степень преобразования изофлавонов глюкона в изофлавоны аглюкона как минимум 80% и наиболее предпочтительно как минимум около 90%.

Хотя мы не хотим связывать себя с какой-либо конкретной теорией, считается, что удивительно и неожиданно высокие степени преобразования в описанных здесь процессах возникают из комбинации параметров процесса, используемых в течение процесса одноэтапной реакции. Предпочтительно, чтобы pH системы реакции поддерживался или приблизительно поддерживался на значении приблизительно 4-8 и наиболее предпочтительно на значении, при котором фермент(ы) наиболее активны до реакции с сопряжением (сопряжениями) изофлавона во время процесса одноэтапной реакции. Предпочтительно, чтобы температура реакционной системы поддерживалась, хотя бы приблизительно, приблизительно от 40 до 60^oC и наиболее предпочтительно около 60^oC во время процесса одноэтапной реакции. В общем случае периоды времени, необходимые для достижения преобразования в принципе всех изофлавонов глюкона в аглюконы описанными здесь одноэтапными процессами, составляют приблизительно 2-24 часа.

Альтернативная процедура для получения обогащенного аглюконом концентрата состоит в комбинировании изоэлектрической промывки и реакции с ферментами бета-глюкосидазы в одном этапе, когда исходный материал сои суспензируется в изоэлектрической промывке и один или большее число ферментов бета-глюкосидазы с оптимальным pH у приблизительно изоэлектрической точки, такой как вышеописанная лактаза F, добавляется прямо в суспензию. Затем проводится реакция в вышеописанных общих условиях для преобразования как минимум большинства и предпочтительно в принципе всех изофлавонов глюкона в аглюконы. Это представляет собой предпочтительный и упрощенный процесс без предварительной промывки материала у изоэлектрической точки для удаления растворимых карбогидратов и тем самым исключения возможных потерь изофлавонов при промывке.

Затем концентрат белка можно обезводить обычными процедурами, включая центрифугирование и методы сушки для получения концентрата, имеющего уровень генистеина на сухой основе приблизительно 1,0-2,0 мг/г и уровень даидзеина на сухой основе приблизительно 0,7-1,5 мг/г.

Настоящее изобретение также предусматривает способы извлечения изофлавонов в концентрате белка в очень высоких пропорциях из материала растительного белка, такого как материал соевых бобов. Уровни извлечения, получаемые описанными здесь процессами, обычно составляют как минимум 50%, предпочтительно 65% и наиболее предпочтительно 80% на основании суммы всех видов конкретного изофлавона в исходном материале растительного белка. Хотя мы не желаем быть связанными какой-либо конкретной теорией, считается, что высокие уровни извлечения являются результатом описанных здесь реакций преобразования в сочетании с также описанными разными операциями обработки. Путем преобразования сопряжений изофлавона аглюкона, которые относительно растворимы, в менее растворимые вилы аглюкона на конкретном этапе обработки можно извлечь в получающийся продукт высокую процентную составляющую изофлавонов из подаваемого материала. Следующие примеры описывают конкретные, но не являющиеся ограничительными примеры осуществления этого изобретения.

Значение pH смеси 15 г муки соевых бобов и 150 г воды устанавливалось на 7. 1,5 г биопектиназы 100L добавлялось к смеси. Смесь выдерживалась в термостате при 60^oC в течение 2 часов, и после этого значение pH устанавливалось на 4,5. Дополнительно добавлялся 1 г биопектиназы 100L и получившаяся смесь выдерживалась 2 часа. После выдержки извлекался получившийся обогащенный изофлавоном аглюкона концентрат белка/волокна. Восстановление изофлавонов в концентрате белка/волокна приведено в таблице. Эти данные показывают степень преобразования, достижимую комбинацией остаточного фермента (ферментов) и дополнительного фермента. Произошло значительное преобразование сопряжений изофлавонов в аглюконы, особенно для генистеина и даидзеина. Концентрация каждого описанного здесь вида изофлавона основана на общей сумме всех форм этого вида изофлавона.

В другой серии экспериментов процент извлечения генистеина и даидзеина в белке сыворотки, полученном из соевых бобов, был подвергнут исследованию. Процент извлечения находился определением количества генистеина (или даидзеина) в выделенном веществе и выражением этого количества как процентного состава на основе общего количества всех форм генистеина (или даидзеина) в исходном материале соевых бобов.

100 г обезжиренной соевой муки добавлялось к 1600 г воды, значение pH которой устанавливалось на 4,5 добавлением соляной кислоты. Суспензия нагревалась до 50^oC, и добавлялось 2% по сухому весу творогообразной массы фермента, имеющего активность бета-глюкосидазы, особенно лактазы F. Суспензии давали прореагировать в течение 16 часов при 50^oC для обеспечения полного преобразования изофлавонов глюкона в форму аглюкона. Концентрат белка отделялся от водного растворителя центрифугированием с образованием обогащенного аглюконом концентрата. Дальнейшая промывка концентрата исключалась. Количество генистеина, извлеченного в выделенном веществе, составляло 82% от общей суммы всех форм генистина и генистеина в исходном материале соевых бобов (обезжиренная соевая мука). Аналогичным образом, количество даидзеина, извлеченного в выделенном веществе, было 64%.

Ниже следует описание способа квантификации изофлавонов в соевых продуктах. Изофлавоны экстрагируются из соевых продуктов путем перемешивания 0,75 г образца (высушенного распылением или мелко перемолотого порошка) с 50 мл растворителя 80/20 метанол/вода. Смесь встряхивается в течение 2 часов при комнатной температуре орбитальным встряхивателем. Спустя 2 часа остальные нерастворенные материалы удаляются фильтрацией через фильтровальную бумагу Whatman N.42. 5 мл фильтрата разводятся 4 мл воды и 1 мл метанола.

Экстрагированные изофлавоны отделяются посредством ВЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) с использованием колонны с обратной фазой Beckman C18. Изофлавоны впрыскиваются в колонну и элюируются градиентом растворителя начиная с 88% метанола, 10% воды и 2% ледяной уксусной кислоты и кончая 98% метанола и 2% ледяной уксусной кислоты. При скорости течения 0,4 мл/мин все изофлавоны - генистин, 6""-O-ацетигенистин, 6""-O-малонилгенистин, генистеин, даидзин, 6""-O-ацетидаидзин, 6""-O-малонилдаидзин, даидзеин, глицитин и его производные и глицитеин - явно растворяются. Амплитудное детектирование проводится удельным поглощением в УФ при 262 мм. Идентификация пиков проводится масс-спектрометром.

Квантификация достигается использованием чистых эталонов (генистин, генистеин, даидзин и даидзеин), приобретенных у фирмы Indofine Chemical Company, Соммервилл, Нью-Джерси. Факторы чувствительности (отклика) (интегральная площадь/концентрация) рассчитываются для каждого из указанных соединений и используются для квантирования неизвестных образцов. Для сопряженных форм, для которых нет чистых эталонов, считается, что факторы чувствительности - это факторы исходной молекулы, но скорректированные по разнице молекулярного веса. Фактор чувствительности для глицитина принимается как фактор для генистина, скорректированный по разнице молекулярных весов.

Этот способ дает количества каждого отдельного изофлавона. Для удобства весь генистеин, весь даидзеин и весь глицитеин можно рассчитать как представление суммарного веса этих соединений, если все сопряженные формы преобразованы в их соответствующие несопряженные формы. Эти суммарные количества можно также измерить непосредственно некоторым методом с использованием кислотного гидролиза для преобразования сопряженных форм.

Конечно нужно понимать, что вышеизложенное - это только предпочтительные примеры осуществления изобретения и что можно сделать различные изменения и модификации, не отходя от смысла и более широких аспектов изобретения, как они изложены в прилагаемой формуле изобретения, которые нужно интерпретировать в соответствии с принципами Патентного закона, включая учение об эквивалентах.