способ оценки противовоспалительной активности цитокинов

Формула изобретения

1. Способ оценки противовоспалительной активности цитокинов, включающий оценку ингибирования супероксидных радикалов, отличающийся тем, что оценку ингибирования осуществляют по инактивации свободных радикалов, при этом определяют показатель интенсивности хемилюминесценции в модельной системе гемоглобин - пероксид водорода - люминол, добавляют оцениваемый цитокин в количестве 0,1 - 100 нг и повторно определяют показатель интенсивности хемилюминесценции и при его снижении на 50% и более относительно исходного уровня оценивают активность цитокина как противовоспалительную.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что количество добавляемого в модельную систему цитокина выбирают в соответствии с содержанием его в сыворотке крови здорового донора.

Описание изобретения к патенту

В настоящее время доказано, что цитокины играют ключевую роль в регуляции процессов воспаления. Выделяют группу противовоспалительных цитокинов, объединенных по их доминирующему биологическому действию. Противовоспалительные цитокины: интерлейкин-1 (ИЛ-1), интерлейкин-6 (ИЛ-6), фактор некроза опухоли альфа (ФНО) принимают участие в индукции и дальнейшем развитии процессов воспаления и повреждения тканей. Противовоспалительные цитокины являются мощными аутокринными стимуляторами защитных функций мононуклеарных клеток: обеспечивают их мобилизацию в очаг воспаления, являются хемоаттрактантами, повышают экспрессию поверхностных рецепторов, опосредующих фагоцитоз, усиливают микробицидность за счет индукции синтеза супероксидных и нитроксидных радикалов (Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции реакции воспаления и иммунитета. // Иммунология. - 1995. - N 3. - C. 30-36).

С другой стороны, противовоспалительные цитокины: интерлейкин-4 (ИЛ-4), интерлейкин-10 (ИЛ-10), интерлейкин-13 (ИЛ-13), трансформирующий фактор роста бета ТФР) являются антагонистами противовоспалительных цитокинов, оказывая некоторые противоположные эффекты при развитии воспалительной реакции (Фрейдлин И. С. Ключевая позиция макрофагов в цитокиновой регуляторной сети. // Иммунология. - 1995. - N 3 - С. 45-48). Противовоспалительные цитокины выступают как синергисты в подавлении продукции супероксидных и нитроксидных радикалов, действуя на фермент, участвующий в их образовании. Поэтому несомненный интерес представляет наличие другого ингибирующего механизма действия цитокинов на свободнорадикальные процессы, а именно способность непосредственно перехватывать свободные радикалы (антиокислительная активность).

Рекомбинантные и природные цитокины сейчас достаточно широко используются в качестве терапевтических средств. Например, способ локальной аутолимфокинотерапии, основанный на применении естественного комплекса цитокинов, с успехом используется в клинике заболеваний, связанных с хирургическим или травматическим повреждением тканей (Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В. Иммуноцитокины и локальная иммунокоррекция. // Иммунология. - 1995. - N 1 - с. 4-7). Использование данного способа терапии ускоряет процессы заживления ран и способствует формированию более нежного рубца в месте повреждения.

Соответственно необходим способ определения противоспалительной активности цитокинов как терапевтического средства, что особенно важно при дальнейшем поиске лекарственных средств, включающих в свой состав цитокины и их комплексы.

Ближайшим аналогом предлагаемого способа оценки противовоспалительной активности цитокинов является способ, представляющий собой определение ингибирующего действия рекомбинантного цитокина - трансформирующего фактора роста на продукцию супероксидных и нитроксидных радикалов кератиноцитами (Heck D., Laskin D. Epidermal growth factor supresses nitric oxide and nitrogen peroxile production by keratinocytes. // J. Biol. Chem. - 1992. - v. 267. - p. 21277-21280).

В этом случае определяли ингибирующее действие ТФР на фермент NO-синтазу, катализирующий образование нитроксидного радикала, путем измерения уровня m-РНК этого фермента методом иммуноблоттинга. ТФР ингибировал образование нитроксидных радикалов, что указывает на его противовоспалительную активность. Недостатком такого способа оценки является то, что он дает возможность оценить ингибирующее действие ТФР только на фермент, образующий радикалы, но не на сами радикалы, хотя последний механизм может вносить серьезный вклад в противовоспалительную активность данного цитокина. Помимо этого недостатками этого способа являются также его трудоемкость, длительное время проведения и необходимость наличия дорогостоящих реактивов. Предлагаемый способ оценки противовоспалительной активности цитокинов имеет такие преимущества, как относительно высокая чувствительность (нг-мкг), достаточно короткое время исследования (20-30 минут на одну пробу с контролем), простота исполнения, а также доступность реактивов.

Техническим результатом предлагаемого способа является упрощение способа оценки противовоспалительной активности цитокинов. Технический результат достигается за счет оценки нового механизма противовоспалительного действия цитокинов - способности перехватывать свободные радикалы. Определение данной способности проводят с использованием модельной системы гемоглобин - пероксид водорода - люминол (Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В. и др. Определение антиоксидантной активности плазмы крови с помощью системы гемоглобин - пероксид водорода - люминол. // Вопросы мед. химии - 1998 - т. 44 - N 1 - с. 70-76).

Способ осуществляют следующим образом. Для определения противовоспалительной активности цитокинов проводятся измерения хемилюминесценции модельной системы гемоглобин - перекись водорода - люминол в присутствии тестируемого вещества и без него (контроль).

Сначала готовят реакционную среду, в состав которой входят следующие компоненты: 0,29 мкМ гемоглобина и 9,7 мкМ люминола в фосфатном буфере (50 мкМ KH₂PO₄, 100 мкМ ЭДТА, pH 7,4), общий объем 5 мл. Затем производят инициирование свободнорадикального окисления люминола введением в реакционную среду 27 мкМ перекиси водорода. Регистрируют хемилюминесценцию, сопровождающую окисление люминола в течение 10 минут. Максимальную интенсивность свечения в данном случае считают как интенсивность в контроле. Далее готовят новую реакционную среду, в тех же пропорциях добавляя все компоненты, а кроме того, еще и исследуемое вещество. Регистрируют максимальную интенсивность хемилюминесценции, считают ее как интенсивность свечения в эксперименте.

Подсчитывают соотношение интенсивности в эксперименте к интенсивности в контроле (I/I₀). Считают, что исследуемый цитокин или комплекс цитокинов обладает противовоспалительной активностью в том случае, когда I/I₀ 0,5. То есть добавление в модельную систему цитокинов, обладающих противовоспалительной активностью, должно вызывать уменьшение интенсивности хемилюминесценции на 50% по сравнению с контролем.

Пример 1. Определение противовоспалительной активности естественного комплекса цитокинов. Естественный комплекс цитокинов (ЕКЦ) представляет собой супернатант стимулированных фитогемагглютинином лимфоцитов, получаемых из периферической крови свиньи. Была выявлена биологическая активность цитокинов, входящих в состав комплекса. Так, специфическая активность ИЛ1 составила 3200530 ЕД/мг белка, ИЛ6 - 700100 ЕД/мг белка, ФНО - 21253 ЕД/мг белка, МИФ - 320080 ЕД/мг белка. Количество ТФР₁ было определено методом иммуноферментного анализа и составило 5860230 пг/мг (Kovalchuk L.V., Gankovskaya L.V. // J. Ocular Pharmacology. - 1996. - v. 12. - N 3. - p. 271).

Для определения противовоспалительной активности ЕКЦ измеряли хемилюминесценцию модельной системы гемоглобин - пероксид водорода - люминол без добавления ЕКЦ и с добавлением различных концентраций ЕКЦ. Реакционная среда общим объемом 5 мл содержала 0,29 мкМ гемоглобина и 9,7 мкМ люминола в фосфатном буфере (50 мкМ KH₂PO₂, 100 мкМ ЭДТА, pH 7,4). Инициирование свободнорадикального окисления люминола осуществляли введением 27 мкМ перекиси водорода. Регистрировали хемилюминесценцию в течение 10 минут. При добавлении в модельную систему ЕКЦ в количестве от 1 до 50 мкг (концентрацию белка в супернатанте определяли по методу Бредфорда) происходило дозозависимое уменьшение максимальной интенсивности хемилюминесценции модельной системы (фиг. 1).

Уменьшение интенсивности свечения модельной системы на 50% ЕКЦ вызывал в количестве 16 мкг. Отсюда можно сделать вывод, что ЕКЦ обладает противовоспалительной активностью в количествах более 16 мкг.

Пример 2. Определение противовоспалительной активности рекомбинантного трансформирующего фактора роста 1. Определение противовоспалительной активности рекомбинантного ТФР производили по способу, описанному выше. Добавление в модельную систему ТФР в количествах от 1 до 100 нг также вызывало дозозависимое уменьшение максимальной интенсивности хемилюминесценции модельной системы (фиг. 2). Количество ТФР, вызывающее уменьшение максимальной интенсивности хемилюминесценции модельной системы на 50%, составляет 0,01 мкг (0,4 нМ).

Для сравнения добавляли в реакционную среду 0,01 мкг сывороточного человеческого альбумина, используемого в качестве наполнителя для рекомбинантного ТФР, изменений параметров хемилюминесценции не происходило. Количество альбумина, уменьшающее максимальную интенсивность хемилюминесценции на 50%, составляет 100 мгк (1,45 мкМ).

Таким образом, рекомбинантный ТФР обладал большей способностью перехватывать свободные радикалы, образующиеся в данной модельной системе, чем альбумин, т.е. обладал наибольшей противовоспалительной активностью.

Пример 3. Определение противовоспалительной активности цитокинов слезной жидкости кроликов. Измеряли противовоспалительную активность цитокинов в слезной жидкости в норме, после хирургического повреждения тканей склеры (антиглаукоматозная операция) и во время лечения данного повреждения аутологичным комплексом цитокинов.

Известно, что в норме в слезной жидкости определяются такие цитокины, как ФНО в 30% случаев, и ТФР в 100% случаев, что может оказывать противовоспалительное действие (Еричев В.П., Ганковская Л.В. и др. The role of natural cytokine complex for the prophilactics of extra scaring after glaucoma surgery. //2^nd International glaucoma symposium. - Israel - 1998 - p. 138).

По способу, описанному выше, готовили реакционную среду, в которую добавляли 200 мкл слезной жидкости кроликов. Производили регистрацию хемилюминесценции в контроле и в присутствии 200 мкл слезной жидкости кроликов. Были получены следующие результаты: 200 мкл слезной жидкости здоровых кроликов вызывало уменьшение интенсивности хемилюминесценции модельной системы на 65%, 200 мкл слезной жидкости кроликов, собранной на 14-е сутки после операции у леченых природным комплексом цитокинов и нелеченных кроликов, уменьшение интенсивности хемилюминесценции составило 74 и 32% соответственно (фиг. 3). То есть наибольшей способностью перехватывать свободные радикалы обладала слезная жидкость кроликов после 14 суток инстилляций ЕКЦ, что позволяет сделать предположение о том, что цитокины могут вносить вклад в противовоспалительную активность слезной жидкости наряду с другими ее компонентами. Высокая противовоспалительная активность слезы на 14-й день после операции и инстилляций ЕКЦ соответствует клинической картине заживления рубца.

Итак, данным способом показано наличие противовоспалительной активности рекомбинантного ТФР и ЕКЦ. При определении противовоспалительной активности слезной жидкости показана возможность вклада цитокинов в антиокислительную активность слезы. Оценка противовоспалительной активности цитокинов посредством определения их способности перехватывать свободные радикалы может иметь важное значение для объяснения патогенеза некоторых воспалительных заболеваний и обоснования применения цитокинов в качестве терапевтических средств.