способ получения иммуномодуляторов

Формула изобретения

Способ получения иммуномодулятора, заключающийся в том, что вилочковую железу тюленя 10 - 15-дневного возраста гомогенизуют в физиологическом растворе, обрабатывают в ультратораксе, затем ультразвуком, центрифугируют, осадок удаляют, надосадочную жидкость нагревают до 80^oC, охлаждают, центрифугируют, выдерживают супернатант при минусовой температуре, смешивают его в соотношении 1 : 5 с охлажденным до минусовой температуры ацетоном, центрифугируют, осадок растворяют при соотношении 1 : 9 - 1 : 10 в 10 мМ растворе фосфорнокислого натрия при pH 7,0 - 7,2, смешивают в соотношении 4 : 1 с насыщенным раствором сернокислого аммония, центрифугируют, супернатант подкисляют 10%-ным раствором уксусной кислоты до pH 4,0 - 4,2, смешивают в соотношении 1 : 1 с 50%-ным раствором сернокислого аммония, центрифугируют, осадок полностью растворяют в 10 мМ трис-HCl буфере, pH 8,0 - 8,2, лиофилизируют, повторно растворяют полученный материал в 10 мМ трис-HCl буфере, пропускают раствор через хроматографическую колонку, лиофилизируют, при центрифугировании поддерживают температуру от 0 до -4^oC, лиофилизат полностью растворяют в трис-HCl-буфере и пропускают через жидкостный хроматограф высокого давления, выделяют фракции с иммуностимулирующими и ингибирующими свойствами, выделенные подфракции раздельно лиофилизируют.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при получении гормональных веществ с выраженной биологической активностью в отношении иммунологических реакций.

Известен способ получения иммуностимулятора, когда в качестве сырья используются тимус теленка (см., например, Goldstein A., Guna A., Zatz M., Hardi M., White A., "Purification and biological activity of the timus gland", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 1800, 1972).

Полученный известным способом иммуностимулятор не обладает достаточной биологической активностью и, кроме того, использование данного способа не обеспечивает получение максимального количества конечного продукта.

Известен способ получения иммуномодулятора, когда тимус теленка измельчают до кашицы, к ней добавляют апирогенную бидистиллированную воду и в проточном нагревателе осаждают высокомолекулярные составные части 10 мин при 80^oC. Затем кашицу охлаждают и центрифугируют. К надосадку добавляют для непрерывной ультрафильтрации апирогенную воду. Ультрафильтрат подвергают электродиализу 2 ч при 30^oC, напряжении 12 В, максимальной силе тока 40 А. Выход экстракта составляет 1,6-1,54% (SU 1442064, от 30.11.88). Однако полученный известным способом иммуномодулятор не позволяет получить вещество, в котором подфракции с иммуностимулирующим и ингибирующим действием были бы выделены раздельно.

Как показали проведенные авторами исследования, иммуностимулятор, полученный по известному способу, состоит из целого ряда полипептидных компонентов, обладающих иммуномодуляционными свойствами, например, в отношении популяции Т-лимфоцитов, то есть в его составе содержатся компоненты, проявляющие как иммуностимулирующие, так и ингибирующие свойства.

Заявленное изобретение направлено на повышение эффективности переработки за счет получения иммуномодуляторов с более высокой биологической активностью и обладающих свойствами как иммуностимуляторов, так и ингибиторов иммунных реакций.

Указанный результат достигается за счет того, что иммуномодулятор получают используя в качестве сырья вилочковую железу тюленя 10-15-дневного возраста, из которой подготавливают клеточную массу путем гомогенизации ее в физрастворе и обработки в ультратораксе с последующей полной дезинтеграцией оставшихся клеток ультразвуком, из полученного материала выделяют полипептиды путем последовательных операций центрифугирования, удаления осадка, нагрева надосадочной жидкости до 80^oC, охлаждения с последующим центрифугированием, выдержки полученного супернатанта при минусовой температуре, смешивании его в соотношении 1:5 с охлажденным до минусовой температуры ацетоном с последующим центрифугированием и отделением осадка, растворения осадка при соотношении 1:9 - 1:10 в 10 мМ растворе фосфорнокислого натрия при pH 7,0 - 7,2, смешивания в соотношении 4:1 с насыщенным раствором сернокислого аммония с последующим центрифугированием, подкисления полученного супернатанта 10%-ным раствором уксусной кислоты до pH 4,0-4,2, смешивания в соотношении 1: 1 с 50% раствором сернокислого аммония с последующим центрифугированием, полного растворения полученного осадка в 10 мМ трис-HCl-буфере, при pH 8,0-8,2, лиофилизации, повторного растворения полученного материала в 10 мМ трис-HCl-буфере, пропускания раствора через хроматографическую колонку и лиофилизации, при этом при центрифугировании поддерживают температуру обрабатываемых материалов от 0 до -4^oC, а полученный после последней лиофилизации материал вновь полностью растворяют в трис-HCl-буфере и пропускают через жидкостный хроматограф высокого давления, выделяя из получаемых подфракций компоненты с иммуностимулирующими и ингибирующими свойствами, после чего суммарные фракции раздельно лиофилизуют.

Сущность изобретения характеризуется совокупностью существенных признаков, представленных в формуле изобретения и иллюстрируется чертежами, где на фиг. 1 представлена динамика биологической активности отдельных подфракций в реакции спонтанного розеткообразования, на фиг. 2 - действие иммуномодулирующих фракций в реакции спонтанного розеткообразования.

Как следует из результатов тестовых испытаний, получаемая по предлагаемому способу иммуностимулирующая фракция обладает более высокой активностью, это объясняется тем, что в ее составе, в отличие от иммуностимулятора, полученного по известному способу, отсутствуют полипептидные компоненты, обладающие ингибирующими свойствами. При этом предлагаемый способ обеспечивает получение группы полипептидных компонентов, обладающих ингибирующими свойствами, использование которых необходимо при решении целого ряда задач, требующих снижения иммунных функций для экспериментальных целей и клинической практики.

При использовании иммуномодулятора, полученного по предлагаемому способу, при концентрации 0,001 мкг на мл инкубационной среды с лимфоцитами человека, наблюдалось увеличение Е-РОК до 83%, тогда как у иммуностимулятора, полученного по известному способу, значение Е-РОК не превышало 55%.

Пример. Очищенные от соединительной и эпителиальной тканей вилочковые железы тюленей 10-15-дневного возраста в количестве 1 кг пропускали через мясорубку и помещали на 15-20 мин в гомогенизатор. Гомогенизацию проводили в жидкой среде с добавлением физиологического раствора (0,15 М раствор NaCl) в соотношении 1: 4. Далее обработку гомогенной жидкости проводили в течение 10-15 мин на ультратораксе в режиме 20 тыс. об/мин. После этого добивались полной дезинтеграции клеток, подвергая субклеточные субстанции дальнейшему дроблению на ультразвуковой установке. Весь полученный материал центрифугировался на ультрацентрифуге (12000 g) в течение 1 ч при 0^oC и после удаления осадка получали 1-ю фракцию.

Надосадочная жидкость, представляющая собой белковый экстракт, сливалась в колбу из термостабильного стекла и помещалась в водяную баню, температура в которой постепенно доводилась до 80^oC, после чего содержимое колбы охлаждали до 0^oC. Охлажденную смесь центрифугировали на ультрацентрифуге (45000 g) в течение 1 ч. Получаемый в результате супернатант, являющийся 2-й фракцией, подвергался выдержке в течение 1,5 ч при минус 4^oC и смешивался с охлажденным до минус 40^oC ацетоном в соотношении 1:5. Смесь центрифугировалась на ультрацентрифуге (19000 g) в течение 1 часа при 0^oC. Полученный осадок является 3-ей фракцией.

Далее осадок растворяли 10 мМ раствором Na₃PO₄ (pH 7,0) в соотношении 1: 10, после тщательного перемешивания в раствор, в соотношении 4:1, добавлялся насыщенный раствор (NH₄)₂SO₄. Далее раствор подвергался обычному центрифугированию (3500 об/мин) в течение 15 мин. После удаления осадка полученный супернатант подкислялся 10%-ным раствором CH₃COOH до показаний pH 4,0, смешивался в соотношении 1:1 с 50%-ным раствором (NH₄)₂SO₄ и вновь центрифугировался в течение 20 мин (3500 об/мин). Получаемый осадок растворялся примерно в 500 мл (до полного растворения) 10 мМ трис-HCl-буфера при pH 8,0 и лиофилизировался. Получаемое аморфное вещество светло-серого цвета является 4-й фракцией.

Далее высушенный материал растворялся в 50 мл трис-HCl-буфера и пропускался через хроматографическую колонку (Sephadex G-50), при помощи которой осуществлялся процесс обессоливания и получения необходимой фракции с содержанием белка не менее 2,0 мг/мл. Полученный материал подвергался лиофилизации, в результате чего получали 5-ю фракцию, представляющую собой аморфное вещество белого цвета.

Для раздельного получения иммуностимулирующих и ингибирующих подфракций, см. фиг. 1, полученное вещество вновь растворялось в 10 мМ трис-HCl-буфере и пропускалось через хроматографическую колонку (Lichrosorb RP-8) в градиенте метанола 5-55%. На основе предварительных испытаний в розеткообразующем тесте получаемые компоненты в соответствии с проявляемыми свойствами объединялись в суммарные фракции и отдельно лиофилизировались. Как видно из фиг. 1, иммуностимулирующая активность присуща лишь 13 компонентам, а ингибирующие компоненты составили более 1/3 общего количества.

Как показали исследования, наибольший выход вещества 5-й фракции, до 280 мг на 1 кг сырья, достигается в случае, когда при обработке материала на ультрацентрифугах его температура поддерживалась на уровне от 0 до -4^oC.

На фиг. 2 показано действие высокоочищенного иммуномодулятора, полученного по предлагаемому способу, в сравнении с действием иммуностимулятора, полученного известным способом.

Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным за счет более высокой биологической активности иммуностимулирующей фракции при меньших концентрациях и получения фракции, обладающей ингибирующими свойствами, с учетом уменьшения потерь при получении 5-й фракции, обеспечивает более эффективную переработку исходного сырья.