способ получения рекомбинантного инсулина человека

Формула изобретения

Способ получения рекомбинантного инсулина человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli, разрушение клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка, его расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б с последующей очисткой и получением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используют штамм Escherichia coli JM109/pPINS07, очистку ренатурированного гибридного белка осуществляют путем осаждения примесных соединений в 40% изопропаноле с последующей хроматографией на КМ-сефарозе, расщепление гибридного белка трипсином и карбоксипептидазой Б осуществляют последовательно, при этом продукты трипсинолиза хроматографируют на СП-сефарозе, уравновешенной 0,03 - 0,1 М аммоний-ацетатным буфером, рН 5,0 - 6,0, содержащим 6 М мочевины, с элюцией фракций линейным градиентом хлористого натрия 0 - 0,5 М в стартовом буфере, а полученную после расщепления карбоксипептидазой Б фракцию инсулина очищают методом высокоэффектной жидкостной хроматографии на обращенных фазах с последующей гель-фильтрацией.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению рекомбинантного инсулина человека для приготовления лекарственных форм различного срока действия при лечении сахарного диабета.

Инсулин - гормон поджелудочной железы, регулирующий процессы углеводного обмена и поддержания нормального уровня сахара в крови. Потребности в данном препарате не могут быть покрыты инсулином животного происхождения из-за ограниченности сырьевой базы. Кроме того, существует необходимость в использовании при лечении диабета различных препаратов инсулина. Поэтому разработка способов получения инсулина из рекомбинантных штаммов микроорганизмов является актуальной медицинской задачей.

Известен способ получения рекомбинантного инсулина человека, предложенный J. Nilsson с соавторами (1). Способ заключается в культивировании штамма-продуцента Е. coli, продуцирующего проинсулин, содержащий два синтетических IgG связывающих домена стафилококкового белка А. Авторам удалось добиться высокой продуктивности штамма-продуцента за счет использования ими разработанной богатой питательной среды. Выход проинсулина составлял 3 г/л питательной среды. Схема выделения заключалась в разрушении бактериальных клеток, получении телец включения, содержащих проинсулин, растворении телец включения, окислительного сульфитолиза проинсулина, его ренатурации, очистке ренатурированного белка IgG-Sepharose аффинной хроматографией, расщеплении проинсулина протеолитическими ферментами (трипсином и карбоксипептидазой Б) и заключительной очистке инсулина высокоэффективной обращенно-фазовой жидкостной хроматографией.

Недостатками данного способа являются: использование богатой питательной среды для выращивания микроорганизма, длительное (около 34 часов) время выращивания, высокая себестоимость целевого продукта, обусловленная использованием для очистки аффинного сорбента, дорогого в производстве и недолговечного при промышленном использовании. Недостатком можно также считать использование в технологии получения инсулина детергента Tween 20. Известно, что использование детергентов при выделении белков приводит к их сорбции на белок и присутствию детергента в конечном продукте.

В качестве ближайшего аналога принят способ получения рекомбинантного инсулина человека, заключающийся в том, что культивируют клетки штамма-продуцента Escherichia coli ДН5/pVK100, разрушают бактериальные клетки дезинтеграцией, отделяют фракцию телец включения, содержащих гибридный белок, от водорастворимых примесей при помощи центрифугирования, растворяют тельца включения в буфере, содержащем 8 М мочевину, 1 мМ дитиотреитола, 0,1 М трис HCl, pH 8,0, в течение 12 - 16 часов. Нерастворившиеся примеси удаляют центрифугированием, после чего увеличивают концентрацию дитиотреитола до 10 мМ и восстанавливают дисульфидные связи при 4^oC в течение 1 часа. Раствор разбавляют в 5 раз холодной водой, на pH-метре доводят pH до 4,5 и выдерживают 2 часа при 4^oC для формирования осадка. Осадок, содержащий гибридный белок, отделяют центрифугированием и ренатурируют, быстро растворяют в холодной воде при pH 10-12, после чего разводят 10 мМ гициновым буфером pH 10,8 и выдерживают при 4^oC в течение ночи. После ультрафильтрации раствор подвергают гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-50 и элюируют 10 мМ глициновым буфером. Собирают фракции, содержащие гибридный белок, проводят ультрафильтрацию и лиофильно высушивают. Полученный гибридный белок растворяют в 0,08 М трис HCl буфере, pH 7,5 до концентрации 10 мг/мл и расщепляют одновременно трипсином и карбоксипептидазой Б в соотношении 0,3:1:10 (белок карбоксипептидазы Б : белок трипсинат : гибридный белок) при 37^oC в течение 30 минут. Затем добавляют изопропанол до 40%. Смесь немедленно подвергают хроматографической очистке на колонке с ДЭАЕ-сефадексом А-25 и элюируют 0,05М трис HCl буфером, pH 7,5 с 40% изопропанола с линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 0,1М. После испарения изопропанола концентрацию хлористого натрия увеличивают до 25% и сдвигают pH до 2,0, добавляя 4 N соляную кислоту. Собирают осадок целевого продукта-инсулина (2).

Однако известный способ имеет ряд существенных недостатков. Использование гель-фильтрации на начальных стадиях вызывает значительные сложности при масштабировании процесса очистки, так как требует больших объемов сорбента. В полученном таким образом материале должны содержаться примеси небелковой природы, о которых не сообщается. Они могут существенно затруднить проведение регенерации сорбента. Известно также, что расщепление гибридного белка трипсином наряду с аргинин- и диаргинининсулином образуется и дезтреонининсулин из-за наличия в положении 29 В-цепи инсулина лизина. Разделение дезтреонининсулина и инсулина представляет определенную проблему из-за близости свойств данных полимеров. Авторы не сообщают, анализировалось ли содержание дезтрионининсулина, хотя при столь высоком соотношении трипсин : гибридный белок (1:10) вероятность его накопления в препарате очень велика.

Задачей изобретения является создание способа получения высокоочищенного рекомбинантного инсулина человека, позволяющего упростить технологию его производства.

Сущность изобретения состоит в том, что в способе получения рекомбинантного инсулина человека, включающем культивирование штамма-продуцента Escherichia coli, разрушение бактериальных клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка, его расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б с последующей очисткой и получением целевого продукта, в качестве штамма-продуцента используют штамм Escherichia coli JM109/pPINS07, очистку ренатурированного гибридного белка осуществляют путем осаждения примесных соединений в 40% изопропаноле с последующей хроматографией на КМ-сефарозе, расщепление гибридного белка трипсином и карбоксипептидазой Б осуществляют последовательно, при этом продукты трипсинолиза хроматографируют на СП-сефарозе, уравновешенной 0,03-0,1 М аммоний-ацетатным буфером pH 5,0-6,0, содержащим 6 М мочевины, с элюцией фракций линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 0,5 М в стартовом буфере, а полученную после расщепления карбоксипептидазой Б фракцию инсулина очищают методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенных фазах с последующей гель-фильтрацией.

Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат.

Предлагаемый способ позволяет получить высокоочищенную субстанцию рекомбинантного инсулина человека с чистотой не ниже 96% и содержанием бактериальных пептидов и проинсулина требуемого уровня (10 ppM). При этом активность полученного инсулина составляет не ниже 26 Е/мг.

В предлагаемом способе все промежуточные стадии получения рекомбинантного инсулина человека не содержат принципиальных сложностей, препятствующих их масштабированию. Используемые реактивы широко доступны, сорбенты выдерживают многократные циклы. Полученная высоко-очищенная субстанция инсулина соответствует требованиям зарубежных фармокопей, что открывает широкие возможности промышленного освоения способа.

Разработанная авторами определенная последовательность и сочетание технологических приемов выделения и очистки гибридного белка, в том числе его поэтапное расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б с проведением хроматографии продуктов трипсинолиза, а также использование высокоэффективной жидкостной хроматографии позволило получить инсулин более высокого качества и степени очистки.

Способ осуществляется следующим образом.

Для получения рекомбинантного инсулина человека используют рекомбинантный штамм бактерии Escherichia coli JM109/pPINS07-продуцент гибридного полипептида, содержащего проинсулин человека. Штамм депонирован в Центральной коллекции микроорганизмов Российского акционерного общества "БИОПРЕПАРАТ" ЦКМК "Б" под N ЦКМ В-66ИН. Он получен авторами изобретения.

Для получения штамма-продуцента гибридного полипептида, содержащего проинсулин человека, трансформируют компетентные клетки Escherichia coli JM109 рекомбинантной плазмидной ДНК pPINS07.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pPINS07 кодирует гибридный белок, в котором последовательность IgG-связывающего домена В стафилококкового белка А соединена через пептидный линкер His₆GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина человека. Она содержит EcoRI/HindIII-фрагмент плазмиды рКК223-3, включающий гибридный tac-промотор, ген -лактамазы (bla), участок инициации репликации (ori) и терминатор транскрипции рибосомого оперона Е. coli, EcoRI/BamHI-фрагмент (220 п.о.), кодирующий IgG-связывающий домен белка A из S. aureus и гексагистидиновый домен, и синтетический BamHI/HindIII-фрагмент (271 п.о.), кодирующий последовательность аргинил-проинсулина человека.

Штамм Е. coli JM109/pPINS07 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Грамотрицательные прямые палочки 1,1-1,5 х 2,0-6,0 мкм, одиночные или в парах, подвижные, движутся парами при помощи перитрихальных жгутиков, или неподвижные. На питательном агаре с ампициллином к 16 - 18 часам роста образуют слабовыпуклые колонии 1,5-2,0 мм в диаметре, гладкие, с блестящей поверхностью, с ровным краем, сероватого цвета.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах от 4 до 45^oC при оптимуме pH 5,8-7,8. Сбраживают до кислоты глюкозу, мальтозу, маннит, маннозу, глицерин.

В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот.

Нитраты восстанавливают до нитритов.

Желатину не разжижают.

Индол не образуют.

Уреазная активность не обнаруживается.

Устойчивость к антибиотикам.

Проявляет устойчивость к ампициллину.

Пример.

Культивирование клеток рекомбинантного штамма Escherichia coli JM109/pPINS07-продуцента гибридного полипептида (белка), содержащего проинсулин человека, в условиях, обеспечивающих накопление гибридного белка. Используют питательную среду следующего состава (г/л):

Гидролизат казеина солянокислотный - 20

Экстракт пекарских дрожжей - 14

Двухзамещенный фосфат калия трехводный - 6

Однозамещенный фосфат калия - 3

Сульфат магния - 0,5

Натрий хлористый - 5

Глюкоза - 10

Ампициллина натриевая соль - 0,05

Дистиллированная вода - Остальное

Данную среду разливают в 7 качалочных колб по 100 мл и засевают жидкозаконсервированной культурой штамма-продуцента. Колбы помещают на 18 часов в термостатируемую качалку при 24^oC. Полученным инокулятом засевают посевной ферментер емкостью 10 л с 7 л питательной среды аналогичного состава. Выращивание культуры в ферментере проводят при температуре 37^oC, pH 7,0, который поддерживают путем автоматической подтитровки 40% раствором гидроокиси натрия при концентрации растворенного кислорода (5015)% от насыщения, которую поддерживают путем изменения количества оборотов мешалки (от 100 до 800 об/мин) и подачи воздуха от 0,2 до 1,5 объемов воздуха по отношению к объему питательной среды в ферментере в минуту. Продолжительность выращивания - 8 часов до достижения культуральной жидкостью оптической плотности, равной 7 оптических единиц, измеряемой на спектрофотометре при длине волны 540 нм, в кювете с длиной оптического пути, равной 1 см.

Культуральную жидкость из лабораторного ферментера используют для засева ферментера объемом 100 дм³, содержащего 70 литров вышеуказанной питательной среды. Процесс биосинтеза гибридного белка в ферментере проводят при соблюдении следующих параметров, которые поддерживают автоматически с регистрацией на самописцах:

температуре 37^oC;

pH 7,0, который поддерживают путем автоматической подтитровки 40%-ным раствором гидроокиси натрия;

концентрации растворенного кислорода (pO₂) - 50% от насыщения, которую поддерживают путем изменения количества оборотов мешалки (от 100 до 800 об/мин) и подачи воздуха от 0,2 до 1,5 объемов воздуха по отношению к объему питательной среды в ферментере в минуту;

пеногашение - на уровне датчика пенообразования с использованием пропинола или другого силиконового пеногасителя.

Во время ферментации каждые 30 минут отбирают пробы для измерения оптической плотности культуральной жидкости на спектрофотометре при длине волны 540 нм и длине оптического пути в кювете спектрофотометра, равной 1 см. При достижении оптической плотности 7,5 обычно через 6 часов от начала культивирования в логарифмической фазе роста проводят индукцию синтеза гибридного белка введением в ферментер 70 см³ раствора, содержащего 2,6 г изопропилтио-бета-D-галактопиранозида. После введения в ферментер индуктора биосинтеза гибридного белка культивирование ведут в течение 5 часов до достижения культурой оптической плотности, равной 30 OE. Полученную биомассу концентрируют сепарированием и замораживают.

Далее осуществляют выделение и очистку гибридного белка, включающие следующие этапы.

Получение телец включения, содержащих гибридный белок рекомбинантного инсулина человека.

100 г осажденных клеток Е. coli штамма-продуцента JM109/pPINS07 с суммарным содержанием белка 10 г, определяемым методом Лоури, и содержанием гибридного белка 2 г, определяемым электрофорезом в ПААГ и высокоэффективной жидкостной хроматографией, суспендируют в 500 мл буфера, pH 7,5, содержащего 0,05 М трис-(гидроксиметил)- аминометана, 0,05 М этилендиаминотетрауксусной кислоты, 2 М мочевины, и дезинтегрируют на ультразвуковом дезинтеграторе или на дезинтеграторе Гаулина. После разрушения клеток фракцию телец включения отделяют центрифугированием при 9000 об/мин в течение 30 минут.

Растворение телец включения.

Полученные тельца включения растворяют в соотношении 1:4 (вес телец включения в граммах, объем буфера в см³) на магнитной мешалке при постоянном перемешивании в 0,05 М трис-HCl, pH 8,0, содержащем 8,0 М мочевину и 0,001 М дитиотреитол. Растворение проводят при температуре 18^oC в течение 12 часов.

Восстановление дисульфидных связей гибридного белка.

Раствор гибридного белка помещают в водяную баню и по достижении температуры 37^oC добавляют до 5 мМ сухого дитиотреитола при постоянном перемешивании. После полного растворения соли смесь инкубируют в течение часа при постоянном перемешивании.

Кислотное осаждение гибридного белка.

Раствор гибридного белка разбавляют при перемешивании на магнитной мешалке пятью объемами предварительно охлажденной до 4^oC ультрачистой водой 0,1 N соляной кислотой, доводят pH раствора до 4,5 и при температуре 4^oC инкубируют раствор гибридного белка в течение 3 часов. В процессе инкубации образуется осадок, содержащий гибридный белок, который отделяют центрифугированием при 9000 об/мин в течение 30 минут.

Ренатурация гибридного белка.

Осадок взвешивают на весах, растворяют в двойном объеме по отношению к весу осадка ультрачистой воды, доводя до pH 12 1 N NaOH, при постоянном перемешивании. Нерастворившийся материал отделяют центрифугированием при 9000 об/мин в течение 30 минут. Супернатант помещают в емкость и добавляют 0,05 М глицин-NaOH буфер, pH 10,8 в количестве, необходимом для получения концентрации белка 0,5 мг/мл. Раствор оставляют при температуре 14^oC на 14 часов.

Спиртовое осаждение примесных белков.

1 N соляной кислотой на pH-метре доводят pH раствора до 7,5. К раствору добавляют изопропанол до конечной концентрации, равной 40%.

Смесь инкубируют при температуре 4^oC в течение 14 часов. Образующийся осадок отделяют центрифугированием при 9000 об/мин в течение 30 минут.

Хроматография гибридного белка на КМ-сефарозе.

Супернатант подвергают хроматографической очистке на КМ-сефарозе. Колонку размером 26/30, содержащую 30 мл КМ-сефарозы, уравновешивают 0,05 М трис-HCl буфером, pH 7,5, с добавлением 1,5 М мочевины. Наносят на колонку раствор гибридного белка и промывают уравновешивающим буфером до достижения базовой линии контрольного оборудования для детекции белков. Сорбированный белок элюируют с колонки, пропуская через нее исходный буфер с добавлением 0,25 М NaCl. Фракции, содержащие гибридный белок, объединяют и используют для получения высокоочищенной субстанции инсулина.

Расщепление гибридного белка трипсином.

Определяют в растворе содержание гибридного белка методом Лоури, доводят его концентрацию на ультрафильтрационной ячейке до 5 мг/мл и добавляют раствор трипсина в соотношении гибридный белок:трипсин, равном 600:1. Для остановки реакции триптического расщепления гибридного белка в раствор вносят трифторуксусную кислоту до pH 3,85. Критерием выбора времени остановки реакции триптического расщепления белка является прекращение накопления диаргинининсулина и увеличение содержания других продуктов (особенно, дезамидоинсулина).

Хроматография продуктов трипсинолиза гибридного белка на СП-сефарозе.

Раствор с продуктами триптического расщепления гибридного белка наносят на колонку размером 26/30, содержащую 100 мл СП-сефарозы ФФ, предварительно уравновешенную 0,03 М аммоний-ацетатным буфером, pH 5,0 с 6 М мочевиной. Промывают уравновешивающим буфером до достижения базовой линии контрольного оборудования для детекции белков. Сорбированный материал элюируют линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 0,5 М в стартовом буфере в течение 8 часов при скорости протока элюента 180 мл/час. Объединяют фракции, содержащие диаргинининсулин без примеси дезтреонининсулина.

В качестве уравновешивающего может быть использован 0,02 М аммоний-ацетатный буфер, pH 6,0 с 6 М мочевины.

Удаление концевых аргининов обработкой карбоксипептидазой Б.

Объединенный материал, полученный после хроматографии на СП-сефарозе, концентрируют методом ультрафильтрации, определяют содержание белка и приводят раствор к следующим условиям: концентрация диаргинининсулина 1 мг/мл, мочевины 3 М, трис-HCl буфер, pH 7,85. Превращение диаргинининсулина в инсулин достигается путем его расщепления карбоксипептидазой Б в соотношении 1: 500 (количество белка карбоксипептидазы Б: количество белка диаргинининсулина). Для этого при комнатной температуре в раствор диаргинининсулина вносят при перемешивании расчетное количество карбоксипептидазы Б. Для остановки реакции под контролем pH-метра при непрерывном перемешивании в реакционную смесь добавляют 10%-ный раствор трифторуксусной кислоты, доводя pH раствора до 3,85. Критерием выбора времени остановки реакции является полное превращение диаргинининсулина в инсулин, определяемое аналитически методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Очистка инсулина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенных фазах.

Полученный раствор инсулина концентрируют ультрафильтрацией до концентрации 8 мг белка в 1 мл и подвергают хроматографической очистке на обращенных фазах.

Очистку инсулина проводят на стандартном оборудовании для обращенно-фазовой жидкостной хроматографии высокого давления любой из фирм, производящих такое оборудование. Для проведения работ устанавливают колонку для хроматографии "Диасорб" C₁₆T, 25 х 250, 6 - 7 мкм или аналогичную другой фирмы-производителя. Колонку уравновешивают водным раствором, содержащим 10% ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты. В подготовленную колонку при помощи петли и инжектора вводят пробу, содержащую инсулин в количестве 1,0 г белка. Разделение ведут по программе, представленной в таблице.

Регистрацию процесса разделения ведут при 220 нм на проточном спектрофотометре при чувствительности прибора 0,1. Собранные фракции основного пика инсулина анализируют на содержание примесей методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Фракции инсулина, не содержащие примесей дезамидоинсулина, используют для дальнейшей очистки.

Получение высушенного инсулина.

Из объединенных фракций, содержащих инсулин, удаляют ацетонитрил путем выпаривания на роторном испарителе, после чего препарат лиофильно высушивают.

Очистка инсулина методом гель-фильтрации.

Гель-фильтрацию инсулина проводят на колонке размером 26/60, содержащей 250 мл сефадекса G-50. Колонку уравновешивают 1 М раствором уксусной кислоты. Препарат инсулина человека в 1 М растворе уксусной кислоты доводят до оптической плотности 90-100 единиц при длине волны, равной 277 нм. При необходимости, если раствор инсулина мутный, производят корректировку pH до 3,0 концентрированной уксусной кислотой. Перед введением раствора инсулина в хроматографическую колонку его фильтруют через мембрану с размером пор 0,22 мкм. Раствор инсулина вводят в верхнюю часть колонки с помощью перистальтического насоса со скоростью 4,8 мл/см² в час. После введения раствора инсулина в колонку подают элюент, 1 М раствор уксусной кислоты, с той же скоростью. Раствор 1 М уксусной кислоты пропускают через колонку с носителем до отсутствия поглощения в ультрафиолетовой части спектра при 277 нм. Фракции белка объединяют в соответствии с хроматографическими зонами на выходной кривой распределения белков. В объединенной фракции, используемой как субстанция инсулина, спектрофотометрически определяют содержание белка и биологическую активность, которая составляет 26,5 Е/мг инсулина.

Таким образом, проведение хроматографической очистки на нейтральных носителях позволяет получить инсулин человека с чистотой не ниже 96% и активностью не ниже 26 Е/мг.

Подлинность полученного целевого продукта подтверждена по следующим параметрам:

по совпадению времени удержания основного пика целевого продукта и международного референс-стандарта USP (Фармакопея USP 23, США);

по пределению биологической активности целевого продукта (ВФС 42-3045-98), которая составляет не менее 26 Ед/мг;

по совпадению аминокислотного состава целевого продукта и референс-стандартного образца фирмы "Эли Лилли", США. Определение аминокислотного состава проводили по НД-42-8098-97 фирмы "Ново Нордикс", Дания;

по совпадению аминокислотных последовательностей с C- и N-концов (по 15 аминокислот), которое проводили по стандартной методике (Methods in Enzymology, v. 25, 1967);

по совпадению пептидных карт целевого продукта и референс-стандарта USP (институт биоорганической химии РАН, в печати).

Чистота полученного целевого продукта подтверждена по фармакопеи USP 23, США и составила:

по содержанию целевого продукта, определяемого методом ВЭЖХ, не менее 95%;

по содержанию проинсулина, менее 10 ррм;

по содержанию бактериальных пептидов, менее 10 ррм;

по содержанию дезамидоинсулина, менее 2%.

Источники информации

1. Nilson J., Jonasson P., Samuelsson E., Stahl S., Uhlen M. Integrated production of human insulin and its C-peptide. 1996, Journal of biotechnology, v. 48, p. 241-250.

2. Chen J. -Q. , Zhang H.-T., Hu M.-H., Tang J.-G. Production of human insulin in an E. coli system with met-lys-human proinsulin as the expressed precursor. 1995, Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 55, p. 5-15.