способ эффективного производства 7-адцк через 2- (карбоксиэтилтио) ацетил-7-адцк и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-адцк

Формула изобретения

1. Способ получения и выделения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДЦК) путем а) трансформации штамм Penicillium chrysogenum геном экспандазы под контролем транскрипционных и трансляционных сигнальных последовательностей экспрессии нитчатых грибов; б) выращивания указанного штамма в культуральной среде и добавления в указанную среду N-ацил предшественника боковой цепи или его соли, или эфира, пригодных для образования N-ацил-6-аминопенициллановой кислоты (N-ацил-6-АПК), кольцо которой in situ расширяется с образованием N-ацил-7-АДЦК, в) выделения N-ацил-7-АДЦК из ферментационной среды, г) деацилирования указанной N-ацил-7-АДЦК и д) выделения кристаллической 7-АДЦК, отличающийся тем, что N-ацил предшественник боковой цепи представляет собой 3"-карбоксиметилтиопропионовую кислоту, пригодную для образования 2-(карбоксиэтилтио)ацетил и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-6-АПК, кольцо которой in situ расширяется с образованием 2-(карбоксиэтилтио)ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный штамм Penicillium chrysogenum трансформируется геном экспандазы под контролем транскрипционных и трансляционных сигнальных последовательностей экспрессии ацилтрансферазного гена.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что стадия (д) является стадией фильтрации.

4. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия (в) является стадией фильтрации и с экстрагированием фильтрата жидкой питательной среды органическим растворителем, не смешиваемым с водой при pH ниже примерно 4,5, и обратным экстрагированием тех же веществ водой при pH от 4 до 10.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что ген экспандазы получен из Streptomyces clavuligerus или Nocarlia Lactamdurans.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения и краткое описание известного уровня техники

Данное изобретение относится к процессу биосинтеза для получения и выделения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДЦК).

Беталактамные антибиотики образуют наиболее важную группу антибиотических соединений с длительной историей клинического применения. В этой группе выделяются пенициллины и цефалоспорины. Эти вещества природно продуцируются нитчатыми грибами Penicillium chrysogenum и Acremonium chrysogenum соответственно.

В результате применения методов улучшения классического штамма уровня продукции антибиотиков Penicillium chrisogenum и Acremonium chrisogenum значительно увеличены за последние десятилетия. С увеличением знаний о метаболических путях биосинтеза, приводящих к продукции пенициллинов и цефалоспоринов, и приходом генной инженерии стали доступны новые средства повышения продуктивности штаммов и получения производных соединений in vivo.

Большая часть ферментов, участвующих в биосинтезе беталактамов, уже идентифицирована, и клонированы соответствующие им гены, что можно найти у Ingolia and Queener, Med. Res. Rev. 9 (1989), 245 -264 (путь биосинтеза и ферменты), и Aharonowitz, Cohen, and Vartin, Ann. Rev. Microbiol. 46 (1992), 461 - 495 (клонирование генов).

Первые два этапа в биосинтезе пенициллина у P. chrisogenum являются конденсацией трех аминокислот, L-5-амино-5- карбоксипентановой кислоты (L--аминоадипиновой кислоты) (A), L-цистеина (C) и L-валина (V) в трипептид LLD - ACV с последующей циклизацией этого трипептида с образованием изопенициллина N. Это соединение содержит типичную беталактамную структуру.

Третий этап включает замену гидрофильной боковой цепи из L- 5амино-5-карбоксипентановой кислоты на гидрофобную боковую цепь путем воздействия фермента ацетилтрансферазы (AT). При промышленном способе производства пенициллина G боковой цепью выбора является фенилуксусная кислота (ФУ). В ЕР-А-0 532 341 раскрыто применение в качестве сырья для производства адипата (5- карбоксипентаноата). Включение этого субстрата приводит к образованию пенициллинового производного с 5-карбоксипентаноиловой боковой цепью, а именно 5-карбоксипентаноил-6- аминопенициллановой кислоты. Это включение происходит благодаря тому факту, что ацетилтрансфераза обладает доказанной широкой субстратной специфичностью (Behrens et al., J. Biol. Chem. 175 (1948), 751 - 809; Cole, Process. Bichem. 1 (1966), 334 - 338; Ballio et al., Nature 185 (1960), 97 -99). Ферментативная реакция обмена, опосредуемая AT, происходит внутри клеточной органеллы, микротельца, что было описано в ЕР-А-0 488 180.

Цефалоспорины значительно более дорогостоящи, чем пенициллины. Одна из причин этого состоит в том, что некоторые цефалоспорины (например, цефалексин) получают из пенициллинов путем ряда химических превращений. Другой причиной является то, что до сих пор ферментации могут подвергаться только цефалоспорины с D-5-амино-5-карбоксипентаноиловой боковой цепью. Цефалоспорин C, несомненно, наиболее важный исходный материал в этом отношении, очень хорошо растворим в воде при любом pH, что подразумевает длительные и дорогие процессы выделения с использованием громоздкой и дорогостоящей колоночной хроматографии. Цефалоспорин C, полученный таким образом, необходимо превращать в терапевтически применяемые цефалоспорины с помощью ряда химических и ферментативных превращений.

Промежуточная 7-АДЦК в настоящее время производится с помощью химического получения производных пенициллина G. Необходимые этапы химического процесса получения 7-АДЦК включают расширение пятичленной структуры пенициллинового кольца до 6- членной структуры цефалоспоринового кольца. Однако фермент экспандаза из нитчатой бактерии Streptomyces clavuligerus может осуществлять подобное расширение кольца. При введении в P. chrysogenum он может превращать пенициллиновую кольцевую структуру в цефалоспориновую кольцевую структуру, как описано у Cantwell et al., Proc. R. Soc. Lond. B. 248 (1992), 283 - 289; и в ЕР-А- 0 532 341 и ЕР-А- 0 540 210. Фермент экспандаза хорошо охарактеризован (ЕР-А- 0 366 354) как биохимически, так и функционально, так же как и соответствующий ему ген. Были описаны как физические карты гена cefE (ЕР-А- 0 233 715), последовательность ДНК, так и исследования по трансформации P.chrysogenum с помощью cefE. Еще одним источником подходящего фермента расширения кольца является нитчатая бактерия Nocardia lactamdurans (первоначально Streptomyces lactamdurans). Описаны как биохимические свойства этого фермента, так и последовательность ДНК гена (Cortes et al., J. Gen. Microbiol. 133 (1987), 3 165 - 3 174; and Coque et al., Mol. Gen. Genet. 236 (1993), 453 - 458 соответственно).

Более конкретно в ЕР-А-0 532 341 раскрывается использование фермента экспандазы в P. chrysogenum в сочетании с 5- карбоксипентаноиловой боковой цепью в качестве сырьевого источника, который используется как субстрат для ацетилтрансферазного фермента в P. chrysogenum. Это приводит к образованию 5- карбоксипентаноил-6-АПК, которая превращается с помощью фермента экспандазы, введенного в штамм P. chrysogenum, с получением 5- карбоксипентаноил-7-АДЦК. В конце предполагается удаление 5- карбоксипентаноиловой боковой цепи, дающее 7-АДЦК в качестве конечного продукта. В патентной заявке ЕР-А- 0 540 210 описывается сходный процесс получения 7-АЦК, включающий дополнительные этапы превращения 3-метильной боковой цепи кольца АДЦК в 3-атоксиметильную боковую цепь. Однако в вышеуказанных патентных заявках не раскрывается эффективный и экономически эффективный процесс, потому что прежде всего не была решена проблема своевременной экспрессии фермента экспандазы в клетке, сопутствующей экспрессии фермента ацетилтрансферазы.

В отличие от этого данное изобретение представляет эффективный способ продукции 7-АДЦК, при котором экспандаза и ацетилтрансфераза экспрессируются одновременно.

Кроме того, применение нового предшественника боковой, а именно 3"-карбоксиметилтиопропионовой кислоты, также раскрыто в этом изобретении. Этот предшественник очень эффективно включается P. chrysogenum в соответствующие пенициллины, кольцо которых расширяется с помощью последующего действия фермента экспандазы.

К тому же до сих пор не был описан эффективный способ выделения производного 7-АДЦК из жидкой ферментационной среды перед его диацилированием. Данное изобретение представляет эффективную процедуру экстракции растворителем для выделения производного 7-АДЦК.

С помощью данного изобретения обеспечивается эффективный завершенный процесс получения 7-АДЦК, включающий этапы реакции, не раскрытые и не предложенные в прототипах до сих пор.

Также путем применения данного изобретения и аналогично описанию, данному в ЕР-А-0540210, может быть получена 7-АЦК по завершенному эффективному процессу таким образом.

Краткое описание фигур.

Фиг.1: функциональная карта плазмиды pVcTNE.

Фиг.2: функциональная карта плазмиды pMcTSE.

Фиг.3: функциональная карта плазмиды pMcTNde.

Фиг.4: функциональная карта плазмиды pGNETA.

Фиг.5: функциональная карта плазмиды pGSETA.

Фиг.6: функциональная карта плазмиды pANETA.

Фиг.7: функциональная карта плазмиды pASETA.

Фиг. 8: последовательность ДНК cefE Nocardia lactamdurans (Coque et al., выше) (нижние строки) в сравнении с последовательностью продукта I ПЦР (верхние строки).

Краткое описание перечня последовательностей

Последовательности ИД NN с 1 по 13: олигонуклеотиды, использованные в конструировании кассеты экспрессии P. chrysogenum для генов cefE Streptomyces clavuligerus и Nocardia lactamdurans.

Последовательность ИД N 14: последовательность ДНК cefE Nocardia lactamdurans (Coque et al., выше).

Краткое изложение изобретения

Данное изобретение, таким образом, представляет способ получения и выделения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДЦК) путем:

a) трансформации штамма Penicillium chrysogenum с помощью гена экспандазы под транскрипционной и трансляционной регуляцией сигналов экспрессии нитчатого гриба;

b) выращивания указанного штамма в ферментере в культуральной среде и добавления к указанной культуральной среде 3"- карбоксиметилтиопропионовой кислоты или ее соли или эфира, подходящих для получения 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио) пропионил-6-аминопенициллановой кислоты (2- (карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-6-АПК), кольцо которых in situ расширяется с образованием 2- (карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АЛЦК;

с) выделения 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК из жидкой ферментационной среды;

d) децилирования указанной 2-(карбоксиэтилтио) ацетил-и 3- (карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК; и

е) выделения кристаллической 7-АДЦК.

Предпочтительно стадия (е) является стадией фильтрации.

Предпочтительно экспрессия гена экспандазы находится под транскрипционной и трансляционной регуляцией соответствующих контролирующих элементов АТ-гена, что обеспечивает одновременную координацию экспрессии указанных генов.

Предпочтительно 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК выделяют из жидкой ферментационной среды путем экстрагирования фильтрата среды органическим растворителем, несмешиваемым с водой при pH ниже примерно 4.5 и обратным экстрагированием тех же самых веществ водой при pH от 4 до 10.

Кроме того, представлены вектор рекомбинантной ДНК, содержащий ДНК, кодирующую экспендазу, функционально связанную с транскрипционными и трансляционными контролирующими элементами АТ- гена P. chrysogenum или gpdA гена A. nidulans, и клетки-хозяева, трансформированные такой ДНК.

Детальное описание изобретения

Данное изобретение относится к использованию функциональных генных конструкций в P. chrysogenum для расширения in vivo структуры пенициллинового кольца в сочетании с использованием нового субстрата для ферментов биосинтеза для образования производного ключевого промежуточного соединения в биосинтезе цифалоспоринов, 7-аминодезациотоксицефалоспорановой кислоты или 7-АДЦК. Это производное имеет химическое такое строение, которое дает возможность эффективной экстракции растворителем, обеспечивая таким образом экономически привлекательный процесс выделения.

Трансформация P. chrysogenum может, в принципе, достигаться с помощью различных средств доставки ДНК, такими как опосредуемое PEG-Ca поглощение протопластов, электропорация или методы обстрела частицами и отбором трансформантов. Смотрите, например, Van den Hondel en Punt, Gene Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi, in Applied Molecular Genetics of Fungi (Peberdy, Laten, Ogden, Bennett, eds.), Cambridge University Press (1991). Применение доминантных и недоминантных маркеров селекции было описано (Van den Hondel, выше). Были описаны маркеры селекции как гомологичного (происходящие из P. chrysogenum) и гетерологичного (происходящие не из P. chrysogenum) происхождения.

Применение различных маркеров селекции трансформантов, гомологичных или гетерологичных, в присутствии или в отсутствие векторных последовательностей, физически связанных или нет с неселектируемой ДНК, при селекции трансформантов хорошо известно.

Предпочтительно для селекции трансформантов P. chrysogenum используется гомологичный маркер селекции, чтобы ограничить количество гетерологичной ДНК, вводимой в P. chrysogenum. Наиболее предпочтительно использовать доминантный маркер селекции, который может селективно удаляться из трансформированного штамма, например, ген amdS A. nidulans или других нитчатых грибов (Европейская патентная заявка N 94 201 896.1). Эти предпочтительные характеристики маркера селекции трансформанта P. chrysogenum очень благоприятны для процесса и для процедур регистрации продукта, так как в процессе не участвуют маркеры, связанные с антибиотикоустойчивостью, или не будут вводиться в окружающую среду.

При наиболее предпочтительном воплощении маркер селекции amdS, который может селективно удаляться из штамма, дает возможность повторных циклов трансформации с использованием той же самой доминантной селекции снова и снова. Это свойство освобождения от маркера селекции у новых штаммов P. chrysogenum, экспрессирующих экспандазу, является определяющим для быстрой разработки высокопродуктивных штаммов по программе улучшения промышленных штаммов.

Способность к реакции расширения кольца, опосредуемая ферментом экспандазой, вводится и экспрессируется таким путем в P. chrysogenum, например, штамме Wisconsin 54-1255. Эта реакция расширения кольца происходит также и в их мутантах, дающих увеличенный выход беталактамов. Должно быть понятно, что в этом случае характеристики среды должны быть слегка адаптированы для получения эффективного роста.

Кроме того, ген cefE помещается под транскрипционный и трансляционный контроль соответствующих контролирующих ген элементов нитчатого гриба, предпочтительно происходящих из ацилтрансферазного (AT) гена P. chrysogenum, что дает возможность их экспрессии в оптимальных временных рамках, синхронизированных с действием самого фермента ацетилтрансферазы. Эти меры являются решающими для эффективности реакции расширения кольца в пенициллиновой молекуле.

В дополнение к синхронизированной экспрессии генов, кодирующих экспандазу и трансферазу, могло быть благоприятным для разработки экономичного процесса производства совместное расположение части экспандазных ферментов с ацетилтрансферазой в микротельцах (внутриклеточная локализация ацетилтрансферазы). При этих предпочтительных осуществлениях будет очень сильно снижаться количество пенициллиновых побочных продуктов, которые не допускаются в конечном продукте 7-АДЦК регистрационными органами.

Резюмируя, в данном изобретении раскрывается, как действие фермента экспандазы, введенного в P. chrysogenum, может быть нацелено на расширение пенициллинового кольца на основе синхронизированной экспрессии.

По этому изобретению промежуточные беталактамные соединения 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7- АДЦК продуцируются P. chrysogenum с помощью добавления 3- карбоксиметилтиопропионовой кислоты или ее соли или эфира. Подходящими солями, например, являются соли натрия или калия. Они же эффективно выделяются из среды путем простой экстракции растворителем, например, следующим образом.

Жидкая питательная среда отфильтровывается и к фильтрату добавляется не смешиваемый с водой органический растворитель. pH устанавливается так, чтобы проэкстрагировать цефалоспорин из водного слоя. Диапазон pH должен находиться ниже 4.5; предпочтительно в интервале от 4 до 1, более предпочтительно - от 2 до 1. Таким образом цефалоспорин отделяется от многих посторонних примесей, присутствующих в ферментационной среде. Предпочтительно используется небольшой объем органического растворителя, что дает концентрированный раствор цефалоспорина, и таким образом достигается снижение объемных скоростей потоков. Вторая возможность состоит в полной экстракции жидкой питательной среды при pH, равном 4 и ниже. Предпочтительно жидкая питательная среда экстрагируется в интервале от 4 до 1 органическим растворителем, несмешиваемым с водой.

Может использоваться любой растворитель, который не взаимодействует с молекулой цефалоспорина. Подходящими растворителями, например, являются бутилацетат, этилацетат, метилизобутилкетон, спирты, подобные бутанолу, и т.д. Предпочтительно используются 1-бутанол или изобутанол.

Затем цефалоспорин экстрагируется обратно водой при pH от 4 до 10, предпочтительно от 6 до 9. И снова конечный объем сильно снижается, выделение может проводиться при температурах от 0 до 50^oC и предпочтительно при температурах окружающей среды.

Водный раствор цефалоспорина, полученный таким образом, обрабатывается подходящим ферментом для удаления 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропиониловой боковой цепи и получения желаемой 7-АДЦК.

Предпочтительно используется иммобилизированный фермент, чтобы было возможно использовать этот фермент повторно. Методология получения таких частиц и иммобилизации ферментов была подробно описана в ЕР-А-0222462. pH водного раствора имеет значение, равное, например, от pH 4 до pH 9, при котором реакция деградации цефалоспорина минимизирована, а желаемое превращение с помощью фермента оптимально. Таким образом, фермент добавляется к водному раствору цефалоспорина при поддержании в то же время pH на соответствующем уровне с помощью, например, добавления неорганического основания, такого, как раствор гидроксида калия, или применения катионообменной смолы. Когда реакция завершается, иммобилизированный фермент удаляется фильтрованием. Другая возможность состоит в применении иммобилизованного фермента в колонке с фиксированным или ожиженным слоем или использовании фермента в растворе и удалении продуктов с помощью мембранной фильтрации. Затем реакционную смесь подкисляют в присутствии органического растворителя, несмешиваемого с водой.

Подходящие ферменты, например, получаются из микроорганизма Pseudomonas SY77, имеющего мутацию в одной или более позиций: 62, 177, 178 и 179. Также могут использоваться ферменты из других микроорганизмов Pseudomonas, предпочтительно Pseudomonas SY77, имеющих произвольно мутацию в одной или более позиций, соответствующих позициям 62, 177, 178 и 179 у Pseudomonas SY77.

После доведения pH до примерно от 0.1 до 1.5 слои разделяются и pH водного слоя доводится до примерно 2 - 5. Кристаллическая 7-АДЦК затем отфильтровывается.

Деацилирование может также выполняться химически известным способом, например, через образование иминохлоридной боковой цепи путем добавления пентахлорида фосфора при температуре ниже 10^oC и затем изобутанола при температуре окружающей среды или ниже.

Следующие примеры предлагаются в качестве иллюстрации, но не для ограничения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Экспрессия гена cefE Streptomyces и Nocardia в Penicillium chrysogenum.

а. Общие процедуры клонирования гена и генной трансформации.

В данной заявке используются обычные методики, используемые в процедурах клонирования гена. Эти методики включают полимеразные цепные реакции (ПЦР), синтез синтетических олигонуклеотидов, анализ нуклеотидной последовательности ДНК, ферментативное лигирование и рестрикцию ДНК, субклонирование вектора в E. coli, трансформацию и селекцию трансформантов, выделение и очистку ДНК, характеристику ДНК с помощью блот-анализа по Саузерну и меченых ³²P зондов, мечение ДНК ³²P путем случайного примирования. Все эти методики очень хорошо известны в этой области технологии и соответственно описаны во многих источниках. Смотрите, например, Sambrook et al. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, U.S.A. (1989), Innes et al., PCR protocols, a Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990), and McPher-son et al., PCR, a Practical Approach, IRL Press (1991).

Общие процедуры, использованные при трансформации нитчатых грибов и селекции трансформантов, включают получение протопластов грибов, перенос ДНК и режим регенерации протопластов, очистку и определение свойств трансформантов. Все эти процедуры хорошо известны в этой области знаний и очень хорошо документированы в: Finkelstein and Ball (eds.), Biotechnology of Filamentous Fungi, technology and products, Butter-worth-Heinemann (1992); Bennett and Lasure (eds. ), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press (1991); Turner, in: Puhler (ed.). Biotechnology, second completely revised edition, VCH (1992).

Более конкретное применение технологии клонирования генов и генной трансформации в отношении Penicillium chrysogenum очень хорошо документально отражено у Bennett and Lasure (выше) и Finkelstein и Ball (выше).

- Синтетические олигонуклеотиды ДНК синтезированы с использованием коммерческого синтезатора ДНК (Applied Biosystems, CA,U.S.A.) в соответствии с инструкциями производителя.

- ПЦР выполняется с использованием коммерческого автоматического аппарата для ПЦР (Perkin Elmer, U.S.A.) и ДНК- полимеразы (Perkin Elmer, U.S.A.) по инструкциям производителя.

- Процедуру hGC ПЦР (Dutton et al., Nucleic Acids Res. 21, (No. 12) (1993) 2953-2954) использовали, чтобы сделать возможной амплификацию кодирующих областей гена cefE хромосомной ДНК N. lactamdurans и S. clavuligerus.

- Ферменты рестрикции и другие ферменты для модификации ДНК получены из BRL (MD, U.S.A.) и использовались в соответствии с инструкциями производителя.

Вектор Е. coli pBluescript получен от Stratagene (СА, U.S.A.).

- Другие использованные химреактивы все имеют аналитическую чистоту и получены от разных поставщиков.

- Анализ нуклеотидной последовательности ДНК выполняли с использованием аппарата для автоматического анализа последовательности ДНК (Applied Biosystem), основанного на детекции, специфичной для флюоресцентной метки в соответствии с инструкциями производителя.

b. Культивирование микроорганизмов

Streptomyces clavuligerus АТСС 27 064 выращивается в трипсинизированном соевом бульоне (Difco). Хромосомная ДНК этого штамма использована для выделения гена cefE (Kovacevic et al., J. Bacteriol. (1989), 754-765).

Nocardia Lactamdurans ATCC 27 382 также выращивается в трипсинизированном соевом бульоне (Difco). Хромосомная ДНК этого штамма использована для выделения гена cefE (Coque et al., выше).

Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255 (АТСС 28 089) выращивается в полной среде YPD (YPD; 1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 2% глюкоза). Хромосомная ДНК этого штамма использована для выделения 5" и 3" регуляторных областей гена penDE, необходимых для экспрессии гена cefE. Penicillium chrysogenim АТСС 28 089 также используется в качестве хозяина для гена cefE в экспериментах по трансформации. Пригодны также другие штаммы Penicillium chrysogenum, включая мутанты штамма Wisconsin 54-1255, дающие увеличенный выход беталактамов. В зависимости от использованного маркера селекции трансформанта могут использоваться штаммы P. chrysogenum, содержащие мутации в гене pyrG, niaD или facA. Эти мутантные штаммы могут быть получены с помощью методов, хорошо известных в этой области технологии (Cantoral, Bio/technol. 5(1987), 494-497; Gouka et al., J. Bioteshn. 20 (1991), 189-200; and Gouka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1993), 514-519).

Культивирование P. chrysogenum для образования протопластов, используемых при трансформации, также производилось в среде YPD.

Хорошо известно, что процедуры образования протопластов и регенерации могут слегка отличаться в зависимости от конкретного использования штамма Penicillium chrysogenum и примененной процедуры селекции трансформанта.

Е. coil WK6 (Zell and Fritz, EMBO J. 6 (1987), 1809-1815), XLI-Blue (Stratagene и NB101 (Boyer and Roulland - Dssoix, J. Mol. Biol., 41 (1969), 459, Bolivar and Backman, Messages Enzymol. 68 (1979), 2040) сохранялись и культивировались с помощью использования стандартной среды для культивирования Е. coli, (Sambrook, выше).

с.Конструирование кассет экспрессии cefE

Кассеты экспрессии cefE перечислены в таблице 1 (см. в конце описания), которая также объясняет номенклатуру, которая была использована для этих плазмид.

Опубликованные нуклеотидные последовательности гена cefE S.clavuligerus (Kovacevic, выше); гена cefE N. lac tamdurans (Coque, выше); гена gpdA A. nidulans (Punt et al. Gene 69 (1988), 49-57); гена penDE P. chrysogenum (Barredo et al. Gene 83 (1989), 291-300; diez et al., Mol. Gen. Genet. 218 (1989), 572-576) были использованы для создания синтетических олигонуклеотидов, перечисленных в таблице II (см. в конце описания).

с1. Конструирование плазмид экспрессии cefE Е. coli, pMCTSE и pMCTNE

ПЦР, 1: cefE N. lactamdurans

В первой ПЦР с использованием хромосомной ДНК N. lactamdurans и олигонуклеотидов 1 и 2 была получена открытая рамка считывания cefE N. lactamdurans в виде продукта ПЦР в 0.9 kb, содержащего единственный сайт рестрикции NdeI на 5"-конце и единственный сайт XbaI на 3"-конце.

ПЦР, 2: cefE S. clavuligerus

Во второй ПЦР с использованием хромосомной ДНК S. clavuligerus и олигонуклеотидов 3 и 4 была получена открытая рамка считывания cefE S. clavuligerus в виде продукта ПЦР в 0.9 kb, также содержащего единственный сайт рестрикции NdeI на 5"-конце и единственный сайт рестрикции XbaI на 3"-конце.

С целью получения экспрессии генов cefE в Е. coli и определения характеристик продуктов ПЦР с помощью анализа последовательности ДНК продукты ПЦР 1 и 2 клонировали в векторе pMCTNde, производный от рМС-5 (Stanssens et al., Nucleic Acids Res. 17 (1989), 4441). Плазмида pMCTNde была получена из pMC5-8 (Европейская патентная заявка N 0351029) путем встройки фрагмента, кодирующего tac промотор, с последующим сайтом RBS и клонирующим сайтом NdeI (фигура 3).

Продукты ПЦР 1 и 2 расщепляли с помощью NdeI и XbaI и лигировали в расщепленный NdeI-XbaI вектор pMCTNde. Смесь лигирования использовали для трансформации Е. coli WK6. Трансформанты отбирали по резистентности к хлорамфениколу. Эти трансформанты используют для изоляции плазмидной ДНК. Вставку кассеты экспрессии cefE сначала анализировали с помощью расщепления рестрикционным ферментом на предсказанную генерацию рестрикционных фрагментов. Плазмиды, содержащие предсказанные сайты для рестрикционных ферментов, окончательно проанализированы с помощью автоматического анализа последовательности ДНК.

Последовательность ДНК открытой рамки считывания cefE S. clavuligerus в плазмиде pMCTSE (фигура 2) была на 100% идентична опубликованной последовательности (Kovacevic, выше).

Последовательность ДНК (фигура 8) всех клонов, которые были проанализированы, содержащая открытую рамку считывания cefE N. lactamdurans, отличалась от опубликованной последовательности (Coque, выше).

Аминокислотная последовательность, произведенная из опубликованного гена cefE N. lactamdurans, имеет пролин в положении 41 (смотрите Посл. ИД N 14). Этот пролин опущен в клонах, которые получены при ПЦР 1. Эта плазмида названа pMCTNE (фигура 1).

с2. Конструирование плазмид экспрессии cefE P. chrysogenum

ПЦР, 3: промотор gpdA

При этой третьей ПЦР с использованием плазмидной ДНК pAN7-1 (Punt et al. Gene 56 (1987), 117-124), содержащей ген hph E. coli под контролем промотора gpdA A. nidulans и олигонуклеотиды 5 и 6, был получен промотор gpdA в виде продукта ПЦР в 0.9 kb, содержащий единственный сайт рестрикции EcoRI на 5"-конце и единственный сайт NdeI на 3"-конце.

ПЦР, 4: AT промотор

В четвертой ПЦР хромосомная ДНК P. chrysogenum и олигонуклеотиды 7 и 8 были использованы для получения AT промоторного фрагмента, равного 1.5 kb, который также содержит единственный сайт рестрикции EcoRI на 5"-конце и единственный сайт NdeI на 3"-конце.

ПЦР, 5: AT терминатор и 3"-конец гена cefE N. lactamdurans

В пятой ПЦР была получена 0.5 kb терминаторная область (AT) penDE с использованием хромосомной ДНК P. chrysogenum и олигонуклеотидов 9 и 10 и 11 и 10 соответственно. Эти продукты ПЦР содержат, таким образом, 3"-концевую последовательность гена cefE с или без сигнала нацеливания к микротельцу, состоящего из C-концевой аминокислотной последовательности ARL (Muller et al., Biochimica et Biophysica Acta 1116 (1992), 210-213).

Олигонуклеотиды сконструированы таким образом, что единственный сайт BspEl встраивается на 5"-конце продукта ПЦР и единственный сайт SreI введен на 3"-конце продукта ПЦР.

ПЦР, 6: AT терминатор и 3"-конец гена cefE S. clavuli-gerus

В этой шестой ПЦР была получена 0.5 kb терминаторная область penDE (AT) с использованием хромосомной ДНК P. chrysogenum и олигонуклеотидов 12 и 10 и 13 и 10 соответственно. Эти продукты ПЦР, таким образом, содержат 3"-концевую последовательность гена cefE S. clavuligerus с или без сигнала нацеливания к микротельцу, состоящего из C-концевой аминокислотной последовательности SKL (De Hoop et al., Biochem. J. 286 (1992), 657-669).

Олигонуклеотиды сконструированы так, что единственный сайт рестрикции BqlI вводится на 5"-конце продукта ПЦР и единственный сайт SpeI получается на 3"-конце этого продукта ПЦР.

С целью получения экспрессии генов cefE в P. chrysogenum промотор gpdA и фрагмент промотора AT лигировали к фрагментам cefE из плазмид pMCTNE и pMCTSE. Эти лигированные фрагменты клонировали в вектор pBluescript II KS.

Продукт ПЦР 3 расщепляли EcoRI и NdeI. pMCTNE и pMCTSE расщепляли с помощью NdeI и XbaI. Фрагменты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле. Кодирующие фрагменты 0.9 kb cefE очищали из агарозного геля. Промоторный фрагмент EcoRI- NdeI лигировали вместе с фрагментами NdeI-XbaI cefE в расщепленный EcoRI-XbaI вектор pBluescript II KS. Таким образом были получены следующие плазмиды: pGSE и pGNE.

Для получения оптимальной экспрессии генов cefE в Р. chrysogenum мы выбираем клонирование сигнальной последовательности терминации AT после генов cefE в плазмидах экспрессии Penicillium, упомянутых выше.

pGNETA-pGNEWA

Продукты ПЦР 5 расщепляли с помощью BspEI и SpeI и лигировали в расщепленный BspEI и SpeI вектор pGNE. Смеси лигирования использовали для трансформации Е. coli НВ101. Трансформанты отбирали по устойчивости к ампициллину. Плазмиды, выделенные из этих трансформантов, охарактеризовывали с помощью анализа фрагментов рестрикции и затем с помощью анализа последовательности ДНК. Таким образом были получены следующие плазмиды: pGNEWA и pGNETA (фигура 4).

pGSENA-pGSEWA

Продукты ПЦР 6 расщепляли с помощью BqlI и SpeI и лигировали в расщепленный BqlI и SpeI вектор pGSE. Смеси лигирования использовали для трансформации Е. coli НВ101. Трансформанты отбирали по устойчивости к ампициллину. Выделенные из этих трансформантов плазмиды также охарактеризовывали с помощью анализа фрагментов рестрикции и затем анализа последовательности ДНК. Таким образом были получены следующие плазмиды: pGSEWA и pGSETA (фигура 5).

pANETA, pANEWA и pASETA и pASEWA

Плазмиды pGNETA, pGNEWA, pGSETA и pGSEWA рacщeпляли с помощью EcoRI и NdeI. Фрагменты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле и из геля очищали фрагменты 4.5 kb.

Продукт ПЦР 4 расщепляли с помощью EcoRI и NdeI и лигировали с очищенными фрагментами, упомянутыми выше. После трансформации лигированных смесей в Е. coli НВ101 трансформанты отбирали по резистентности к ампициллину.

Трансформанты подращивали и выделяли их плазмиды и характеризовали с помощью анализа фрагментов рестрикции и окончательно - с помощью анализа последовательности ДНК. Таким образом были получены желаемые конструкции, а именно: pANETA (фигура 6), pANEWA, pASETA (фигура 7) и pASEWA.

d. Трансформация P. chrysogenum

Использована процедура трансформации протопластов, опосредуемой Ca-PEG.

Следуя процедурам, описанным у Cantoral (смотрите выше), Gouka et al. (J. Biotechn., смотрите выше) и Gouka et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., смотрите выше) для трансформации штаммов P. chrysogenum использовали целую плазмиду или очищенный полигенный экспрессирующий кластер cefE (лишенный векторных последовательностей Е. coli) с генами pyrG, niaD, facA или amdS (Beri et al. , Curr. Genet. 11 (1987), 639-641) соответственно в качестве маркеров селекции.

Путем использования гомологичных маркеров селекции pyrG, niaD или facA в очищенной форме, лишенных векторных последовательностей Е. coli, были получены трансформированные штаммы P. chrysogenum, которые не содержат генов резистентности бактерий.

В Европейской патентной заявке N 94201896.1 описывается способ получения рекомбинантных штаммов, лишенных генов маркеров селекции. Этот метод был успешно использован на трансформантах P. chrysogenum, содержащих ген amdS A. nidulans в качестве доминантного маркера селекции.

В таком случае единственными элементами гетерологичного происхождения являются кодирующая область cefE 0.9 kb и произвольно промоторная область gpdA 0.9 kb.

е. Анализ трансформантов

Трансформанты P. chrysogenum очищают путем повторного культивирования на селективной среде. Единичные устойчивые колонии использованы для приготовления устойчивых косяков для получения спор и для проверки на трансформанты, содержащие кассету экспрессии cefE. Кипячение фрагмента свежего мицелия трансформантов на агаровой пластинке использовали для получения достаточного количества матричной ДНК для эффективной проверки сотен трансформантов на присутствие гена cefE при использовании метода ПЦР. (Seth, Fungal Genetics Conference, Asilomar (1991), Fungal Genetics Newsletter 38, 55). Действуя таким образом, установили эффективность трансформации.

Отбор трансформантов также выполняли, применяя биологические исследования. Трансформанты подращивали на агаризованной среде, которая содержала предшественника боковой цепи выбора. Е. coli ESS2231 использовали в качестве индикаторной бактерии в кроющем слое агара, который содержал Бактопеназу, чтобы было возможно отдифференцировать продукцию пенициллина и цефалоспорина по методам, хорошо известным в этой области науки и описанным, например, у Guttierez et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 56-64.

Споры используют для посева P. chrysogenum в культуральную среду, как описано в разделе d. После 72 часов культивирования (при 25^oC) из мицелия выделяют хромосомную ДНК. ДНК расщепляют рестрикционным ферментом с распознаваемой последовательность в 6 п.о., подобным EcoRI или PstI.

Фрагменты ДНК разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле и переносили на нейлоновые мембраны Gene screen (New England nuclear). Блоттинг по Саузерну проводили гибридизацией с меченным ³²P продуктом ПЦР 2 в качестве пробы для последовательностей гена cefE. Мечение ³²P очищенного продукта ПЦР 2 достигается с помощью мечения случайным примированием в присутствии ³²P ЦТФ при использовании коммерческого набора для мечения (Boeringer Mannheim).

Трансформанты, содержащие кодирующую последовательность cefE, испытаны на экспрессию продукта гена cefE, называемую здесь экспандазной активностью.

Отобранные трансформанты культивируются в среде для продукции пенициллина (смотрите пример 2).

В эксперименте по оценке протекания процесса во времени образцы мицелия отбирали через 48, 72 и 96 часов ферментации. Готовятся экстракты мицелия, и экспандазная активность определяется в неочищенных экстрактах, как описано у Rollins et al. Can. J. Microbiol. 34 (1988), 1196-1202. Трансформанты с экспандазной активностью испытывали на ацилтрансферазную активность также методами, описанными у Alvarez et al., Antimicrob. Agent Chem. 31 (1987), 1675-1682.

По этим анализам отбирали трансформанты с различными уровнями ацилтрансферазной и экспандазной ферментативной активности для ферментативной продукции производных 7-АДЦК.

Пример 2

Ферментативное получение 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК и их выделение

P. chrysogenum штамм Wisconsin 54-1255 (АТСС 28089) трансформируется с помощью одной из конструкций ДНК, как описано в примере 1, и засевается в концентрации 210⁶ конидий/мл в посевную среду, состоящую из г/л:

глюкозы - 30

(NH₄)₂SO₄ - 10

KH₂PO₄ - 10

раствора микроэлементов I

(MgSO₄7H₂O - 25

FeSO₄7H₂O - 10

CuSO₄5H₂O - 0,5

ZnSO₄7H₂O - 2

Na₂SO₄ - 50

MnSO₄H₂O - 2

CaCl₂2H₂O - 5)

10 (мл/л) (pH до стерилизации 6.5).

Посевную культуру инкубируют в течение 48-72 часов при 25- 30^oC и затем используют для засева 10-20 объемов производственной среды, содержащей (г/л):

лактозы - 80

мальтозы - 20

CaSO₄ - 4

мочевины - 3

(MgSO₄7H₂O - 2

KH₂PO₄ - 7

NaCl - 0,5

(NH⁴)₂SO₄ - 6

FeSO₄7H₂O - 0,1

3"-карбоксиметилтиопропионовой кислоты раствора микроэлементов II - 5

(CuSO₄5H₂O - 0,5

ZnSO₄7H₂O - 2

MnSO₄H₂O - 2

Na₂SO₄ - 50),

10 (мл/л) (pH до стерилизации 5.5 - 6.0). Затем инкубация продолжается в течение еще 96 - 120 часов.

В конце производственной ферментации мицелий отделяется центрифугированием или фильтрованием и 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК анализируется с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке с обращенной фазой. Использован аппарат ВЭЖХ Beckman System Gold, состоящий из программируемой системы для растворителей модели 168, автоматического пробоотборника модели 507, диодно-сетчатого детектора модели 168 и системы для данных Gold system (5.10). В качестве стационарной фазы используются две (2) катриджных колонки Chrom-spher С18 (100 х 3 мм, Chrompack) в ряд. Подвижная фаза состоит из линейного градиента от 100% 0.07 М фосфатного буфера pH 4.8 до 25% ацетонитрила и 75% фосфатного буфера pH 4.8 через 15 минут при скорости потока, равной 0.5 мл/мин. Продукция 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК определяется количественно при 260 нм при использовании синтетических 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК в качестве веществ для сравнения.

Идентичность пиков подтверждается путем сравнения кривых ультрафиолетового и ЯМР спектров.

После отфильтровывания жидкой питательной среды к фильтрату добавляется примерно 0.1 объема 1-бутанола. Значение pH доводится до 2 с помощью разбавленной хлористоводородной кислоты и смесь перемешивается в течение 5 минут при комнатной температуре. После разделения органический слой или выпаривается или используется далее для химического деацилирования (пример 3) или обратно экстрагируется объемом воды, равным 0.33, с pH 8 и далее используется для ферментативного деацилирования (примеры 4 и 5).

Пример 3

Деацилирование 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК

К смеси 3 г (8 ммолей) 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК, 3.5 мл (36 ммолей) N,N- диметиланилина 13 мл метиленхлорида и 2.6 мл (21 ммоль) триметилхлорсилана добавляются при комнатной температуре. После перемешивания в течение 30 минут реакционную смесь охлаждают до примерно -50^oC и добавляют 1.8 г (8.5 ммоля) пентахлорида фосфора, все сразу. Температура поддерживается на уровне -40^oC в течение двух часов и затем реакционную смесь охлаждают до -65^oC. Затем ее обрабатывают 12 мл (137 ммолей) изобутанола с такой скоростью, чтобы температура не повышалась свыше -40^oC. После дополнительного перемешивания в течение двух часов раствор выливают в 15 мл воды и потом сразу добавляют 5 мл 4.5 N аммиака. pH доводится до 4 путем медленного добавления твердого бикарбоната аммония. После охлаждения до 5^oC смесь фильтруют и кристаллическую 7-АДЦК промывают 5 мл водного ацетона (1:1) и отделяют.

Пример 4

Ферментативное деацилирование 2-(карбоксиэтилтио)ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК с использованием мутантной ацилазы Pseudomonas SY77

Превращение 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК выполняется в одну энзиматическую стадию с использованием специфической ацилазы, которая производится из ацилазы Pseudomonas SY77 путем направленного на определенную область мутагенеза. Конструирование и идентификация мутантной ацилазы Pseudomonas SY77 с улучшенной активностью в отношении 2- (карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропионильной боковой цепи было описано в ЕР-А-0453048. В мутанте тирозин в положении 178 в - субъединице ацилазы Pseudomonas SY77 был заменен на гистидин. Мутантная ацилаза продуцируется в Е. coli. Клетки собираются путем центрифугирования и снова суспендируются в 10 мМ фосфатном буфере pH 7.4, содержащем 140 мМ NaCl. Затем клетки разрушают ультразвуком. После удаления клеточных остатков собирают супернатанты, обладающие ацилазной активностью. Дальнейшую очистку ацилазы выполняли с помощью ряда этапов хроматографии:

(1) ионообменной хроматографии на О-сефарозе с быстрым потоком при pH 8. 8;

(2) хроматографии гидрофобного взаимодействия на фенилсефарозе;

(3) гельпроникающей хроматографии на колонке сефакрила S200HR.

Очищенную ацилазу иммобилизировали на частицах, состоящих из смеси желатина и хитозана. Частицы обрабатывали глутаральдегидом непосредственно перед добавлением фермента.

Превращение 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК проводится в реакторе с мешалкой. Сначала в реактор добавляют водный раствор цефалоспорина. Затем температуру раствора доводят до 30^oC при постоянном перемешивании и pH фиксируется на 8 с помощью гидроксида калия. Затем добавляется иммобилизированный фермент и превращение начинается. Во время превращения pH в реакторе непрерывно контролируется и поддерживается на 8. 3"-карбоксиметилтиопропионовая кислота, которая выделяется во время реакции, титруется КОН. Количество КОН, которое добавляется, суммируется и регистрируется на записывающем устройстве с плоским стендом. Превращение контролируется путем отбора образцов из реактора, которые анализируются на 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК и 7-АДЦК с помощью ВЭЖХ, как описано в примере 2.

Когда реакция завершена, иммобилизированный фермент удаляется фильтрованием и pH фильтрата доводится до 1, тогда как фильтрат содержит бутилацетат. Слои разделяются, и pH водной фазы, которая содержит 7-АДЦК, доводится до 3. Кристаллическая 7-АДЦК затем отфильтровывается.

Пример 5

Ферментативное деацилирование 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК с использованием ацилазы Pseudomonas SE83

Превращение 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК выполняется, как и в примере 4, однако с использованием ацилазы Pseudomonas SE83 в качестве ацилазы с получением того же самого результата.