штамм бактерий lactobacillus plantarum, обладающий способностью снижать уровень оксалата и используемый для приготовления препаратов и продуктов питания для профилактики и лечения гипероксалурии

Формула изобретения

Штамм бактерий Lactobacillus plantarum, депонируемый в ГКНМ N 151, обладающий способностью снижать уровень оксалата и используемый для приготовления препаратов и продуктов питания для профилактики и лечения гипероксалурии.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологии, и касается штамма лактобацилл, обладающего способностью деградировать оксалат. Штамм может быть использован для приготовления препаратов и продуктов питания, в том числе кисломолочных, предназначенных для профилактики и лечения гипероксалурии.

По имеющимся данным у 52,7% мужчин и 18,8% женщин, проживающих в индустриально развитых странах, наблюдается повышенное содержание щавелевой кислоты в моче, а у 5-15% людей при достижении 70-летнего возраста хотя бы раз отмечается приступ мочекаменной болезни. При этом большая часть камней (70-80%), обнаруживаемых в мочевыводящей системе, представляет собой комплекс щавелевой кислоты и кальция - оксалато-кальциевые камни. Число людей с повышенным содержанием оксалата в их моче постоянно возрастает, что дало основание рассматривать мочекаменную болезнь как одну из наиболее распространенных "болезней цивилизации".

Доказано также, что уровень оксалурии в значительной степени определяется состоянием нормальной микрофлоры толстого кишечника, в частности присутствием в ней в достаточном количестве микроорганизмов, способных разрушать или связывать щавелевую кислоту и кальций, а затем удалять их из организма с фекалиями. В этой связи одним из перспективных направлений профилактики возникновения оксалатовых камней почек и мочеточников и лечения мочекаменной болезни является блокирование абсорбции щавелевой кислоты из кишечника.

Известен штамм бактерий Bacillus sp., способный к полному разрушению оксалата при концентрации его в среде до 40 г/л и росту при температуре до 41^oC (1). В условиях аэрации при температуре 28^oC штамм разлагает 42,6 г/л оксалата за 40-42 часа. Этот штамм выделен из огородной почвы, предназначен для очистки сточных вод от оксалата и абсолютно непригоден для применения людям.

Известен штамм лактобацилл, обладающий способностью снижать уровень оксалата и используемый для получения препаратов и продуктов питания для профилактики и лечения мочекаменной болезни - Lactobacillus plantarum CS (2).

Этот штамм выделен из содержимого кишечника взрослого здорового человека и безопасен для человека. Однако для успешного развития микроэкологического направления профилактики и лечения мочекаменной болезни необходимо расширять, подобно ротации антибиотиков в химиотерапии, арсенал оксалатдеградирующих штаммов, пригодных для приготовления на их основе фармацевтических препаратов продуктов функционального питания.

Цель изобретения - штамм лактобацилл, обладающий способностью активно деградировать оксалат.

Штамм лактобацилл Lactobacillus plantarum 421-2 выделен из содержимого кишечника здорового взрослого человека. Штамм депонирован в Музее микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры человека Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского под N 151.

Культурально-морфологические признаки штамма.

Короткие неподвижные палочки, единичные или расположенные в виде цепочки из 2-5 клеток. Грамположительные, равномерно окрашиваемые. Величина клеток 5-10 мкм. Спор и капсул не образует. Микроаэрофил.

На твердой среде MRS через 48 часов роста образует плоские, сероватые, непрозрачные, выпуклые, округлые, с ровными краями колонии размером 1,5-2 мм, маслянистой консистенции, пигмент отсутствует. В мазке расположены беспорядочными скоплениями и отдельными цепочками. Зернистость и другие включения отсутствуют.

Температурный оптимум роста - 38-40^oC, оптимум pH 6.6-6.9.

Биохимические свойства.

Оксидазная проба отрицательная. Каталаза отрицательная. На мясопептонном агаре, средах Эндо, Плоскирева, Сабуро не растет.

Способен активно развиваться на жидких питательных средах, предназначенных для культивирования лактобацилл, и накапливать к 18-20 часам культивирования производственную биомассу.

Ферментирует амигдалин, D-арабинозу, L-арабинозу, арбитин, галактозу, гентобиозу, глюкозу, глюконат, дульцитол, лактозу, мальтозу, маннит, маннозу, А-метил-D-гликозид, мелецитозу, мелибиозу, рибозу, салицин, сахарозу, сорбит, сорбозу, трегалозу, фруктозу, целобиозу, эскулин. Не ферментирует гликоген, инулин, ксилит, ксилозу, рамнозу, раффинозу, эритритол, D-туранозу. Желатину не разжижает. По результатам развернутого биохимического анализа на системе API-CHL штамм идентифицирован как L.plantarum.

Сравнительная биохимическая характеристика штаммов L. plantarum CS (прототип) и L.plantarum 421-2 приведена в таблице 1.

Из таблицы видно, что сравниваемые штаммы можно различить по биохимическим свойствам.

Штамм L.plantarum 421-2 обладает высокой антагонистической активностью в отношении шигелл, протея, кишечной палочки, золотистого стафилококка.

Отношение штамма L.plantarum 421-2 к антибиотикам.

Чувствителен к амоксициллину, ампицилину, доксициллину, карбенициллину, левомицетину, линкомицину, оксациллину, олеандомицину, пенициллину, рифампицину, эритромицину.

Устойчив к ванкомицину, канамицину, карбенициллину, налидиксовой кислоте, неомицину, полимиксину, ристомицину, стрептомицину и тетрациклину.

В таблице 2 представлены сравнительные данные о чувствительности к антибиотикам штаммов L.plantarum CS и L.plantarum 421-2.

Представленные в табл.2 сведения свидетельствуют об одинаковой чувствительности сравниваемых штаммов лактобацилл к антибиотикам за исключением чувствительности к линкомицину.

Продолжительность свертывания молока штаммом L.plantarum 421-2 при не менее 2% закваски составляет 10-12 часов. Результаты сравнительного изучения времени сквашивания молока штаммами L. plantarum CS и L.plantarum 421-2 представлены в таблице 3.

Таким образом, как следует из таблицы 3, предлагаемый штамм лактобацилл быстрее сквашивает молоко, независимо от вносимой дозы закваски.

Безвредность.

Штамм L.plantarum 421-2 оказался безвредным при проверке на белых мышах путем введения бактерий per os в концентрации 10^10-12КОЕ/мл на протяжении 2 недель, так же как и при глазной аппликации и нанесении на кожу.

Пример 1. Определение способности штамма L.plantarum 421-2 снижать содержание оксалата в среде.

Штамм L.plantarum 421-2 выращивают на жидкой среде MRS-2 при 38^oC в течение 18 часов, затем культуру рассевают петлей на чашки Петри с плотной средой MRS-2 и культивируют в тех же условиях. Затем выросшие бактерии вносят ее в полисинтетическую среду API следующего состава (г/л):

Полипептон - 10

Дрожжевой экстракт - 5

Твин-80 - 1

K₂HPO₄ - 2

Ацетат натри - 5

Цитрат аммония - 2

MnSO₄ 4H₂O - 0,05

MgSO₄ 7H₂O - 0,2

Бромкрезол красный - 0,17

Оксалат натрия - 20

Дистиллированная вода - до 1000

pH - 6,9

Посевной материал вносят в приготовленную среду в количестве 10% от общего объема с конечной концентрацией бактерий в этой среде 10⁷ КОЕ/мл.

В качестве контроля используют ту же питательную среду без внесения посевного материала.

Инкубирование ведут при 38^oC в анаэробных условиях в течение 72 часов.

Затем пробы центрифугируют в течение 15 мин при 12000 об/мин для подготовки к определению содержания оксалата в культуральной среде методом газовой хроматографии. К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 0,4 мл. 50% H₂SO₄, 2 мл CH₃OH и 100 мл 1% раствора фумаровой кислоты. Пробы во флаконе с плотно закрытой пробкой инкубируют при 60^oC в течение 30 минут, затем добавляют 1 мл H₂O и 0,5 мл. хлороформа, тщательно встряхивают и центрифугируют. Для дальнейшего исследования берут слой хлороформа. Количественное определение оксалата в среде проводят методом газожидкостной хроматографии на хроматографе 104: Pye Unicam (Англия) с плазменно-ионизационным детектором Shimadzu Data Processor Chromatopac C-R3A, стеклянной колонке длиной 2 м и внутренним диаметром 2 мм. Колонка заполнена SP 1200/1% H₃PO₄ на Chromosorb-WAW.

Температура детектора 260^oC, температура испарителя 250^oC. Скорость подачи газа-носителя - азота - 30 мл/мин.

Результаты определения способности штаммов L.plantarum 421-2 и L.plantarumCS снижать уровень оксалата представлены в табл. 4.

Инкубацию вели в анаэробных условиях, определение оксалата - методом газовой хроматографии.

Как следует из таблицы 4, штамм L.plantarum 421-2 значительно активнее по сравнению со штаммом-прототипом разрушает оксалат. Так, штамм L.plantarum 421-2 снижает уровень оксалата в среде к 72 часам культивирования на 69% от исходного уровня против 46% для штамма L.plantarum CS. В то же время содержание оксалата натрия в контрольном растворе сохранялось в течение всего периода инкубации без изменений.

Способность снижать уровень оксалата штамм L.plantarum 421-2 стабильно сохраняет при длительном пассировании на питательных средах для культивирования лактобацилл.

Таким образом, штамм Lactobacillus plantarum 421-2 обладает выраженной способностью активно снижать уровень оксалата, хорошо расти на питательных средах разного состава для культивирования лактобацилл и к 18 часам культивирования накапливать производственную биомассу. С учетом этого, а также твердо установленного факта безопасности штамма он может быть использован для приготовления фармакопейных препаратов и продуктов питания лечебно-профилактического назначения, предназначенных для коррекции специфических метаболических нарушений в организме человека.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Авторское свидетельство СССР N 1331889 "Штамм бактерий Bacillus sp., используемый для очистки сточных вод от оксалата". Заявлено 05.11.85 г. МПК С 12 N 1/20.

2. Патент РФ N 2061040 "Штамм бактерий Lactobacillus plantarum, обладающий способностью снижать уровень оксалата и используемый для приготовления препаратов и продуктов питания для профилактики и лечения гипероксалурии. Приоритет 23.05.94г. МПК C 12 N 1/20.