рекомбинантная плазмидная днк pgsdei, кодирующая белок e вируса клещевого энцефалита и штамм escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка e вируса клещевого энцефалита

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pGSDE1, кодирующая белок E вируса клещевого энцефалита с мол. м. 2,4 МД (4067 п.о.), содержащая: HindIII-Scal - фрагмент плазмиды pEZZT318 размером 1165 п.о., содержащий p-независимый терминатор транскрипции триптофанового оперона E.coli(trpT) вместе с N-концевым фрагментом гена устойчивости к ампициллину (BIa); ScaI-SacI - фрагмент плазмиды pGEM1, размером 1640 п.о., включающий T7-промотор, C-концевую часть гена BIa, а также точку начала репликации; Sacl-BglII - синтетический фрагмент длиной 12 п.о., содержащий сайт связывания с рибосомами; BglII-HindIII - фрагмент, полученный методом ПЦР, размером 1250 п.о., содержащий стартующий ATG-кодон, кодирующую часть гена E ВКЭ без гидрофобного якоря,

а также терминирующий кодон ТАА; один участок расщепления рестриктазы BglII; один участок расщепления рестриктазы HindIII, расположенный на расстоянии 1250 п.о. от сайта BglII по часовой стрелке; один участок расщепления рестриктазы ScaI, расположенный на расстоянии 2897 п.о. от сайта BglII по часовой стрелке; генетический маркер - Bla-ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, расположенный в участке от 1027 до 1887 п.о. вправо от BglII сайта; промотор Т7 РНК-полимеразы, расположенный на 16 п.о. левее BglII сайта (позиции 4055 - 4039 п.о.); ген E ВКЭ, расположенный на участке от 9 до 1259 п.о. по часовой стрелке от BglII сайта и имеющий собственный бактериальный участок связывания с рибосомами и инициирующий ATG-кодон, а также стоп-кодон ТАА.

2 Штамм бактерий Escherichia coli GSDE1 - продуцент рекомбинантного белка E вируса клещевого энцефалита, предназначенного для определения антител к ВКЭ.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и может найти применение в микробиологической промышленности и медицине для разработки высокоэффективных профилактических и диагностических средств борьбы против вируса клещевого энцефалита (ВКЭ).

По данным российских и зарубежных эпидемиологов клещевой энцефалит (КЗ) - наиболее распространенная в северном полушарии природно-очаговая инфекция. С начала 90-х годов наблюдается беспрецендентное повышение уровня заболеваемости населения этой инфекцией, отмечаемое как на территории России, так и в большинстве европейских и североамериканских стран.

В связи с этим очевидна актуальность разработки совершенных тест-систем к вирусу клещевого энцефалита.

Патентный поиск и анализ литературных данных выявил, что в известных в настоящее время технических решениях, относящихся к тест-системам на вирус КЭ, в качестве антигена используются вирусные лизаты. Используемые антигены отличаются способами очистки вируса, способами культивирования либо применением различных штаммов ВКЭ (А.С. СССР NN 646992, 691135, 1378112, 1562857, 1597726).

Использование вирусных лизатов в качестве антигенов в тест-системах к ВКЭ имеет ряд крупных недостатков:

- высокая патогенность вируса;

- проблема инактивации вируса. При инактивации вируса активность антигена падает на несколько порядков, кроме того, процесс инактивации плохо контролируется, что приводит к невоспроизводимости результатов, резко ухудшает качество препарата антигена, и, как следствие, снижается чувствительность тест-системы;

- очистка природного антигена крайне трудоемкий и неэффективный процесс. Основной антиген ВКЭ-белок E не выдерживает нейтральных значений pH, сильно денатурируется, что приводит к усложнению схемы анализа проб.

Одним из наиболее перспективных путей совершенствования диагностических тест-систем является использование в качестве антигена рекомбинантных белков ВКЭ, синтезированных в различных экспрессирующих системах. Использование рекомбинантных белков в качестве антигенов обеспечивает следующие преимущества в отличие от использования вирусных лизатов:

- обеспечивается возможность получения недорогого, безопасного в работе и стабильного антигена;

- при клиническом использовании диагностикумов исключается работа с вирусными препаратами.

Для вируса клещевого энцефалита известно два основных антигена - белок оболочки E и высокоиммуногенный неструктурный гликопротеин NS1 (Int. 3. Med Microbiol. 1990, 272(4), p. 277 - 284; Cesk. Epidem. Microbiol.Immun.,1991, 40 (4 - 5), 209 - 220; Вопросы вирусол. 1990, 35 (6) 471 - 474). Экспрессия белка NS1 была осуществлена в E.coli и показано, что продукт экспрессии реагирует с положительными сыворотками к ВКЭ (А.С. СССР 1822202, С 12 N 15/33 1996; патент РФ 1679798, С 12 N 15/33, 15/52, 1/21, 1995).

На наш взгляд, наиболее перспективно в качестве антигена использовать белок оболочки E, так как именно этот белок определяет основные биологические функции вируса: тропизм, вирулентность, иммуногенность и несет вируснейтрализующие и протективные эпитопы (Pathobiology of the flaviviruses-Plenum Press. New-York-London, 1986,p. 375 - 440; Клещевой энцефалит и его вакцинопрофилактика. -Л.Медицина, 1986 ). В то же время к настоящему времени из литературных данных неизвестны подходы к получению рекомбинантного белка E ВКЭ. Скорее всего, это объясняется проблемами эффективной экспрессии столь сложно устроенного белка.

Таким образом, экспрессия белка E в полноразмерном виде и его использование для создания современных эффективных тест-систем для диагностики клещевого энцефалита до сих пор является нерешенной задачей.

Технической задачей изобретения является создание рекомбинантной плазмиды pGSDEl, кодирующей белок E ВКЭ и штамма E. coli GSDE1-продуцента белка E ВКЭ.

Техническая задача решается тем, что получена плазмидная ДНК-pGSDEl, кодирующая ген белка E ВКЭ, которая имеет размер 4067 п.о. и состоит из следующих элементов:

HindIII-ScaI - фрагмента плазмиды pEZZT318 (Biochemistry, 1987, 26, 5239 - 5244 ), размером 1165 п.о., содержащий -независимый терминатор транскрипции триптофанового оперона E.coli(trpT) вместе с N-концевым фрагментом гена устойчивости к ампициллину(bla);

Scal-SacI - фрагмента плазмиды pGEM1 /Promega, USA/, размером 1640 п.о., включающим Т7-промотор, C-концевую часть гена bla, а также точку начала репликации;

SacI-BglII - синтетический фрагмент длиной 12 п.о., содержащий сайт связывания с рибосомами;

BglII-HindIII - фрагмент, полученный методом ПЦР, размером 1250 п.о., содержащий стартующий ATG-кодон, кодирующую часть гена E ВКЭ без гидрофобного якоря, а также терминирующий кодон TAA;

один участок расщепления рестриктазы BglII; один участок расщепления рестриктазы HindIII, расположенный на расстоянии 1250 п.о. от сайта BglII по часовой стрелке;

один участок расщепления рестриктазы SeaI, расположенный на расстоянии 2897 п.о. от сайта BglII по часовой стрелке.

Фрагменты содержат следующие гены и регуляторные участки:

bla-ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, расположенный в участке от 1027 до 1887 п.о. вправо от BglII сайта;

промотор Т7 РНК-полимеразы, расположенный на 16 п.о. левее BglII-сайта (позиции 4055 - 4039 п.о.);

ген E ВКЭ, расположенный на участке от 9 до 1259 п.о. по часовой стрелке от BglII сайта и имеющий собственный бактериальный участок связывания с рибосомами, инициирующий ATG-кодон, и стоп кодон TAA.

Молекулярная масса рекомбинантной плазмидной ДНК равна 2,4МД.

Задача также решается созданием штамма-продуцента E.coli, который характеризуется следующими признаками: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные, грамотрицательные, неспороносные. Клетки растут на среде LB и других питательных средах, содержащих 50 мкг/мл ампициллина. При выращивании на питательных агаризованных средах при 37^oC колонии клеток гладкие, круглые, блестящие, бледно-желтые, прозрачные, края ровные. При росте на жидких средах клетки образуют ровную интенсивную муть. Клетки хорошо растут при температуре от 10 до 37^oC при оптимуме pH от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота клетки используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и органические формы в виде пептона и аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Мальтозу не сбраживают. Уреазная активность не образуется. Трансформацию клеток плазмидами с промоторами бактериофага Т7 проводят по стандартным методикам. Полученные клоны клеток с плазмидами выращивают на среде LB при температуре 30 - 37^oC. Препаративную ферментацию для наработки рекомбинантного белка проводят при добавлении ИПТГ до концентрации 0,6 мМ при температуре 30 - 37^oC. Продуктивность штамма составляет около 120 мг рекомбинантного белка на 1 литр клеточной суспензии. Белок стабилен при температуре 4^oC в течение 5 - 6 месяцев. Препарат рекомбинантного белка взаимодействует в ИФА и иммуноблотинге с антисыворотками к ВКЭ.

Полученный штамм депонирован в НИИ Коллекция культур микроорганизмов ГНЦ ВБ "Вектор" под номером В 699.

Предложенные рекомбинантная плазмидная ДНК pGSD1 и штамм-продуцент рекомбинантного белка E вируса клещевого энцефалита впервые получены авторами, неизвестны из литературных источников, что позволяет говорить о их соответствии критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pGSDEl.

20 мкг плазмидной ДНК pEZZT318 расщепляют последовательно сначала рестриктазой SeaI в реакционной смеси, содержащей 33 мМ Трис- Ac,pH 7,9, 10 мМ MgAc, 66 мМ KAc, 1 мМ ДТТ, 40 ед.рестриктазы SeaI, а затем рестриктазой HindIII в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCI, pH 8,5, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCI, 1 мМ ДТТ, 40 ед.рестриктазы HindIII в объеме 200 мкл при 37^oC в течение 1 час. Фрагмент ДНК размером 1165 п.о., включающий -независимый терминатор транскрипции триптофанового оперона E.coli(trpT) вместе с N-концевым фрагментом гена устойчивости к ампициллину (bla), выделяют после электрофореза в ПААГ методом электроэлюции из геля.

20 мкг плазмидной ДНК pGEM1 расщепляют последовательно рестриктазами SeaI и HindIII в условиях, описанных выше. Фрагмент ДНК размером 1640 п.о. выделяют после электрофореза в ПААГ методом электроэлюции.

1 мкг суммарной ДНК, состоящей из эквимолярного количества фрагментов HindIII - SeaI (1165 п.о.) и SeaI - HindIII (1640 п.н) обрабатывали ДНК-лигазой фага Т4 в реакционной смеси, содержащей 20 мМ Трис-HCI, pH 8,0, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ ДТТ, 0,5 мМ АТР, 10 ед. активности ДНК-лигазы фага Т4 в объеме 20 мкл при 4^oC в течение 12 час. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli XL-1 blue, приготовленные методом обработки CaCl₂, по стандартной методике/Молекулярное клонирование: методы генетической инженерии. М. Мир, 1984 /.

Трансформанты выращивают на чашках Петри, содержащих 50 мг/л ампициллина, в течение ночи при 37^oC. Клоны, содержащие целевую плазмиду pGT, отбирают при помощи рестрикционного анализа.

10 мкг плазмидной ДНК pGT расщепляют последовательно рестриктазами SacI и XbaI в реакционной смеси, содержащей 10 мМ Трис-HCI, pH 7,5, 10 мМ MgCl₂, 50 мМ NaCI, 1 мМ ДТТ, 20 ед.активности рестриктазы SacI, а затем рестриктазой XbaI в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCI, pH 7,6, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCI, 1 мМ ДТТ, 20 ед. активности рестриктазы XbaI в объеме 100 мкл при 37^oC в течение 1 час. Обработанную таким образом ДНК очищают в ПААГ.

Для введения сайта связывания с рибосомами (последовательность Щайн-Дальгарно) используют синтетический фрагмент ДНК, имеющий следующую структуру:

5" CAGGAGGAGAT

3" TGGAGTCCTCCTCTAGCAC

1 мкг суммарной ДНК, состоящей из эквимолярного количества плазмидной ДНК pGT, гидролизованной рестриктазами SacI и XbaI и синтетического фрагмента ДНК, содержащий сайт связывания с рибосомами, обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в условиях, описанных выше, лигазной смесью трансформируют клетки E. coli XL-1 blue

Трансформанты выращивают на чашках Петри, содержащих 50 мг/л ампициллина в течение ночи при 37^oC. Клоны анализируют при помощи рестрикционного анализа и отбирают плазмиду pGSDI.

10 мкг плазмидной ДНК pGSDI расщепляют последовательно сначала рестриктазой BglII в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCI, pH 7,6, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCI, 1 мМ ДТТ, 20 ед.активности рестриктазы BglII, в объеме 100 мкл при 37^oC в течение 1 час., а затем рестриктазой HindIII, в условиях, описанных выше. Обработанную таким образом ДНК очищают в ПААГ.

Фрагмент ДНК размером 1250 п.о., кодирующий ген E ВКЭ без гидрофобного C-конца получают методом полимеразной цепной реакции. Для этого составляют реакционную смесь, содержащую 60 мМ Трис-HCl, pH 8,3, 50 мМ KCl, 2 мМ MgCl₂, 1 мM ДТТ, смесь dNTP в концентрации 0,2 мМ,праймер N1 5" CTGAGATCTATGTATGCCTCACGATGCAC и праймер N2 5" CCCAAGCTTATATGCCTTCCTGGTTT (в конечной концентрации 40 рМ) ДНК-матрицу, представляющую плазмидную ДНК pBR327, со встроенным геном E ВКЭ штамма 205 /Мол. Генетика, микробиол. и вирус., 1991, N 3, 23 - 29 / (конечная концентрация 0,001 рМ) 5 ед.активности Tte-полимеразы.

Реакционную смесь инкубируют при 94^oC 5 мин., а затем проводят цикл амплификации со следующими параметрами: 1 мин при 55^oC (гибридизация праймеров), 2 мин при 72^oC (элонгация праймеров), 1 мин при 94^oC (денатурация ДНК). Цикл амплификации повторяют 25 раз. После последнего цикла амплификации реакционную смесь инкубируют при 72^oC 10 мин.

5 мкг фрагмента ДНК размером 1250 п. о., полученного методом ПЦР обрабатывают последовательно рестриктазами BglII, а затем HindIII в условиях, описанных выше. Обработанную таким образом ДНК очищают в ПААГ.

1 мкг суммарной ДНК, состоящей из эквимолярного количества фрагмента BglII - HindIII размером 1250 п.о., содержащего ген E ВКЭ и векторной плазмиды pGSDI, обработанной рестриктазами BglII и HindIII, обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в условиях, описанных выше. Лигазной смесью трансформируют клетки E.coli BL-21(DE3).

Трансформанты выращивают на чашках Петри, содержащих 50 мг/л ампициллина, в течение ночи при 37^oC. Клоны, содержащие плазмиду pGSDEl отбирают при помощи рестрикционного анализа.

Пример 2. Экспрессия белка E ВКЭ в клетках E.coli

Штамм E. coli, содержащий плазмиду pGSDEl, выращивают в 100 мл LB-среды при 37^oC в присутствии ампициллина( 50 мг/л) до оптической плотности 0,6 о. е. при 650 нм, а затем индуцируют Т7 промотор добавлением в среду изопропил--тиогалактопиранозида(ИПТГ) до 0,6 мМ, продолжают инкубацию еще 4 часа. Клетки собирают центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 мин. Клетки лизируют ультразвуком и выделяют белки по описанному методу (ЕМВО Д., 1984,3,1429).

Выделенные белки анализируют в 10%-ном ПААГ по стандартному методу Лэммли (Nature, 227, 680 - 685,1970). В качестве контроля используют полученный аналогичным образом лизат клеток штамма E.coli, содержащий векторную плазмиду pGSD1. Сравнительный анализ белкового состава показывает, что штамм E. coli, содержащий плазмиду pGSDEl, экспрессирует полипептид с молекулярной массой 45 кДа. Продуктивность штамма составляет около 120 мг рекомбинантного белка на 1 литр клеточной суспензии.

Пример 3. Использование рекомбинантного белка E ВКЭ в качестве антигена в тест-системе.

Рекомбинантный белок сорбируют на полистирольные планшеты в карбонатном буфере (0,2М,pH 9,6) при температуре 4 - 2^oC в течение 16 час. в количестве 100 мкл (при концентрации 4 мкгмл). После удаления содержимого из лунок добавляют по 200 мкл буфера, содержащего 0,4% БSA, 0,05% Tween 20, 0,16M NaCI, 0,02 M фосфат натрия при pH 7,4. После инкубации в течение 1 часа при температуре 20^oC, троекратно промывают планшет буфером ФСБТ (0,15М NaCL, 0,02М Na-фосфат pH 7,4, Tween 20 - 0,05%) Далее в лунки наносят панели положительных антисывороток (24 сыворотки с титром в РТПГА не менее 120) и отрицательных антисывороток (24 сыворотки по РТПГА), предварительно разведенных в 100 раз буфером ФСБТ с 2% КБР.

Для проверки чувствительности титруют противоклещевой иммуноглобулин (титр 1:640). В качестве отрицательного контроля используют сыворотку человека, не содержащую антител к ВКЭ. После инкубации в течение 1 часа при 37^oC и троекратной отмывки планшеты ФСБТ в лунки добавляют по 100 мкл раствора коньюгата моноклональных антител к иммуноглобулинам человека с пероксидазой хрена в буфере ФСБТ. После инкубации в течение 1 часа при 37^oC и пятикратной отмывки ФСБТ, в лунки добавляют по 100 мкл раствора ОФД в ЦФРБ. Через 30 мин при комнатной температуре останавливают реакцию добавлением 50 мкл 2N H₂SO₄ и учитывают результаты на спектрофотометре при длине волны 492 нм.

Для оценки результатов анализа вычисляют критический уровень оптической плотности

ОП_крит = ОП_к-2

Результаты анализа считают положительными, если ОП исследуемого образца превышает или равна ОП крит.

Получают следующие результаты.

Титр иммуноглобулинов - 1/12800 (титр в реакции РТПГА - 1/640).

В панели положительных сывороток из 24 сработало 23 как положительные (чувствительность - 95,8% относительно РТПГА).

В панели отрицательных сывороток из 24 сработали как отрицательные все 24 сыворотки ( специфичность 100: относительно РТПГА).

Таким образом, получена плазмидная ДНК pGSDEl, кодирующая белок E ВКЭ и штамм Escherichia coli, продуцирующий белок E вируса клещевого энцефалита. Рекомбинантный белок может быть использован в качестве антигена в тест-системах к вирусу клещевого энцефалита.