способ получения материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы, для трансплантации больным сахарным диабетом с использованием феномена миграции клеток, материал, содержащий бета-клетки поджелудочной железы, для трансплантации больным сахарным диабетом и способ лечения сахарного диабета методом его трансплантации

Формула изобретения

1. Способ получения материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы, для трансплантации больным сахарным диабетом, заключающийся в использовании в качестве исходного материала поджелудочной железы млекопитающего, при этом извлеченную поджелудочную железу промывают, разрезают на микрофрагменты и засевают полученным материалом культуральные матрасы, добавляя культуральную (ростовую) среду и сыворотку млекопитающих, после чего осуществляют инкубацию в термостате при постоянной температуре с последующей выдержкой при более низкой температуре, отличающийся тем, что для извлечения бета-клеток из фрагментов поджелудочной железы обеспечивают режим, при котором бета-клетки свободно мигрируют из культивируемых фрагментов на дно культурального матраса, для чего осуществляют инкубацию при постоянной температуре 35-40^oС в течение от двух суток до шести недель с однократным или многократным снижением температуры до 4-25^oC и выдержкой при этой температуре, а также с однократным или периодическим снижением концентрации сыворотки млекопитающих, затем собирают бета-клетки со дна культурального матраса и получают материал для трансплантации.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для промывания поджелудочной железы используют холодный раствор Хенкса с добавлением антибиотиков.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед измельчением поджелудочной железы удаляют капсулу железы и прослойки соединительной ткани с крупными разветвлениями выводных протоков и кровеносными сосудами.

4. Материал, содержащий бета-клетки поджелудочной железы, для трансплантации больным сахарным диабетом, полученный из поджелудочной железы млекопитающего, отличающийся тем, что он получен способом по п.1.

5. Способ лечения сахарного диабета путем трансплантации бета-клеток поджелудочной железы млекопитающих, отличающийся тем, что проводят трансплантацию материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом по п.4, полученного с использованием феномена их миграции.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что материал, содержащий бета-клетки поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом, трансплантируют внутримышечно.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, что материал, содержащий бета-клетки поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом, трансплантируют в прямую мышцу живота.

8. Способ по п.5, отличающийся тем, что материал, содержащий бета-клетки поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диaбeтoм, трансплантируют в паренхиму печени.

9. Способ по п.5, отличающийся тем, что материал, содержащий бета-клетки поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом, трансплантируют через воротную вену или ее ветви.

10. Способ по п. 5, отличающийся тем, что материал, содержащий бета-клетки поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом, трансплантируют в пульпу селезенки.

11. Способ по п. 5, отличающийся тем, что материал, содержащий бета-клетки поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом, трансплантируют в полость брюшины.

12. Способ по п. 5, отличающийся тем, что материал, содержащий бета-клетки поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом, трансплантируют в большой сальник.

13. Способ по п. 5, отличающийся тем, что материал, содержащий бета-клетки поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом, трансплантируют в селезеночную артерию.

14. Способ по п. 5, отличающийся тем, что материал, содержащий бета-клетки поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом, трансплантируют в специально созданный мышечный карман.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу получения материала, содержащего бета-клетки (-клетки) поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом из поджелудочной железы новорожденных кроликов, материалу, содержащему бета-клетки поджелудочной железы, полученному новым способом, и к трансплантологическим методам лечения сахарного диабета, преимущественно инсулинозависимого, путем трансплантации -клеток, полученных с использованием феномена их миграции.

Известен способ получения материала, содержащего островковые клетки (-клетки) поджелудочной железы внутриутробных плодов человека и животных (плодов свиньи, плодов крупного рогатого скота). Способ заключается в том, что поджелудочную железу внутриутробных плодов человека, крупного рогатого скота или свиньи извлекают в стерильных условиях, промывают в растворе Хенкса с антибиотиками, разрезают на фрагменты размером 2 - 3 мм, которые вновь промывают раствором Хенкса с антибиотиками. Затем ткань погружают в 0,1 - 0,3% раствор коллалитина (препарат, содержащий коллагеназу) или смесь равных частей 0,1% раствора коллалитина и 0,1% раствора трипсина на 20 - 30 минут при температуре 20 - 22. Далее удаляют раствор ферментов, переносят материал в 0,3% раствор трипсина, помещают на магнитный размешиватель и подвергают обработке в течение 15 - 20 минут. Делают два - три слива раствора трипсина со взвешенными в нем одиночными клетками и небольшими клеточными комплексами в центрифужные флаконы, а затем центрифугируют и осадок ресуспендируют. Полученные не осевшие клетки и клеточные комплексы пофракционно отделяют и засевают ими культуральные матрасы. Инкубацию проводят при температуре 36 - 37^oC в течение 8 - 10 дней с заменой ростовой среды каждые 3 - 4 дня. При этом был получен материал, подавляющую часть которого составляют -клетки (см. Экспериментальные основы клинической трансплантации островковых клеток /Шумаков В. И. , Блюмкин В. Н. , Скалецкий Н.Н., Шальнев Б.И. в сборнике Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы (очерки). М. , "Канон", 1995, с. 38 - 42).

К недостаткам известного способа относится значительная потеря островковых клеток в процессе многоэтапной обработки материала, в частности, при нахождении на магнитном размешивателе и при центрифугировании, а также при фракционном осаждении клеточных комплексов и одиночных клеток.

Известен материал островковых клеток поджелудочной железы, полученный указанным выше способом (см. там же).

К недостаткам известного материала островковых клеток поджелудочной железы относится ее сниженная биологическая активность из-за недостатков способа ее получения, в процессе которого часть клеток уничтожается, а часть травмируется при нахождении на магнитном размешивателе и при центрифугировании.

Известны различные способы лечения сахарного диабета путем свободной трансплантации островковых клеток поджелудочной железы, в частности, путем введения в печень, через воротную вену или ее ветви, в пульпу селезенки, в полость брюшины, в специально создаваемый мышечный карман или внутримышечно (см. Клиническая свободная трансплантация островковых клеток поджелудочной железы больным сахарным диабетом / Шумаков В.И., Блюмкин В.Н., Скалецкий Н. Н. , Игнатенко С. Н. , Галибин О.В. - в указанном выше сборнике - с. 122 - 311).

Достоинством перечисленных методов введения материала, содержащего островковые клетки поджелудочной железы, является длительная стабилизация течения исходно лабильного заболевания в сочетании со снижением потребности в экзогенном инсулине. К недостаткам можно отнести их сложность и возможность возникновения осложнений. Наиболее простым является последний из упомянутых выше способов. Кроме того, для достижения положительного результата важное значение имеет качественная характеристика трансплантируемого материала, определяемая, в основном тем, каким способом получен вводимый материал, содержащий островковые клетки.

Ближайшим аналогом способа получения материала, содержащего островковые клетки поджелудочной железы, является способ, описанный в патенте Российской Федерации N 2069563, A 61 К 35/39, опубл. в 1996 г. Согласно этому способу предварительно извлекают поджелудочную железу новорожденного кролика и погружают ее в холодный раствор Хенкса с добавлением антибиотиков. Удаляют капсулу поджелудочной железы и прослойки соединительной ткани с крупными разветвлениями выводных протоков и кровеносными сосудами. Затем поджелудочную железу разрезают сосудистыми ножницами на фрагменты размером 2 - 3 мм и многократно промывают раствором Хенкса с антибиотиками, после чего заливают 0,25% раствором коллалитина, выдерживают 10 минут при температуре 20 - 22^oC. Следующей операцией является освобождение обрабатываемой ткани от действия ферментативного препарата путем многократного отмывания ее раствором Хенкса и средой 199. Подготовленный материал измельчают до получения микрофрагментов размером 0,1 - 0,5 мм. Полученная взвесь микрофрагментов с добавлением в нее культуральной (ростовой) среды и сыворотки крупного рогатого скота засевается в культуральные матрасы. Инкубацию культур проводят в термостате при 37^oC в течение двух суток и при 24^oC в течение семи - восьми суток. Замена закисленной и содержащей балластные вещества ростовой среды на свежую производится каждые двое-трое суток.

К недостаткам ближайшего аналога относится необходимость использования фермента - коллалитина для разрыхления исходного материала путем лизиса коллагеновых волокон. Коллалитин повреждает -клетки и снижает выход продуцируемой культуры клеток. Кроме того, несмотря на достаточно высокое содержание -клеток в полученной культуре, недостатком данного способа является низкий их выход из исходного материала, из которого удается извлечь не более 40% от общего числа содержащихся в нем -клеток.

Ближайшим аналогом изобретения - материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом, является материал, полученный указанным выше способом - ближайшим аналогом (см. там же).

К недостаткам известного материала островковых клеток поджелудочной железы можно отнести недостатки, обусловленные способом его получения, что приводит к сниженной биологической активности при относительно сложном и дорогом получении с использованием фермента - коллалитина.

Ближайшим аналогом изобретения - способа лечения сахарного диабета является способ по патенту Российской Федерации N 2004247, МПК A 61 К 35/39, опубл. в 1995 г. Согласно этому способу производят имплантацию клеток доброкачественной инсулиномы человека, при этом материал, содержащий бета-клетки поджелудочной железы, имплантируют в прямую мышцу живота в виде взвеси на физрастворе.

К недостаткам известного способа можно отнести некоторую сложность получения исходного материала - клеток доброкачественной инсулиномы, а также проблемы, возникающие в связи с борьбой с преобладанием роста фибробластов при использовании перевиваемой культуры -клеток, и необходимость точного контроля производительности инсулина конкретной фракцией культуры клеток инсулиномы, что связано с тем, что в качестве имплантата используются опухолевые клетки, функциональная активность которых может существенно варьироваться.

Задачей изобретения, относящегося к способу получения материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом, является упрощение способа, увеличение гарантированно высокого процента (до 90%) извлечения неповрежденных, -клеток из исходного материала и удешевление за счет отказа от применения фермента, содержащего коллагеназу.

Задачей изобретения, относящегося к материалу, содержащему бета-клетки поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом, является получение материала с высокой биологической активностью.

Задачей изобретения, относящегося к способу лечения сахарного диабета, является повышение эффективности лечения, в частности, снижение потребности в инсулине на длительный период и торможение прогрессирования вторичных осложнений.

Поставленная задача решается тем, что при получении материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом, используют поджелудочную железу новорожденного кролика, плода человека или другого млекопитающего, при этом извлеченную поджелудочную железу промывают в растворе Хенкса с добавлением антибиотиков, разрезают ее на фрагменты и засевают полученным материалом культуральные матрасы, добавляя культуральную (ростовую) среду и сыворотку млекопитающих, затем обеспечивают режим, при котором -клетки свободно мигрируют из культивируемых микрофрагментов поджелудочной железы на дно культурального матраса, для чего осуществляют инкубацию при температуре 35 - 40^oC в продолжение от двух суток до шести недель с однократным или многократным снижением температуры до 4 - 25^oC и выдержкой при пониженной температуре, а также с временным однократным или периодическим снижением концентрации сыворотки, затем собирают бета-клетки со дна культурального матраса и получают материал для трансплантации.

Поставленная задача для материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом, решается за счет использования указанного выше способа ее получения.

Поставленная задача для способа лечения сахарного диабета решается при осуществлении, в процессе которого производят трансплантацию материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы, полученный с использованием феномена миграции -клеток, при этом материал может быть трансплантирован в различные органы и ткани: внутримышечно, в частности, в прямую мышцу живота, в печень (непосредственно в паренхиму или через воротную вену или ее ветви), в пульпу селезенки, в селезеночную вену, в полость брюшины, в специально создаваемый мышечный карман, в паренхиму печени или в большой сальник.

Принципиальным отличием способа получения материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы, в соответствии с данным изобретением является использование феномена миграции, -клеток из фрагментов поджелудочной железы (см. Абламуниц В. Г., Кирсанова Л.А. Феномен миграции -клеток in vitro из псевдоостровков крупного рогатого скота. "Бюлл. эксперим. биол. мед.", 1992, N 6, с. 658 - 660).

Описанная в указанной работе методика получения -клеток предназначена для лабораторных целей и не пригодна для получения материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы, удовлетворяющих требованиям, предъявляемым для материалов, используемых в лечебной практике.

В отличие от известных ранее способов получения материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы, способ в соответствии с настоящим изобретением позволяет реализовать феномен миграции -клеток посредством создания необходимых условий для протекания этого процесса, причем полученный материал отвечает требованиям, предъявляемым к материалам, предназначенным для трансплантации. При осуществлении способа в соответствии с настоящим изобретением исключаются операции, травмирующие -клетки, а именно центрифугирование, обработка на магнитном размешивателе, и операция, присущая ближайшему аналогу, - обработка ферментом для растворения коллагеновых волокон. В соответствии с настоящим изобретением удается обеспечить высвобождение более 90% -клеток, содержащихся в исходной поджелудочной железе, что было невозможно ни по одному известному ранее способу.

Пример реализации способа получения материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом, и собственно материал, содержащий бета- клетки поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом, полученный этим способом.

Для получения материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы, может быть использована поджелудочная железа млекопитающих, новорожденных млекопитающих или их плодов. Имеющийся опыт показывает, что возможно использование поджелудочной железы крупного рогатого скота и их плодов, а также лошадей и свиней, плода человека, но наиболее доступным и дешевым материалом является поджелудочная железа новорожденных кроликов.

Для получения материала, содержащего бета- клетки поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом, извлекают поджелудочную железу, например, новорожденного кролика, и помещают ее в холодный раствор Хенкса с добавлением антибиотиков. Вынув железу из раствора, удаляют ее капсулу и прослойки соединительной ткани с крупными разветвлениями выводных протоков и кровеносными сосудами. Декапсулированную железу измельчают до микрофрагментов размером до 1 мм и вновь промывают раствором Хенкса с добавлением антибиотиков. Полученным материалом засевают культуральные матрасы, куда добавляется культуральная (ростовая) среда и сыворотка млекопитающих. В качестве сыворотки может быть использована сыворотка крупного рогатого скота. Затем засеянные культуральные матрасы помещают в термостат, где обеспечивают режим, при котором -клетки свободно мигрируют из культивируемых фрагментов поджелудочной железы на дно культурального матраса, для чего осуществляют инкубацию при постоянной температуре, находящейся в диапазоне 35 - 40^oC, в течение от двух суток до шести недель, при этом однократно или несколько раз снижают температуру в зависимости от необходимости (за культурой ведется микроскопический контроль) до 4 - 25^oC, и выдерживают определенное время при пониженной температуре. Длительность выдержки определяется экспериментально для конкретного вида культуры -клеток. Для получения высококачественного материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы, производят временное однократное или периодически повторяющееся снижение концентрации сыворотки. Время выдержки при пониженной концентрации сыворотки также определяется экспериментально для конкретного вида культуры -клеток. Сбор -клеток производится посредством клеточного скребка, которым -клетки удаляются со дна культурального матраса. Полученный материал может быть использован для трансплантации непосредственно после сбора или сохранен достаточно длительное время до операции при пониженной температуре или с помощью замораживания.

Способ лечения сахарного диабета, преимущественно, инсулинозависимого, осуществляют с использованием материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы, полученного с использованием феномена миграции -клеток. Как указывалось выше, выбор способа введения -клеток может быть различным, то есть материал, содержащий бета-клетки поджелудочной железы, может быть трансплантирован в различные органы и ткани: внутримышечно, в частности, в прямую мышцу живота, в печень (в паренхиму или через воротную вену или ее ветви), в пульпу селезенки, в селезеночную артерию, в полость брюшины, в специально создаваемый мышечный карман, в большой сальник.

Самым простым по технике исполнения и наименее травматическим для больного является введение материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы, полученного с использованием феномена миграции, посредством шприца в прямую мышцу живота.

Пример 1. Больной А. , 34 лет, поступил в клинику с жалобами на общую слабость, боли и чувство онемения в ногах, частые (до 3 - 4 раз в неделю) гипогликемические состояния, нередко сменяющиеся появлением сильной жажды, сухости во рту, а также снижением аппетита, тошнотой. Инсулинозависимый сахарный диабет выявлен 8 лет назад (в 26-летнем возрасте), в последнее время течение диабета приобрело весьма лабильный характер, что сделало практически невозможным проведение адекватной инсулинотерапии и резко снизило работоспособность больного. При настоящем стационарном обследовании выявлены резкие колебания концентрации глюкозы в крови (от 5,6 до 17,1 ммоль/л). За время 2-недельного наблюдения трижды регистрировались выраженные гипогликемические состояния, одно из них быстро перешедшее в кому, из которой больного с большим трудом удалось вывести. Отмечалась склонность к развитию кетоацидоза (возникали характерные жалобы, появлялись запах ацетона в выдыхаемом воздухе, кетонурия). После проведения необходимой коррекции доза вводимого инсулина составила 52 ед./сут. Через 2 недели после госпитализации больному была выполнена внутримышечная (в прямую мышцу живота) трансплантация материала, содержащего бета-клетки, полученного описанным выше способом из поджелудочной железы новорожденных кроликов. Уже через 2 - 3 недели после пересадки у больного стабилизировался уровень гликемии - в пределах 7,7 - 11,2 ммоль/л в течение суток. В дальнейшем (на протяжении 14-месячного наблюдения) гипогликемические явления не беспокоили больного, не было ни одного эпизода кетоацидоза. Потребность во вводимом инсулине снизилась через 1 мес. после трансплантации - до 32 ед./сут. (на 38%), через 3 мес. - до 24 ед. /сут. (соответственно на 38% и 54% по сравнению с дотрансплантационной дозой). К окончанию 14-месячного наблюдения потребность в экзогенном инсулине составляла 36 ед., т. е. оставалась сниженной по сравнению с дотрансплантационной на 35%. При этом состояние ранее нарушенного углеводного обмена практически нормализовалось, о чем свидетельствовало снижение содержания гликозилированного гемоглобина с 14,1% перед трансплантацией до 10,0% - через 3 мес., 8,4% - через 6 мес. и 8,8% - через 12 мес. после нее. Помимо стабилизации течения диабета было отмечено лечебное воздействие ксенотрансплантации материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы, на прогрессировавшее у больного позднее осложнение - диабетическую полинейропатию. Характерные для этого осложнения боли в ногах и парестезии стали ослабевать уже через 2 - 3 недели после пересадки и полностью перестали беспокоить спустя 2 месяца. При этом нормализовалась ранее сниженная скорость проведения импульса по двигательным нервам. Стойкое исчезновение признаков диабетической полинейропатии отмечалось, по меньшей мере, в течение 1,5 лет после трансплантации материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы.

Следующий клинический пример иллюстрирует влияние трансплантации материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы, полученного из поджелудочной железы новорожденных кроликов описанным выше способом, на течение других часто встречающихся поздних осложнений сахарного диабета - ретинопатии и нефропатии.

Пример 2. Больная Б.Ж, 26 лет. Сахарный диабет (инсулинозависимый) выявлен 15 лет назад (в 11-летнем возрасте). С самого начала заболевание приобрело неустойчивый, лабильный характер, что не позволяло обеспечивать стойкую компенсацию нарушенного углеводного обмена, несмотря на применение различных вариантов инсулинотерапии. В последние годы диабет стал протекать более стабильно, но появились клинические признаки поздних диабетических осложнений - ретинопатии и нефропатии. Особенно бурно прогрессировали патологические изменения на глазном дне: при обследовании перед трансплантацией была диагностирована пролиферативная диабетическая ретинопатия обоих глаз. Основными проявлениями диабетической нефропатии были протеинурия (до 1 г/л/сут.) и умеренная артериальная гипертензия. Внутримышечная трансплантация материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы, полученного из поджелудочной железы новорожденных кроликов, существенно изменила клиническое течение сахарного диабета у больной. Так, значительно снизилась потребность в экзогенном инсулине: с дотрансплантационных 32 ед. до 20 ед. через 2 недели после пересадки, до 12 ед. через 4 недели и до 4 - 6 ед. - к исходу 2-го месяца. Столь низкая доза вводимого за сутки инсулина (сниженная на 81 - 88% по сравнению с дотрансплантационной) сохранялась на протяжении почти полугода, после чего постепенно потребность в экзогенном инсулине повысилась, достигнув к 10 - 11 месяцу после трансплантации 22 ед. (меньше по сравнению с потребностью перед пересадкой на 31%). Сниженная доза вводимого инсулина сохранялась по меньшей мере на протяжении 16 месяцев после трансплантации материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы. Особо следует отметить результаты воздействия проведенной пересадки на течение поздних осложнений диабета у больной. Существенно улучшилась клиническая картина глазного дна: произошло рассасывание преретинальных кровоизлияний, истончение и инволюция фиброзных пролифератов, запустевание новообразованных кровеносных сосудов. Позитивное влияние трансплантации на течение диабетической нефропатии заключалось в стойком исчезновении протеинурии и нормализации артериального давления.

Таким образом, использование материала, содержащего бета-клетки поджелудочной железы, полученного с использованием феномена их миграции для трансплантации, позволит существенно повысить эффективность операции, упростить получение и снизить себестоимость этого материала, что в свою очередь является предпосылкой для широкого внедрения этого способа лечения сахарного диабета.