способ изготовления вакцины против пастереллеза сельскохозяйственных животных и птиц

Формула изобретения

Способ изготовления вакцины против пастереллеза сельскохозяйственных животных и птиц, включающий культивирование вакцинного штамма пастерелл в жидкой питательной среде на основе мясного гидролизата с регулированием рН на уровне 7,8 - 8,2 ед, и парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 30 - 40%, отличающийся тем, что выращивание проводят непрерывно-проточным методом с лимитированием роста пастерелл глюкозой и начальной концентрацией глюкозы в питательной среде 1 - 5 г/л при скорости разбавления 0,5 - 0,9 1/ч.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве вакцин против пастереллеза сельскохозяйственных животных и птиц.

Известен способ изготовления вакцины против пастереллеза птиц (Патент SU 1566533 А1 А 61 К 39/102).

Существующий способ изготовления вакцины против пастереллеза обладает рядом недостатков: процесс культивирования ведется периодическим способом, при котором свойства клеток и состав культуральной среды значительно изменяются в ходе выращивания и который обладает низкой производительностью из-за большого числа подготовительных и вспомогательных операций, что сказывается на качестве препарата, а также на эффективности производства.

При анализе патентной документации и научно-технической литературы нами не обнаружено достаточно эффективного способа изготовления вакцин против пастереллеза, приближающегося к современному уровню производства биопрепаратов.

Целью заявляемого изобретения является увеличение продуктивности процесса культивирования по выходу морфологически типичных и жизнеспособных пастерелл с учетом гибели клеток при хранении вакцины, а также повышение качества препарата и стандартности биологических свойств вакцины.

Поставленная цель достигается за счет того, что процесс выращивания пастерелл проводят непрерывно-проточным хемостатным способом, т.е. с непрерывной подачей в ферментер определенных количеств питательной среды и раствора глюкозы, и также непрерывным сливом из аппарата такого же количества бактериальной суспензии, которая используется на последующих стадиях изготовления вакцины.

Способ осуществляется следующим образом.

В стерильный ферментер загружают жидкую питательную среду, изготовленную на основе мясного гидролизата. Среду засевают культурой пастерелл (Pasteurella multocida штаммы Пастеровский, К, AB, А-8683, В-681, Д-Т-80), выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и культивируют периодическим способом в течение 3-4 часов. Затем включают проток стерильной питательной среды и раствора глюкозы таким образом, чтобы суммарный объем поступающих за 1 час в ферментер питательной среды и раствора глюкозы составлял 0,5-0,9 объема суспензии в аппарате, а концентрация глюкозы в поступающей питательной среде была в пределах 1-5 г/л. Устройство слива по уровню при этом поддерживает постоянный объем бактерийной суспензии в аппарате. В ферментере стабилизируют pH культуральной жидкости на уровне 7,8-8,2 ед. подачей раствора NaOH, а парциальное давление растворенного кислорода (pO₂) на уровне 30-40% от насыщения кислородом воздуха - изменением расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки. После установления в ферментере постоянной концентрации пастерелл бактерийную суспензию используют для изготовления вакцины. В указанных пределах изменения скорости разбавления, концентрации глюкозы в питательной среде, pH и pO₂ рост пастерелл лимитируется источником углерода - глюкозой.

Пример 1.

Способ изготовления вакцины против пастереллеза птиц из шт. "K" с минимальными значениями параметров. Для культивирования пастерелл используют жидкую питательную среду на основе мясного гидролизата с pH 7,8 ед., в процессе выращивания поддерживают pO₂ на уровне 30% от насыщения культуральной среды кислородом воздуха. Среду засевают культурой пастерелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и культивируют в течение 3-4 часов при температуре (371)^oC. Затем включают проток стерильной питательной среды и раствора глюкозы таким образом, чтобы их суммарный объем, поступающий в аппарат за 1 час составлял 0,5 от объема баксуспензии в ферментере, а концентрация глюкозы в поступающей среде была 1 г/л. После установления в аппарате постоянной концентрации пастерелл, баксуспензию используют для изготовления вакцины: Концентрация колониеобразующих пастерелл при этом составляет 22,4 млрд. /мл, культура имеет типичную морфологию (короткие грамотрицательные палочки), стабильную ультраструктурную организацию.

Продуктивность по выходу жизнеспособных пастерелл хемостатного процесса культивирования составляет 11,2 млрд./млчас, экономический коэффициент - 18,0 млрд. микробных тел/мг глюкозы. Рост пастерелл лимитирован глюкозой. Вакцина, изготовленная из хемостатной культуры пастерелл безвредна, иммуногенность составляет 95%. Стабильность при хранении в течение 3 месяцев - 53%. Продуктивность с учетом гибели клеток при хранении - 5,9 млрд. микр. тел/млчас.

Пример 2.

Способ изготовления вакцины против пастереллеза птиц из шт. "K" с оптимальными значениями параметров. Для культивирования пастерелл используют жидкую питательную среду на основе мясного гидролизата с pH 8,0 ед., в процессе выращивания поддерживают pO₂ на уровне 35% от насыщения культуральной среды кислородом воздуха. Среду засевают культурой пастерелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и культивируют в течение 3-4 часов при температуре (371)^oC. Затем включают проток стерильной питательной среды и раствора глюкозы таким образом, чтобы их суммарный объем, поступающий в аппарат за 1 час составлял 0,7 от объема баксуспензии в ферментере, а концентрация глюкозы в поступающей среде была 3 г/л. После установления в аппарате постоянной концентрации пастерелл, баксуспензию используют для изготовления вакцины. Концентрация колониеобразующих пастерелл при этом составляет 19,6 млрд. /мл, культура имеет типичную морфологию (короткие грамотрицательные палочки), стабильную ультраструктурную организацию. Продуктивность по выходу жизнеспособных пастерелл хемостатного процесса культивирования составляет 13,8 млрд./млчас, экономический коэффициент - 6,0 млрд. микробных тел/мг глюкозы. Рост пастерелл лимитирован глюкозой. Вакцина, изготовленная из хемостатной культуры пастерелл безвредна, иммуногенность составляет 100%. Стабильность при хранении в течение 3 месяцев - 51,2%. Продуктивность с учетом гибели клеток при хранении - 7,1 млрд. микр. тел/млчас.

Пример 3.

Способ изготовления вакцины против пастереллеза птиц из шт. "K" с максимальными значениями параметров. Для культивирования пастерелл используют жидкую питательную среду на основе мясного гидролизата с pH 8,2 ед., в процессе выращивания поддерживают pO₂ на уровне 40% от насыщения культуральной среды кислородом воздуха. Среду засевают культурой пастерелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и культивируют в течение 3-4 часов при температуре (371)^oC. Затем включают проток стерильной питательной среды и раствора глюкозы таким образом, чтобы их суммарный объем, поступающий в аппарат за 1 час составлял 0,9 от объема баксуспензии в ферментере, а концентрация глюкозы в поступающей среде была 5 г/л. После установления в аппарате постоянной концентрации пастерелл, баксуспензию используют для изготовления вакцины. Концентрация колониеобразующих пастерелл при этом составляет 14,8 млрд./мл, культура имеет типичную морфологию (короткие грамотрицательные палочки), стабильную ультраструктурную организацию. Продуктивность по выходу жизнеспособных пастерелл хемостатного процесса культивирования составляет 13,0 млрд./млчас, экономический коэффициент - 3,4 млрд. микробных тел/мг глюкозы. Рост пастерелл лимитирован глюкозой. Вакцина, изготовленная из хемостатной культуры пастерелл, безвредна, иммуногенность составляет 100%. Стабильность при хранении в течение 3 месяцев - 45%. Продуктивность с учетом гибели клеток при хранении - 5,85 млрд. микр. тел/млчас.

Пример 4.

Способ изготовления вакцины против пастереллеза птиц из.шт. "K" со значениями параметров ниже минимальных. Для культивирования пастерелл используют жидкую питательную среду на основе мясного гидролизата с pH 7,5 ед., в процессе выращивания поддерживают pO₂ на уровне 15% от насыщения культуральной среды кислородом воздуха. Среду засевают культурой пастерелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и культивируют в течение 3-4 часов при температуре (371)^oC. Затем включают проток стерильной питательной среды и раствора глюкозы таким образом, чтобы их суммарный объем, поступающий в аппарат за 1 час составлял 0,3 от объема баксуспензии в ферментере, а концентрация глюкозы в поступающей среде была 0,5 г/л. После установления в аппарате постоянной концентрации пастерелл баксуспензию используют для изготовления вакцины. Концентрация колониеобразующих пастерелл при этом составляет 28,4 млрд. /мл, культура имеет типичную морфологию (короткие грамотрицательные палочки), стабильную ультраструктурную организацию. Продуктивность по выходу жизнеспособных пастерелл хемостатного процесса культивирования составляет 8,0 млрд./млчас, экономический коэффициент - 30,0 млрд. микробных тел/мг глюкозы. Рост пастерелл лимитирован глюкозой. Вакцина, изготовленная из хемостатной культуры пастерелл, безвредна, иммуногенность составляет 90%. Стабильность при хранении в течение 3 месяцев - 60%. Продуктивность с учетом, гибели клеток при хранении - 4,8 млрд. микр. тел/млчас.

Пример 5.

Способ изготовления вакцины против пастереллеза птиц из шт. "K" со значениями параметров выше максимальных. Для культивирования пастерелл используют жидкую питательную среду на основе мясного гидролизата с pH 8,5 ед., в процессе выращивания поддерживают pO₂ на уровне 55% от насыщения культуральной среды кислородом воздуха. Среду засевают культурой пастерелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и культивируют, в течение 3-4 часов при температуре (371)^oC. Затем включают проток стерильной питательной среды и раствора глюкозы таким образом, чтобы их суммарный объем, поступающий в аппарат за 1 час составлял 1,4 от объема баксуспензии в ферментере, а концентрация глюкозы в поступающей среде была 10 г/л. После установления в аппарате постоянной концентрации пастерелл баксуспензию используют для изготовления вакцины. Концентрация колониеобразующих пастерелл при этом составляет 12,0 млрд./мл, наблюдается полиморфизм клеток со стабильной ультраструктурной организацией. Продуктивность по выходу жизнеспособных пастерелл хемостатного процесса культивирования составляет 16,7 млрд. /млчас, экономический коэффициент - 1,6 млрд. микробных тел/мг глюкозы. Рост пастерелл лимитирован не глюкозой, а другим неизвестным компонентом питания. Вакцина, изготовленная из хемостатной культуры пастерелл, реактогенна, иммуногенность составляет 95%. Стабильность при хранении в течение 3 месяцев - 21%. Продуктивность с учетом гибели клеток при хранении - 3,5 млрд. микр. тел/млчас.

Технологические параметры изготовления серий сухой живой вакцины против пастереллеза птиц из шт. "K" приведены в таблице. Аналогичные закономерности наблюдаются и у других вышеупомянутых штаммов пастерелл.

Применение непрерывно-проточного хемостатного процесса культивирования при производстве вакцин позволяет повысить продуктивность процесса выращивания пастерелл по сравнению с периодическим способом выращивания не менее чем в 5 раз, уменьшить количество и продолжительность подготовительных операций, автоматизировать процесс культивирования, уменьшить затраты ручного труда, повысить качество препарата за счет того, что вакцины изготавливаются из стабильных по биологическим свойствам культур, выращенных с постоянными и точно определенными скоростью роста, концентрациями клеток, компонентов питательной среды и метаболитов.