протеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих, рекомбинантный протеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов, фрагмент днк, кодирующий рекомбинантный протеин, вектор экспрессии (варианты), штамм культивируемых животных клеток внк - продуцент рекомбинантного протеина (варианты), способ получения рекомбинантного протеина, фармацевтическая композиция

Формула изобретения

1. Протеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих, выделенный из слюны Triatoma pallidipennis, имеющий следующую N-концевую аминокислотную последовательность: Glu Glu Cys Glu Leu Met Pro Pro Gly Asp Asn Phe Asp Leu Glu Lys Tyr Phe Ser Ile.

2. Рекомбинантный протеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих, негликозилирован, со следующей аминокислотной последовательностью:

где X - Pro или Gln;

Y - Gly, Z - Gly или Val.

3. Протеин по п.2, отличающийся тем, что имеет аминокислотную последовательность, в которой X - Pro, Y - Gly, Z - Gly.

4. Протеин по п.2, отличающийся тем, что имеет аминокислотную последовательность, в которой Thr в положении 53 отсутствует, X - Pro, Y - Gly, Z - Val.

5. Протеин по п.2, отличающийся тем, что имеет аминокислотную последовательность, в которой X - Gln, Y - Gly, Z - Gly.

6. Фрагмент ДНК, кодирующий рекомбинантный протеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих, со следующей нуклеотидной последовательностью:

где X-CCG или CAG;

Y - GGT или GTT;

Z - ACA или ACG;

R - TCG или TCA.

7. Фрагмент ДНК по п.6, отличающийся тем, что имеет нуклеотидную последовательность, в которой X - CCG, Y - GGT, Z - ACA, R - TCG.

8. Фрагмент ДНК по п.6, отличающийся тем, что имеет нуклеотидную последовательность, в которой нуклеотиды в положении 148, 149, 150 отсутствуют, X - CCG, Y - GTT, Z - ACA, R - TCG.

9. Фрагмент ДНК по п.6, отличающийся тем, что имеет нуклеотидную последовательность, в которой X - CAG, Y - GGT, Z - ACG, R - TCA.

10. Вектор экспрессии pMPSV/CMV - ингибитор-I (DSM 7223), содержащий фрагмент ДНК по п.7, область полиаденилирования (poly A), ген устойчивости к ампициллину, энхансер CMV, промотор mPSV, сайт сплайсинга (SJ), ori pBR 322.

11. Вектор экспрессии pMPSV/CMV - ингибитор-II, содержащий фрагмент ДНК по п. 8, область полиаденилирования (poly A), ген устойчивости к ампициллину, энхансер CMV, промотор mPSV, сайт сплайсинга (SJ), ori pBR 322.

12. Штамм культивируемых животных клеток ВНК (pMPSV) CMV DSM 7223/ - ингибитор - I - продуцент рекомбинантного протеина, ингибирующего вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих.

13. Штамм культивируемых животных клеток ВНК (pMPSV) CMV - ингибитор - II - продуцент рекомбинантного протеина, ингибирующего вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих.

14. Способ получения рекомбинантного протеина, ингибирующего вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих, предусматривающий культивирование штамма-продуцента, выделение и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм по п. 12 или 13, а очистку осуществляют гельфильтрацией на "Superose 12" и в системе электрофорез-хроматография.

15. Фармацевтическая композиция, ингибирующая индуцируемую коллагеном агрегацию тромбоцитов, содержащая активное вещество и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества содержит полипептид по любому из пп.1 - 5 в эффективном количестве.

Описание изобретения к патенту

Коллаген представляет собой наиболее эффективный из известных индукторов агрегации тромбоцитов человека. Так, например, после повреждения стенок сосудов и экспонирования их коллагену тромбоциты быстро прилипают к этому месту и активируются /Baumgaptner/ 1977/, Thromb, Haemostas. 37, 1 - 16, Hauriger /1987/ Human Pathol. 18.111-122/.

Таким образом, вызываемая коллагеном агрегация тромбоцитов у человека представляет фактор риска для пациентов, подвергающихся процедурам, влияющим на кровеносные сосуды, например, пластическим операциям на сосудах или сепсису, для пациентов с инфарктом миокарда и для выздоравливающих после инфаркта миокарда, и др.

Ингибиторы вызываемой коллагеном агрегации тромбоцитов включают синтетические олигопептиды, соответствующие коллагеновой последовательности, протеины змеиного яда и халин, протеин медицинских пиявок. Синтетические олигопептиды, ингибируют вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов за счет того, что связывают тромбоциты. Их недостатком является то, что они оказывают влияние на агрегацию тромбоцитов только в относительно высоких дозах /около 70 мкг пептида/ мл обеспечивают 65% ингибирования/. См. Bevers et al. /1985/ "Полученный из октапептида коллаген ингибирует прокаагулянтную активность тромбоцитов, вызванную совместным действием коллагена и тромбина "Thrombosis Research, 37, 365 - 370, Karniguian et al. - 1983/ "Влияние полученного из октапептида коллагена на различные стадии взаимодействия тромбоцит/коллаген", Thrombosis Research, 32: 593-604 и Caen et al. /1981/ "Олигопептиды со специфическими ингибирующими свойствами вызываемых коллагеном агрегаций, способ их получения и содержащие их фармацевтические композиции" EPA 0040149. Ингибиторный механизм протеина змеиного яда до сих пор не известен. См. Smith et al. "Идентификация 50 кД протеинов змеиного яда, которые специфически ингибируют адгезию тромбоцитов к коллагену". Thrombosis and Haemostasis /1991, 65, 678/ труды XIII Конгресса Международного общества по проблемам тромбозов и гемостаза, июнь 30 - июль 6, 1991, Амстердам/. Халин реагирует с коллагеном, но не реагирует с тромбоцитами. Таким образом, он не специфичен для взаимодействия тромбоцит-коллаген, но он взаимодействует с коллагеном также и в отсутствии тромбоцитов. См. Munro et al /1991/ "Халлин - ингибитор адгезии тромбоцитов, полученный из слюны медицинских пиявок", Blood Coagulation and Tebrinolysis 2, 179 - 184.

В опубликованной Европейской патентной заявке EP 0480651 "Мегск and Co., Inc. , опубликованной 15 апреля 1992/, раскрыт протеин с молекулярным весом около 16 кД и его способность ингибировать вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов человека, причем протеин этот получен из слюнных желез пиявок Haemaenteria officinalis.

Необходимы другие ингибиторы такой агрегации, обладающие другими или усовершенствованными характеристиками.

В настоящем изобретении предложен природный выделенный, синтетически полученный или рекомбинантный протеин, который ингибирует вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов, и который выделяют, или который можно выделить из слюнных желез насекомых, сосущих кровь у млекопитающих.

Более предпочтительны тромбоциты приматов, и наиболее предпочтительны тромбоциты человека. Чувствительны также и тромбоциты других видов, например, лошадей, овец, рогатого скота, свиней, собак и кошек.

Синтетические протеины можно получить по способам J.M. Steward and J.D. Young, 1984 /, Твердофазный синтез пептидов Piеrce Chem. Company, Fockford III и Methoden der Organischen Chemie /Houben/ Weyl/. vol. 15, N 1 и 2, E. Wunsch /ed./, Thieme Verlag Stuttgart 1974.

Предпочтительны протеины настоящего изобретения, которые выделяют из слюны подсемейства /пат. Faminia /Tratomae и, наиболее предпочтительно, Triatoma pallidipennis.

Настоящее изобретение включает природный выделенный, синтетически полученный или рекомбинантный протеин, который ингибирует вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих, и который имеет следующую П-терминальную аминокислотную последовательность:



В другом варианте изобретения представлен протеин, который ингибирует вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих, и причем протеин этот имеет следующую аминокислотную последовательность: a/ последовательность, представленную в aa/ последовательность Id N 1; bb/ последовательность Id N 2 или cc/ последовательность Id N 3, или b/ аллельные модификации или мутации последовательностей в любой из последовательностей Id N 1 - 3, причем эти модификации или мутации не оказывают существенного влияния на активность протеина, или c/ протеин по любой из последовательностей Id N 1 - 3 или их модификациям или мутациям, указанным в пункте b/, содержащий посттрансляционные модификации, которые не оказывают существенного влияния на активность зрелого протеина.

Наиболее предпочтительным из указанных протеинов является рекомбинантный протеин.

Настоящее изобретение включает протеин, который не гликозилирован.

Следующим вариантом изобретения являются кДНК или ДНК a/ кодирующие протеин, со следующей аминокислотной последовательностью: a/ последовательность, представленную в aa/ последовательности Id N 1, bb/ последовательности Id N 2 или cc/ последовательности Id N 3, или b/ кодирующие протеин, который имеет последовательность аминокислот, согласно любой из последовательностей N 1 - 3, с, по крайней мере, одной аллельной модификацией или мутацией, которая не оказывает существенного влияния на активность зрелого протеина, кодируемого соответствующей кДНК или ДНК последовательностью.

Протеин настоящего изобретения включает зрелый протеин и протеин, который содержит сигнальную последовательность, предшествующую N-терминальной последовательности зрелого протеина. Сигнальные последовательности представлены на фиг. 13a и 13b, и им соответствует отрицательная нумерация. Она начинается с Мет. Lys. Val.IIe.IIe и оканчивается His. Ala, Phe. Ala. Эта сигнальная последовательность отвечает за проникновение через мембрану после биосинтеза протеина. Секретируемый протеин представляет собой зрелый протеин, начинающийся с Glu.Cys.Glu.Leu... Эта сигнальная последовательность отщепляется до секретирования.

Настоящее изобретение, предпочтительно, содержит кДНК или ДНК со следующей нуклеотидной последовательностью:

a/ нуклеотидная последовательность, представленная в

aa/ последовательность I d N 4, bb/ последовательность I d N 5, или cc/ последовательность I d N 6, или b/ последовательность нуклеотидов по любой из последовательностей N 4 - 6, с, по крайней мере, одной аллельной модификацией или мутацией, которые существенно не влияют на активность зрелого протеина, который кодируется соответствующей нуклеотидной последовательностью.

Следующую часть изобретения составляет вектор, содержащий кДНК или ДНК, указанные ранее, который, кроме того, содержит подходящий сигнальный пептид, подходящий промотор и, при необходимости, подходящий энхансер. Векторы подробно описаны в примерах, а также в Европейской патентной заявке EP 0480651; 0463632 и 0173177.

Следующий вариант изобретения составляет клетки эукариотных или прокариотных хозяев, трансформированные указанным ранее вектором.

Наиболее предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки почек детенышей хомяков. Так как законные требования делают депонирование таких клеток невозможным, плазмидную экспрессирующую конструкцию, содержащую ДНК последовательность Id N 1 депонировали 2 сентября 1992 г при регистрационным номерам DSM...

Дополнительно настоящее изобретение включает способ получения протеина, отличающийся тем, что включает культивирование клетки хозяина, трансформированной вектором, содержащим ген, кодирующий протеин, и выделение и очистку протеина. Конкретные варианты описаны в примерах изобретения, а общие способы можно выяснить из указанных в описании работ и особенно из примеров изобретения.

Промышленным применением протеинов настоящего изобретения является использование этих протеинов в фармацевтических композициях, содержащих протеин настоящего изобретения вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Подробности можно найти в разделе Применение описания.

Аллельные модификации, указанные ранее, включают изменения в последовательности нуклеотидов или аминокислот, изменения в генотипе или фенотипе. По крайней мере, один нуклеотид или аминокислота могут быть замещены, исключены или вставлены.

Большинство делеций, вставок и замещенний не должны приводить к радикальным изменениям характеристик протеина настоящего изобретения. Так как трудно предсказать точное действие замещений, делеций или вставок заранее, сравнение функций зрелого протеина с характеристическими функциями протеина настоящего изобретения может прояснить, имеет ли измененный протеин сравнимую активность.

Генетический код является вырожденным; то есть большинство аминокислот кодируется более чем одним кодоном из трех нуклеотидов. Соответственно, аллельные варианты в нуклеотидной последовательности могут изменять или не изменять аминокислотную последовательность. Поэтому аллельные вариации происходят первоначально на уровне ДНК и могут также существовать как вторичные на уровне аминокислотной последовательности.

ДНК последовательность, кодирующая протеин настоящего изобретения, может быть модифицирована обычными способами для получения вариаций в конечном протеине изобретения, который сохраняет практически ту же активность, что и протеин изобретения. Активность определяют по способу примера 1. Таким образом, одну или более из аминокислот, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.. . вплоть до 15 аминокислот, можно добавить, заменить или удалить, практически не влияя на активность протеина настоящего изобретения. Замещения обычно проводят в соответствии с таблицей 1, если нужно слегка изменить аминокислотную последовательность протеина настоящего изобретения.

Существенные изменения в функциях или иммунологической идентичности можно осуществить, выбирая замещения, которые менее консервативны, нежели приведенные в таблице 1, то есть, выбирая остатки, которые значительнее отличаются по своему действию на /a/ структуру полипептидной основной цепи в области таких изменений, как, например, плоская или спиральная конформа или гидрофобность молекулы, или /c/ объем боковых цепей.

Таблица 1.

Обычные замены аминокислот в протеине

Исходные остатки - Примеры замен

Ala - Gly, Ser

Arg - Lys

Asn - Gln, His

Asp - Glu

Cys - Ser

Gln - Asn

Glu - Asp

Gly - Ala, Pro

His - Asn, Gln

lle - Leu, Val

Leu - lle, Val

Lys - Arg, Gln, Glu

Met - Leu, Tyr, lle

Phe - Met, Leu, Tyr

Ser - Thr

Thr - Ser

Trp - Tyr

Tyr - Trp, Phe

Val - lle, Leu

Мутации определяют по гомологии между двумя сравниваемыми протеинами. Экспрессионная гомология включает сходство аминокислот и разрывов в последовательностях для обоих сравниваемых последовательностей. Сходство аминокислот определяют, например, по таблице 1.

Предпочтительно, чтобы протеин имел аминокислотную последовательность с гомологией, по крайней мере, на 60%, более предпочтительно, по крайней мере, на 80%, и еще более предпочтительно, по крайней мере, на 90%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере на 95% гомологии одной из последовательностей Id N 1-3.

Как указано ранее, настоящее изобретение включает варианты ДНК. Эти последовательности гибридизуются в жестких условиях с ДНК последовательностью, определенной в одной из последовательностей Id 4 - 6. Последовательно, чтобы кДНК и ДНК имели нуклеотидную последовательность с гомологией, по крайней мере, 60%, более предпочтительно, по крайней мере, 80%, гораздо более предпочтительно, по крайней мере, 90%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 95% соответствующей последовательности, представленной в одной из последовательностей Id N 4 - 6. Гомологию можно определить с помощью гибридизации, как указано у R.Knippers, Moleculare Genetic. 1982, 3ed., Georg Thееme Verlag Stuttgart, New York.

Под "пост-трансляционными вариантами", упомянутыми ранее, подразумевают вариации во время или после трансляции, такие как гликозилирование, образование дисульфидных мостиков и химические модификации аминокислот.

Гликозилирование является одной из основных биосинтетических функций эндоплазматического ретикулума и/или комплекса Гольджи. Последовательность и разветвление олигосахаридов, которые образуются в ретикулуме, могут быть изменены в комплексе Гольджи, лизосомах или плазматической мембране. Олигосахариды могут быть N-связанными олигосахаридами /аспарагиновые связи/ или O-связанными олигосахаридами /сериновые, треониновые или гидроксилизиновые связи/. Гликозилирование зависит от типа продуцирующих клеток и видов, из которых эти клетки получены. Степень и тип гликозилирования могут зависеть от соединений, как описано в Европейской патентной заявке EP 0222313. Изменения в гликозилировании могут изменить функции протеина.

Обычно зрелый протеин настоящего изобретения гликозилирован.

Протеины часто образуют ковалентные межцепные связи. Эти дисульфидные связи образуются между SH-группами цистеинов в протеине с уложенной цепью или при укладке цепи протеина во время трансляции. Эти связи стабилизируют трехмерную структуру протеина. Такие дисульфидные связи редко образуются в молекулах протеина, которые еще находятся в цитозоле клетки, так как высокая внутриклеточная концентрация - SH восстанавливающего агента глутатиона разрушает большинство таких связей.

Поскольку протеины находятся вне цитоплазмы и секретируются или находятся на поверхности клеток, они часто образуют дополнительные ковалентные внутрицепные связи.

Кроме того, аминокислоты могут быть изменены способом, описанным в РСТ заявке WO 91/10684. Другие изменения боковых цепей аминокислот также возможны.

Предпочтительно, чтобы гомологичность составляла, по крайней мере, 90%, более предпочтительно, по крайней мере, 95%, гораздо более предпочтительно, по крайней мере, 98%, и наиболее предпочтительно, чтобы изменения касались одной или двух аминокислот.

Протеин изобретения имеет степень чистоты, по крайней мере 40%: предпочтительно, по крайней мере, 60%, более предпочтительно, по крайней мере 80%; и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 90%. Степень чистоты определяют по количеству протеина настоящего изобретения по отношению к полному количеству протеина. Используя очистку на двух стадиях, вначале гель-фильтрацией на Сефарозе /см. пример 2/, и затем с помощью HPEC /см. пример 15/, получают протеин настоящего изобретения, помимо которого никаких других протеинов не детектируется способами примера 15.

Далее, настоящее изобретения включает связывающие молекулы, отдельные цепи протеинов, антитела или их фрагменты, распознающие специфически домены на зрелом протеине изобретения.

Используя очищенный протеин изобретения /см. например, последовательности Id N 1 - 3/ продуцируют моноклональные антитела хорошо известным способом Koehler and Milstein, который, в частности, включает обычную иммунизацию мышей очищенным протеином изобретения в качестве иммуногена.

Лучшим вариантом настоящего изобретения является протеин, указанный как последовательность Id N 1, экспрессированный в трансфецированных клетках почки детеныша хомяка.

Кроме того, изобретение включает способ очистки протеина настоящего изобретения, включающий /a/ стадию гель-фильтрации на "Superose 12" /см. пример 2/, и /b/ стадию обработки в высокоэффективной системе электрофорез-хроматография /См. пример 15/.

Применение соединений.

Протеины настоящего изобретения демонстрируют фармакологическую активность и поэтому могут быть использованы в качестве лекарств. Их можно использовать в фармацевтических композициях, содержащих протеин настоящего изобретения вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Кроме того, настоящее изобретение включает фармацевтические композиции, содержащие фармацевтически активный протеин настоящего изобретения, и его фармацевтически приемлемые соли или фармацевтически приемлемые носители.

В частности, протеин настоящего изобретения демонстрирует ингибирование индуцированных коллагеном агрегаций, тромбоцитов и ингибирование адгезии опухолевых клеток, предпочтительно, клеток метастазов опухолей к коллагену.

Лекарства против агрегации тромбоцитов

Протеины настоящего изобретения демонтируют ингибирование агрегации тромбоцитов. Тестовая система описана в примере 1. Протеины настоящего изобретения демонстрируют значительное ингибирование агрегации тромбоцитов в концентрации 0,5 - 50 мкг протеинов слюны в 0,5 мл или 0,5 - 250 мкг протеина в 0,7 мл очищенного протеина /только очистка по способу примера 2/.

Тестирование наиболее предпочтительного протеина, протеина с последовательностью Id N 1, дает величину ИК₅₀ 50 нмолей/л протеина с высокой степенью очистки по способу примеров 2 и 15. Протеины настоящего изобретения демонстрируют ингибирование агрегации тромбоцитов в концентрациях от 5 нмолей/л до около 1000 нмолей/л

Результаты, полученные для in vitro тестовых систем, указывают на то, что протеины настоящего изобретения можно использовать в качестве лекарств, или можно использовать для медицинского применения. Результаты тестов можно перенести из системы in vitro в системы in vitro, так как это принято в этой области знаний. R.J.Shebuski et al. /1990/ Thombosis and Haemostasis, 64:576 - 581

Протеины настоящего изобретения вводят внутрибрюшинными инъекциями, ежедневно или 2 - 3 раза в день. Если вводить животным ежедневно до достижения концентрации в крови 100 нмолей/л, у них происходит снижение агрегации тромбоцитов. В этих условиях не наблюдается серьезных побочных явлений.

Протеины настоящего изобретения демонстрируют такое ингибирование агрегации тромбоцитов у мышей при ежедневных дозах до достижения концентрации в крови от около 10 до 1000 нмолей/л.

Поэтому протеины настоящего изобретения можно использовать для лечения атеросклероза или тромботических поражений, или для предотвращения повторной окклюзии после лечения инфаркта миокарда. Другими словами: протеины настоящего изобретения можно использовать в качестве противоатеросклеротических и противотромботических агентов для млекопитающих, включая человека, например, для лечения атеросклеторических/тромботических поражений, например, связанных с разрушением атеросклеротических бляшек или связанных с нарушением или удалением эндотелия, например, в результате сепсиса или трансплантации, или для лечения нестабильной стенокардии. Его можно также использовать для предотвращения повторной окклюзии после лечения инфаркта миокарда фибринолизом или антиопластикой /PTCA/. Если для лечения инфаркта миокарда используют фибринолитическую терапию /стрептокиназой, т-РА или другими плазминогенными активаторами/, тогда протеины настоящего изобретения можно использовать в качестве вспомогательных агентов для предотвращения повторной окклюзии кровеносных сосудов. Лечение инфаркта миокарда катетер-баллоном /РТСА/ также приводит к поражению стенок кровеносных сосудов, что может привести к образованию новых тромбов. Это можно предотвратить, вводя протеины изобретения во время или после процедуры. Эти протеины нельзя использовать только при коронарной ангиопластике, но можно использовать в других вариантах ангиопластики.

Настоящее изобретение обеспечивает:

a/ применение протеина настоящего изобретения для приготовления лекарств для лечения атеросклероза или тромбоза, или для предотвращения повторной окклюзии после лечения инфаркта миокарда; /эти протеины годятся для лекарств, принимаемых в целях профилактики/.

b/ способ лечения атеросклероза или тромбоза, или для предотвращения повторной окклюзии после лечения инфаркта миокарда, который включает введение эффективно подавляющего заболевание количества протеина настоящего изобретения пациенту, нуждающемуся в таком лечении;

c/ фармацевтическую композицию для лечения атеросклероза или тромбоза, или для предохранения повторной окклюзии после лечения инфаркта миокарда, которая включает протеин настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

Соответствующие таким показаниям дозы, естественно, зависят от, например, используемого соединения настоящего изобретения хозяина, способа введения и природы и степени подлежащего лечению заболевания. Однако, вообще, показано, на животных, что удовлетворительные результаты достигаются при ежедневных дозах, обеспечивающих достижение концентрации в крови от 10 до 1000 нмоль/л, предпочтительно, при ежедневных дозах от 30 до 300 нмолей/л.

Протеины настоящего изобретения можно вводить любым обычным способом, в частности, энтерально, орально, например, в виде таблеток или капсул, или парэнтерально, например, в виде растворов или суспензий для инъекций.

Предпочтительным протеином является протеин с последовательностью Id N 1.

Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие соединения настоящего изобретения вместе с, по крайней мере, одним фармацевтическим носителем или разбавителем. Такие композиции соединения можно получить обычными способами. См. Remingtonis Pharmaceutical Science, 15 ed, Mack Publishing Company, Easton Pemsylwana /1980/.

Лекарства против метастатических опухолевых клеток.

Протеины настоящего изобретения демонстрируют ингибирование адгезии метастатических опухолевых клеток к коллагену. Тестовая система представлена на фиг. 14. Протеины настоящего изобретения демонстрируют существенно ингибирование адгезии метастатических опухолевых клеток к коллагену в концентрациях от 1 до 100 мкг протеина слюны в 0,5 мл или 1 - 500 мкг протеина в 0,5 мл очищенного протеина /очищенного только по способу примера 2/.

Тестирование наиболее предпочтительного протеина, протеина с последовательностью Id N 1, дает значение ИК₅₀ 100 нмоль/л протеина с высокой степенью очистки по способам примеров 2 и 15. Протеины настоящего изобретения демонстрируют ингибирование адгезии опухолевых клеток к коллагену при концентрациях от 10 до 2000 нмоль/л.

Результаты, полученные в тестовой системе in vitro, показывают, что протеины настоящего изобретения можно использовать в качестве лекарств или для медицинского лечения. Тестовые результаты, полученные in vitro, можно перенести в систему так, как это принято в этой области медицины. Chan et al. /1990/ Science 2:1600 - 1602.

Протеины настоящего изобретения можно вводить во время или после хирургической операции первичных опухолей для предотвращения образования метастазов за счет отделившихся опухолевых клеток, которые могут попасть в поток крови во время операции. Такие антиметастатические эффекты можно исследовать на "экспериментальных" и "спонтанных" животных моделях, как описано Chan et al., Science 2:1600 - 1602. Протеины изобретения вводят внутрибрюшинными инъекциями ежедневно или 2-3 раза в неделю. Если животным вводят ежедневно дозу до достижения концентрации в крови 200 нмоль/л, у них проявляется пониженная адгезия метастатических опухолевых клеток, по данным определения количества центров осевших метастатических клеток. В таких условиях не наблюдается серьезных побочных эффектов.

Протеины настоящего изобретения демонстрируют такую ингибирующую адгезию эффективность по ингибированию метастатических опухолевых клеток к коллагену у мышей при дневных дозах, обеспечивающих достижение концентрации в крови от 20 до 2000 нмоль/л, предпочтительно, концентраций от 60 до 600 нмоль/л.

Поэтому протеины настоящего изобретения пригодны для лечения рака, предпочтительно, рака с метастатическими опухолевыми клетками, и наиболее предпочтительно, рака с большим количеством метастатических опухолевых клеток.

Настоящее изобретение обеспечивает

a/ применение протеина настоящего изобретения для получения лекарства для лечения рака с метастатическими опухолевыми клетками. /Такие протеины пригодны для профилактических лекарств, вводимых, например, до хирургического удаления опухолей/.

b/ способ лечения рака с метастатическими опухолевыми клетками, который включает протеин настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

При таких показаниях соответствующие дозы будут, естественно, зависеть, например, от используемых соединений изобретения, пациента, способа введения и природы и степени заболевания, подлежащего лечению. Однако вообще, удовлетворительных результатов в опытах на животных удается достичь при ежедневных дозах, обеспечивающих достижение концентрации в крови от 20 до 2000 нмоль/л, предпочтительно, при ежедневных дозах от 60 до 600 нмоль/л.

Протеины настоящего изобретения можно вводить любым удобным способом, в частности, энтерально, орально, например, в форме таблеток или капсул, или парэнтерально, например, в форме растворов или суспензий для инъекций.

Предпочтительным соединением является протеин с последовательностью ID N 1.

Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие соединение изобретения вместе с, по крайней мере, одним фармацевтическим носителем или разбавителем. Такие композиции можно приготовить обычными способами. См. Pemington Pharmaceutical Science, 15 ed, Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania /1980/.

Краткое содержание изобретения

В настоящем изобретении предложен ингибитор вызываемой коллагеном агрегации тромбоцитов человека. Новый специфический ингибитор представляет собой природный протеин /то есть не олигопептид/, который также ингибирует взаимодействие опухолевых клеток с коллагеном. Такой ингибитор присутствует в слюне кровососущих насекомых Triatoma pallidipennis. См. пример 1.

Таким образом, настоящее изобретение относится к очищенному и выделенному протеину, который ингибирует индуцируемую коллагеном агрегацию тромбоцитов человека. Этот протеин можно выделить из Triatoma pallidipenis. Оно также относится к фармацевтическим композициям, содержащим протеин, и к способам применения последнего для лечения тромботических поражений, или для предотвращения повторной окклюзии после лечения инфарктов миокарда, а также для лечения, наряду с другими, развития метастазов.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает ценное фармакологически активное вещество, например новый протеин, который специфически ингибирует вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов, с высокой степенью специфической активности; новый протеин, который специфически противодействует взаимодействию тромбоцит-коллаген, не вызывая высвобождения внутритромбоцитных составляющих, например АТГ, который обладает нежелательным побочным эффектом сам по себе; новый протеин для фармацевтического использования при лечении атеросклероза и тромбоза или для предотвращения повторной окклюзии после лечения инфаркта миокарда; новый протеин, который противодействует взаимодействию опухолевая клетка-коллаген и который можно использовать, например, для предотвращения метастазов опухолевых клеток.

Исследования характеристик и свойств ингибитора привели к следующим результатам:

1/ Ингибитор не является антагонистом рецепторов фибриногена, так как эксперименты с возрастающими концентрациями фибриногена не выявили какого-либо влияния на ингибирующую активность. См. Пример 3.

2/ Он не является антагонистом тромбоксана, так как предотвращает вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов, предварительно обработанных аспирином, а не агрегацию, вызванную U 46619 /имитатор тромбоксана/. См. пример 4.

3/ По-видимому, он не является ингибитором направления трансдукции сигнала, осуществляемого за счет протеинкиназы C, так как агрегация, индуцируемая форболестера /форбол-12-миристал-13-ацетат/ не ингибируется. См. пример 4.

4/ Он ингибирует реакцию высвобождения обработанных коллагеном тромбоцитов. См. пример 5.

5/ Он не ингибирует агрегацию тромбоцитов, вызываемую тромбином или АДР. См. пример 6.

6/ Ингибитор не реагирует с коллагеном. Хотя предварительное инкубирование ингибитора с коллагеном и не приводит к повышению ингибирующей активности, пролонгированное инкубирование тромбоцитов с ингибитором приводит к более высокой потенции ингибиторов. См. пример 7.

7/ Ингибирование агрегации тромбоцитов становится обратимым при добавлении больших количеств коллагена. См. пример 7.

8/ Ингибиторы протеазы не обладают заметным влиянием на активность. Пример 8.

9/ Ингибирующая активность возрастает в присутствии ионов Mg²⁺. См. пример 9.

10/ Ингибитор предотвращает адгезию тромбоцитов к коллагеновой матрице зависимым от дозы способом. См. пример 10.

Эти результаты дают возможность предположить, что этот ингибитор является антагонистом коллагенового рецептора с высокой специфической активностью, например, ИК₅₀ = 2,5 мкг/мл сборной фракции "Superose", описываемой далее /на основании частично очищенного ингибитора/, и ИК₅₀=50 нмоль/л для высокой степени очистки протеина /очищенного на последовательных стадиях, описанных в примерах 2 и 15/.

11/ Ингибитор инкубировали с трипсином, связанным на сефарозной матрице. Ингибитор полностью терял активность за счет протеолитического расщепления. См. пример 11, в котором показано, что ингибитор является протеином.

12/ Ингибитор не расщепляется коллагеназой. См. пример 12.

13/ По данным гель-фильтрационной хроматографии в присутствии 150 мМ NaCl ингибитор имеет молекулярный вес 20 мДа5 кД, то есть, около 20 кД. См. пример 13. Значение для негликолизированного протеина /см. последовательность Id N 1/, рассчитанное для кДНК последовательности, составляет 18923 Дальтон.

14/ Ингибитор предотвращает адгезию высоко метастатических опухолевых клеток /MT Zn 3/ к коллагену зависимым от дозы образом /См. пример 14/.

Ингибитор настоящего изобретения не связывается с /или не реагирует с/ коллагеном, не связывается с тромбоцитами и не вызывает флоккуляции коллагена.

Ингибитор коллаген настоящего изобретения можно обычным способом выделить из слюны кровососущих насекомых Triatoma pallidipennis, например, как описано в примерах. Обычные способы сбора слюны вполне применимы для получения исходного материала слюны. Насекомые Triatoma pallidipennis преимущественно распространены, и поэтому легко доступны, в центральной и северной Америке. Они известны как вектор для Trypanosoma Cryi.

В другом аспекте настоящего изобретения предложена ДНК последовательность, векторы, содержащие эту последовательность клетки, содержащие эти векторы, способы рекомбинантного получения протеинов и антител к протеинам настоящего изобретения. Также предложены выделенные и/или рекомбинантные ДНК последовательности /например, геномная или кДНК/, кодирующие протеин /например, природный/, которые ингибируют вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов человека. Еще в одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантно полученные протеины изобретения, например, имеющие раскрытые в изобретении последовательности.

Под термином "выделенный" подразумевают, что ингибитор настоящего изобретения или другой агент присутствует в форме, выделенной из /очищенной от/ компонентов, с которыми он природно объединен, или с которым он получен рекомбинантно или синтетически.

Вообще включены все степени такого выделения или очистки. Предпочтительны такие степени выделения или очистки, после которых ингибитор может быть использован для фармацевтических целей. Так, например, такие степени выделения /например, активности или чистоты/ можно получить в результате таких хроматографических методик, которые описаны в примерах. Дальнейшей очистки, например, до гомогенности, можно удобно достичь, используя обычные методики, например, раскрытые в следующих литературных источниках:

Methods of Enzymology, Volume 182, Guide to Protein Purification, ed.

Murray P. DEUTSCHER, Academic Press 1999;

Protein Purification Applications - A Practical Approach, ed. E.L.V. Harris и S.ANGEl, IRL-Press 1990; Prorin Purification, Principles and Practice, Robert SCOPES, Springer-Verlag 1982; и Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications, ed. J.-C. JANSON and L. RYDEN, VCH publishers 1989.

Степень чистоты можно определить любым из ряда известных способов, например, SDS - электрофорезом на полиакриламидном геле, аналитической ВЖХ и т. д. Очищенный ингибитор можно использовать для определения аминокислотной последовательности протеина по способу полностью хорошо известному специалистам. Hewick, R.m. et al. /1981/, J. Biol. Chem 256. 7990-7997.

Протеины настоящего изобретения включают не только протеины, выделенные из приведенных в примере видов насекомых, но также из любых других организмов, которые могут содержать такой ингибитор. Кроме того, ингибитор настоящего изобретения включает ингибиторы родственной структуры, например, ингибитор, вызываемой коллагеном агрегации тромбоцитов, выделенный из другого организма, который имеет практически аналогичную аминокислотную последовательность.

Так как этот протеин выделен из жалящих насекомых, и его природное предназначение состоит в том, чтобы предотвратить закупорку кровью раны, образующейся после укуса, на достаточно длительный промежуток времени, чтобы насекомое могло отсосать кровь, совершенно очевидно, что другие подобные ингибиторы агрегации тромбоцитов под действием коллагена, можно обнаружить в слюне других кровососущих организмов, особенно насекомых, например, у других Reduviit bugs с конусными носами подсемейства. Triatominaе, таких как Triatoma infestans, T, dimidiata, T.maculata, Rhodmius prolixus, Panstrongylus megistus and P.infestans.

Протеины настоящего изобретения включают мономерные одноцепочечные молекулы, то есть такие, которые ковалентно или нековалентно не связаны с другими полипептидными цепями. Настоящее изобретение охватывает также другие формы молекул протеина, например, димеры или другие олигомеры, третичные структуры, образованные с другими полипептидами, фрагментами протеина и т.д. Включены как гликозилированные, так и негликозилированные формы, причем обе формы можно получить обычными способами экспрессией из, например, млекопитающих /гликозилированных/ или бактериальных клеток /негликозилированных/, соответственно.

Аминокислотную последовательность ингибитора настоящего изобретения можно использовать для определения последовательности подходящего ДНК зонда, который можно использовать для нахождения новых ингибиторов, например, в других видах. Такие зонды можно синтезировать обычным способом, например, используя автоматические ДНК синтезаторы и скринируя геномную или к ДНК библиотеки аналогично способам известным специалистам /см. международную публикацию WO 90/07861 от 26 июля 1990 г./

Так, например, настоящее изобретение относится к ДНК последовательности как раскрыто в фиг. 12a-c, 13 a и b и 22-24. Кроме того, настоящее изобретение относится к ДНК последовательности, кодирующей мутации, как указано ранее. Последовательность для -18 до +5 участка на фиг. 18, 21 и 24 получают из соответствующих полной длины кДНК последовательностей ингибиторов 1 и 2.

Поэтому настоящее изобретение включает также ДНК последовательность /кодирующую/ как природную ДНК последовательность /ген/ ингибитора, когда ее выделяют из природного окружения, например, в растворе или на векторе, а также их мутанты, так и встречающуюся в природе, например, в других видах, в выделенной форме или синтетической, например, полученной сайт-направленным мутагенезом. Способы скринирования генетических библиотек различных видов подходящим зондом обычны для специалистов. Способы получения мутантов также рутинны и знакомы специалистам, также как и способы тестирования эффективности таких новых протеинов, например, как описано.

Подходящие мутанты, либо синтетические, либо природные /в выделенной форме/ представляют собой такие, которые содержат, по крайней мере, часть, например, 5%, предпочтительно, по крайней мере, 50%, и более предпочтительно, по крайней мере, 90% биологической активности, например ингибитора индуцируемой коллагеном, агрегации тромбоцитов, природного, выделенного из T.pallidipennis ингибитора, как указано.

Подходящие мутанты могут отличаться от природных протеинов любой возможной модификацией, включая делеции, добавления и/или замену одной или более из аминокислот, при условии, что сохраняется при этом основная биологическая активность; предпочтительно, чтобы биологическая активность не была бы затронута. Такие мутанты являются эквивалентами природных протеинов.

Аналогично, эквиваленты ДНК последовательностей, раскрытые здесь, включают аллельные варианты, последовательности, кодирующие эквивалентные мутанты, раскрытые здесь, и ДНК последовательности, которые им гомологичны.

Кроме того, настоящее изобретение включает фрагменты тромболитического полипептида, например, с аналогичными функциями или выделенными подфункциями, например, выделенные эпитопы, активные сайты, фибрин и/или фиброген связывающие участки, и т.д. Предпочтительны одноцепочечные формы ингибитора.

Настоящее изобретение относится также к антителам и продуцирующим антитела клеточным линиям, которые можно получить обычным способом, используя очищенные протеины настоящего изобретения, например, общепринятым способом Kohler and Milstein, который предусматривает обычную иммунизацию мышей протеином настоящего изобретения в качестве иммуногена. Настоящее изобретение относится также к фрагментам указанных антител, например фрагментам, содержащим домены, которые связываются с эпитопами ингибиторного протеина и с синтетическими связывающими доменами, например мимотопами, специфически распознающими доменами протеинов настоящего изобретения.

Ингибитор индуцируемой коллагеном агрегации тромбоцитов человека /и других млекопитающих/ настоящего изобретения можно использовать в качестве противоатеросклеротического и противотромботического агента для млекопитающих, включая человека, например, для лечения атеросклеротических/тромботических поражений, связанных, например, с разрывом атеросклеротических бляшек, образующихся в результате операций на сосудах /PTA/TPCA/ или связанных с нарушением или удалением эндотелия, например, в результате сепсиса или трансплантаций. Его можно также использовать для лечения нестабильной стенокардии и/или предотвращения повторной окклюзии после лечения инфаркта миокарда. Подробности такого применения, например, интервалы доз, режимы введения /предпочтительно, орально или парэнтерально/ и т.д., можно определить обычным способом например, аналогично и/или при сопоставлении с другими противотромботическими агентами, такими как т-PA, стрептокиназа, или другие ингибиторы агрегации тромбоцитов.

Ингибитор настоящего изобретения можно также использовать для предотвращения метастазов опухолевых клеток за счет блокирования их прохождения через соединительные ткани. Они применимы для предотвращения метастазов всех инвазивных опухолей например меланомы. Дальнейшее предлагается без намерения представить какую-либо теорию. Во время образования метастазов опухолевые клетки, должны проникнуть через основную мембрану и интерстициальный матрикс. В обоих матриксах находится множество типов коллагенов. Распространение опухолевых клеток требует взаимодействия с этими протеинами. Доказательства роли рецептора коллагена /VLA 2/ в таком взаимодействии представлено, например, Chan et al. /1990, 2, 1600 - 1602/, который клонировал VLA 2 позитивные опухолевые клетки, которые образовали гораздо более метастатические опухолевые колонии (Kramer and Marks /J. Bid. Chem. 1989, 264, 4684-4688), были способны блокировать присоединение клеток меланомы человек к коллагену за счет антитела к VLA 2. См также PA US 73234708-A" Моноклональные антитела против тромбоцитов, которые ингибируют реакцию тромбоцитов с коллагеном и используют для определения и лечения рака" US Dept. Helthah and Human Services. Ингибитор настоящего изобретения, будучи антагонистом рецептора коллагена, предотвращает взаимодействие опухолевых клеток с окружающей матрицей и, таким образом, ингибирует образование метастазов.

Его можно также использовать в качестве стандарта для определения эффективности новых ингибиторов, которые можно создать, например, модифицируя структуру настоящего ингибитора стандартным мутагенезом, направленным мутагенезом, например, делецией и/или вставками последовательностей и т.п. Ингибитор настоящего изобретения можно также использовать в качестве противотромботического агента в процедурах скрининга, в которых определяют эффективность различных соединений в качестве противотромботических, или в качестве стандарта для определения эффективности соединений, которые блокируют эффекты таких индуцируемых коллагеном агрегаций тромбоцитов, например, у пациентов, страдающих недостаточной свертываемостью крови.

Без дальнейших описаний, считается, что специалист, используя вышесказанное, может в полной степени использовать настоящее изобретение. Поэтому представленные далее предпочтительные варианты следует рассматривать исключительно как иллюстративные и никоим образом не лимитирующие настоящее изобретение.

Другие цели, особенности и соответствующие преимущества настоящего изобретения более полно раскрыты и станут более понятными при рассмотрении вкупе с прилагаемыми рисунками, в которых:

Фиг. 1 представляет зависимость от дозы ингибирования агрегации тромбоцитов человека слюной Triatoma;

Фиг. 2 представляет зависимость от дозы ингибирования агрегации тромбоцитов человека "Superose"-пулом слюны Triatoma;

Фиг. 3 представляет картину гель-фильтрации на "Superose 12".

Фиг. 4 представляет зависимость ингибирования агрегации от концентрации фибриногена;

Фиг. 5 представляет предотвращение индуцируемой колагеном агрегации тромбоцитов, предварительно обработанных аспирином;

Фиг. 6 демонстрирует отсутствие реакции ингибитора с коллагеном;

Фиг. 7 представляет протеолитическое переваривание ингибитора;

Фиг. 8 представляет стабильность ингибитора под действием коллагеназы;

Фиг. 9 представляет определение молекулярного веса ингибитора;

Фиг. 10 представляет очистку ингибитора до гомогенности;

Фиг. 11 представляет размеры PCR продуктов;

Фиг. 12a представляет ДНК последовательность субклонированного PCR продукта типа 1 и установленную последовательность аминокислот;

Фиг. 12b представляет ДНК последовательность субклонированного PCR продукта типа 2 и установленную аминокислотную последовательность.

Фиг. 12c представляет ДНК последовательность субклонированного PCR продукта типа 3 и установленную аминокислотную последовательность;

Фиг. 13a представляет полную ДНК последовательность клонированной кДНК ингибитора 1 и соответствующую аминокислотную последовательность;

Фиг. 13b представляет полную ДНК последовательность клонированной кДНК ингибитора 2 и соответствующую аминокислотную последовательность;

Фиг. 14 представляет экспрессию плазмиды, содержащей ДНК, кодирующей ингибитор;

Фиг. 15 представляет молекулярный вес зрелого рекомбинантного протеина, определенный антителами, специфически распознающими зрелый протеин;

Фиг. 16 представляет последовательность зрелого протеина ингибитора-1;

Фиг. 17 представляет последовательность зрелого протеина ингибитора-2;

Фиг. 18 представляет последовательность зрелого протеина ингибитора-3;

Фиг. 19 представляет ДНК кодирующей последовательности зрелого протеина ингибитора-1;

Фиг. 20 представляет ДНК кодирующей последовательности зрелого протеина ингибитора-2;

Фиг. 21 представляет ДНК кодирующей последовательности зрелого протеина ингибитора-3;

Фиг. 22 представляет ДНК кодирующей последовательности препротеина ингибитора-1;

Фиг. 23 представляет ДНК кодирующей последовательности препротеина ингибитора-2;

Фиг. 24 представляет ДНК кодирующей последовательности препротеина ингибитора-3;

Фиг. 25 представляет схему получения кДНК настоящего изобретения и

Фиг. 26 представляет N-терминальные аминокислоты протеина изобретения в последовательности Id N 10.

Список идентифицированных последовательностей:

Список последовательностей:

Последовательность 1: последовательность зрелого протеина ингибитора - 1.

Последовательность 2: последовательность зрелого протеина ингибитора - 2.

Последовательность 3: последовательность зрелого протеина ингибитора - 3.

Последовательность 4: ДНК кодирующая последовательность зрелого протеина ингибитора - 1.

Последовательность 5: ДНК кодирующая последовательность зрелого протеина ингибитора - 2.

Последовательность 6: ДНК кодирующая последовательность зрелого протеина ингибитора - 3.

Последовательность 7: ДНК кодирующая последовательность препротеина ингибитора - 1.

Последовательность 8: ДНК кодирующая последовательность препротеина ингибитора - 2.

Последовательность 9: ДНК кодирующая последовательность препротеина ингибитора - 3, и

Последовательность 10: Т-терминнальные аминокислоты зрелого протеина.

В предшествующих и последующих примерах все температуры даны без поправок в ^oЦельсия и, если нет других указаний, все части и проценты указаны по весу. Все полные раскрытия всех заявок, патентов и публикаций, цитированные ранее и далее, включены сюда по ссылке.

Пример 1. Активность протеина настоящего изобретения.

Агрегация тромбоцитов человека в присутствии коллагена ингибируется, если добавляют слюну Triatoma pallidipennis или очищенный протеин. Степень ингибирования коррелирует с концентрацией слюны протеина.

Насекомых стимулируют на выделение слюны на силиконизированные стеклянные пластины с механической стимуляцией. Выделившийся материал собирают, отсасывая силиконизированными пастеровскими пипетками. 500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы /300000 тромбоцитов/мкл/ инкубируют с различными количествами слюны /1,25 - 20 мкг протеина в 20 мкл/ или с различными количествами "Superose"-пула /0,5 - 10 мкг протеина в 200 мкл/ из примера 2 при 37^oC в агрегометре. Спустя 1 минуту, добавляют 1 мкг коллагена и контролируют возрастание пропускания света /агрегация/. См. фиг. 1 и 2.

Пример 2. Очистка протеина.

Важной стадией очистки протеина является использование гель-фильтрации на "Superose 12". 2 мл /5 мг протеина/ слюны обрабатывают на хроматографической колонке "Superose 12" HR 16/50 /Pharmacia/ в 10 мМ T /HCl, pH 7,4; 0,0001% "Pluronic F68". Затем ингибиторы элюируют 10 мМ Tris /HCl, pH 7,4; 0,0001% "Pluronic F68", 200 мМ NaCl. См. фиг. 3. Пул ингибитора содержит 25 мкг/мл протеина. 5 мкг протеина демонстрируют 70% ингибирования агрегации. Агрегация тромбоцитов без ингибитора определяется как 100% агрегации и 0% ингибирования. Остальные данные, соответственно, рассчитываются.

Пример 3. Ингибирование не зависит от фибриногена.

Активность ингибитора, представленного протеином настоящего изобретения, не зависит от концентрации добавляемого фибриногена, 500 мкг отфильтрованных на геле тромбоцитов объединяют с фибриногеном и 50 мкг слюны. После инкубирования в течение 1 мин при 37^oC добавляют 1 мкг коллагена и определяют агрегацию. Полученные значения представлены прямоугольниками 2 и 4 /со слюной/ и не демонстрируют заметной разницы, тогда как значения, представленные прямоугольниками 1 и 3 /без слюны/, коррелируют с концентрацией фибриногена. См. фиг. 4. Тест для определения механизма агрегации тромбоцитов, индуцированной протеинами изобретения (пример 4).

Для изучения механизма действия протеина настоящего изобретения некоторые стандартные соединения добавляют к тестовой системе, в которой в другом варианте присутствует или протеин изобретения, или буфер. Активность протеина изобретения заметно не изменяется при добавлении аспирина /прямоугольник 4/. Влияние соединений U46619 и PMA не меняется под действием протеина изобретения. Поэтому протеин изобретения не является антагонистом тромбоксана и, вероятно, не является ингибитором протеинкиназы C.

Прямоугольники 1 и 2: 500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы /300000 тромбоцитов/мкл/ инкубируют с протеином настоящего изобретения /прямоугольник 2/ /200 мкл пула "Superose"/ или с буфером /прямоугольник 1/ соответственно при 37^oC в течение 1 минуты. Затем добавляют 1 мкг коллагена и агрегацию контролируют агригометром.

Прямоугольники 3 и 4: 500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы инкубируют с 1 мМ аспирина в течение 20 минут при комнатной температуре. После этого добавляют протеин изобретения /прямоугольник 4/ или буфер /прямоугольник 3/. После инкубирования в течение 1 минуты при 37^oC добавляют 1 мкг коллагена, и определяют агрегацию.

Прямоугольники 5 и 6: 500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы инкубируют с протеином изобретения /прямоугольник 6/ или с буфером /прямоугольник 5/, соответственно, в течение 1 минуты при 37^oC. Затем добавляют U46619 /1 мкМ/ и определяют агрегацию.

Прямоугольники 7 и 8: 500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы инкубируют с протеином изобретения /прямоугольник 8/ или с буфером /7/, соответственно, при 37^oC в агрегометре. Спустя 1 минуту добавляют 10 нг PMA /форбол-12-миристат-13-ацетат/ и определяют агрегацию.

Полученные результаты представлены на фиг. 5.

Реакция высвобождения тромбоцитов /AТP измерения/ /пример 5/. Если присутствуют тромбоциты и коллаген, протеин изобретения может ингибировать активацию тромбоцитов. ATP используют в качестве индикатора активации. 500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы инкубируют с 200 мкл протеина изобретения /Суперозный или H₂O соответственно при 37^oC в течение 1 мин. Затем добавляют 1 мкг коллагена. Агрегацию контролируют в течение 10 минут. После этого 200 мкл суспензии объединяют с 250 мкл Hepes буфера pH 7,4, 100 мМ люциферина и 5 мкг/мл люциферазы. Затем измеряют люминесценцию.

Полное содержание АТР тромбоцитов определяют после лизиса тромбоцитов "Nomdet P40".

Пример 6. Ингибирование агрегации тромбоцитов, вызванной различными веществами.

Протеин изобретения специфичен для индуцируемой коллагеном агрегации тромбоцитов. 500 мкл отфильтрованных тромбоцитов /300000 тромбоцитов/мкл/ инкубируют с протеином изобретения в течение 1 мин при 37^oC. Затем индуцируют агрегацию коллагеном /2 мкг/мл/, тромбином /0,06 U/мл/ или ADP /1 10^-5 М/ соответственно, и измеряют агрегацию.

Пример 7. Ингибирование индуцируемой коллагеном агрегации.

Протеин настоящего изобретения не реагирует с коллагеном. Ингибирование индуцируемой коллагеном агрегации тромбоцитов в присутствии протеина можно нейтрализовать избытком дополнительно добавленного коллагена. Индуцируемую коллагеном агрегацию /2 мкг/мл/ для 500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы определяют следующими модификациями:

1: контроль, без ингибитора;

2: протеин изобретения /100 мкг слюны/ 10 минут предварительно инкубируют с тромбоцитами человека перед добавлением коллагена;

3: ингибитор /100 мкг слюны/ 10 минут предварительно инкубируют с коллагеном перед добавлением обогащенной тромбоцитами плазмы.

4, 5, 6: после измерения агрегации, 2, 5 и 10 мкг коллагена, соответственно, добавляют к пробе N 2, и снова измеряют агрегацию. См. фиг. 6.

Пример 8. Влияние ингибитора протеазы на ингибирующую активность.

Протеин изобретения не является протеазой. Ингибиторы протеазы /2 мМ PMSF, 2 мМ леупептина, 2 мМ апротенина/ или буферов инкубируют с течение 15 минут с "Суперозным" - пулом /200 мкл/. Обогащенную тромбоцитами плазму добавляют, и агрегацию стимулируют коллагеном /2 мкг/мл/

Ингибитор зависит от присутствия Mg²⁺ (пример 9).

Катионы Mg²⁺ повышают ингибирование агрегации тромбоцитов за счет протеина изобретения. Катион Ca²⁺ не оказывает существенного влияния на ингибирование агрегации тромбоцитов, 500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы объединяют с 2 мМ Mg²⁺ или Ca²⁺ и 40 мкг слюны или буфера. После инкубирования в течение 1 минут при 37^oC 1 мкг коллагена добавляют и измеряют агрегацию.

Добавки - Максимальная агрегация, %

--- - 77

Слюна - 33

2 мМ Mg₂₊ - 75

Слюна + 2 мМ Mg²⁺ - 19

2 мМ Ca²⁺ - 63

Слюна + 2 мМ Ca²⁺ - 39

Пример 10. Инкубирование тромбоцитов с протеином изобретения демонстрирует снижение адгезии к коллагену.

Если тромбоциты инкубируют с протеином изобретения, они частично теряют свою способность связывать коллаген. Пластины с 96 ячейками покрывают коллагеном /тип 1 при 40^oC в течение ночи/. 1 10⁷ тромбоцитов в ячейке инкубируют с различными количествами ингибитора, и 2 мМ Mg²⁺ в течение 20 мин при 37^oC при перемешивании. Их промывают PBS и прилипшие тромбоциты фиксируют 2,5% глутаральдегида в течение 2 ч при 37^oC. Затем тромбоциты удаляют из ячеек и считают под микроскопом.

Протеин^* - Число прилипших тромбоцитов на мм²

--- - 13500

10 мкл - 12000

50 мкл - 6500

^* Протеин = "Superose" - пул, концентрированный до 0,5 мг протеина/мл

Пример 11. Инкубирование ингибитора с трипсин-Сефарозой.

Протеин изобретения переваривают трипсином, связанным с Сефарозой. Переваривание протеина изобретения приводит к полной потере активности протеина изобретения. 200 мкг слюны объединяют с трипсином, связанным с Сефарозой или с буфером, или соответственно, с Сефарозой и трипсин-Сефарозой, объединенной с буфером. Все порции содержат 150 мМ NaCl для предотвращения неспецифической адсорбции на матрице. После инкубирования в течение ночи при комнатной температуре при перемешивании образцы центрифугируют и надосадочную жидкость добавляют к среде анализа на агрегацию /500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы, 1 мкг коллагена/. Протеолитическое переваривание контролируют на SDS-полиакриламидном геле. См. фиг. 7.

Пример 12. Инкубирование ингибитора с коллагеназа-Сефарозой.

Протеин изобретения не расщепляется коллагеназой. Коллагеназу /Clostridium Ristolyticum/ связывают с Сефарозой и используют в следующих порциях:

1. 100 мкл коллагеназа-Сефарозы + 60 мкл протеина изобретения + 140 мкл H₂O + 10 мкл буфера.

2. 100 мкл 150 мМ NaCl, 50 мМ Tris /HCl pH 7,4 + 60 мкл протеина изобретения + 140 мкл H₂O + 10 мкл буфера.

3. 100 мкл коллагеназа-Сефарозы + 200 мкл H₂O + 10 мкл буфера. В качестве контроля бычью сыворотку соединяют с Сефарозой и используют в следующих порциях:

4. 100 мкл BSA-Сефарозы + 60 мкл протеина изобретения + 140 мкл H₂O + 10 мкл буфера.

5. 100 мкл BSA-Сефарозы + 200 мкл H₂O + 10 мкл буфера.

протеин: "Superose" пул

буфер: 140 мМ Tris /HCl, pH 7,4, 100 мМ CaCl₂.

Порции центрифугируют и 200 мкл каждой из надосадочных жидкостей инкубируют с 500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы в течение 1 мин при 37^oC. Затем 1 мкг коллагена добавляют и определяют агрегацию. Активность коллагеназа-Сефарозы контролируют, инкубируя с коллагеном, и проводят электрофорез на SDS-полиакриламидном геле. См. фиг. 8.

Пример 13. Молекулярную массу определяют для ингибитора с помощью гель-фильтрации.

Очищенный протеин изобретения имеет молекулярный вес 20000 5000 Дальтон; определено на колонке Superose 12. "Superose"-пул из 2 мл слюны /см. пример 2/ обрабатывают хроматографически на "Superose 12" HR 16/50 колонке в Tris /HCl pH 7,4, 150 мМ NaCl, 0,0001% "P1 " F68. Альбумин бычьей сыворотки /Mb 67 кДа/, химитрипсиноген /Mb 25 кДа/, рибонуклеазу /Mb 14 кДа/ используют в качестве маркеров молекулярного веса. См. фиг. 9. Адгезия опухолевых клеток к коллагену снижается в присутствии протеина изобретения (пример 14).

Протеин изобретения ингибирует адгезию опухолевых клеток к коллагеновой матрице. Поэтому миграцию опухолевых клеток можно предотвратить частично или полностью от оседания в органах или кровеносных сосудах, если протеин настоящего изобретения находится в крови или плазме пациента. Клетки MT Zn 3 /опухолевые клетки молочной железы крыс/ метят ⁵¹Cr. Ячейки пластины покрывают коллагеном /тип III/ при 4^oC в течение ночи. Вначале 2 10⁴ меченых клеток в 500 мкл DMEM F12 среды, 20 мМ Heр, 1 мМ бикарбоната, 1% BSA инкубируют с 0, 2, 5 или 10 мкл протеина изобретения /"Superose" пул, 0,5 мг протеина /мл/ соответственно в течение 10 мин при 37^oC. Затем эту суспензию переносят на покрытые коллагеном ячейки и инкубируют в течение 12 часов при 37^oC. После этого ячейки промывают, а прилипшие клетки удаляют 1 М NaOH. Определяют радиоактивность прилипших клеток.

Количество добавленного ингибитора, мкл - Присоединение клеток /срм/

0 - 2215

2 - 2071

5 - 1608

10 - 1081

Пример 15. Очистка ингибитора до гомогенности.

Протеин изобретения выделяют по способу примера 2, очищают до гомогенности, используя систему высокоэффективного электрофореза-хроматографии.

Частично очищенный ингибитор вводят в систему высокоэффективного электрофореза-хроматографии /HPEC/ из Applied Biosystems, Inc./ Foster City, CA/. Электрофорез проводят на 7,5% полиакриламидном геле в буферной системе Tris /глицин в соответствии с инструкциями изготовителя. Образец буфера, содержащий SDS, но не восстанавливающий агент /например, ДТТ/ и аликвоты не нагревают до введения на гель. Протеин последовательно элюируют из геля, детектируют, измеряя абсорбцию при 230 нм, и фракционируют. Фракции, обладающие ингибирующей активностью, анализируют с помощью SDS-полиакриламидного гель-электрофореза /12,5% SDS-полиакриламидный гель, окрашенный Coomassie Biolliant Blue/. См. фиг. 10.

Пример 16. Анализ аминокислот.

Образцы протеинов выпаривают досуха и гидролизуют 6н. HCl, содержащей 2% фенола, в течение 24, 48 и 72 ч. Содержание цистеина определяют как цистеиновую кислоту после окисления пермуравьиной кислоты /Moore, J. Biol. Chem. 238, 235 - 27 /1963//. Содержание триптофана определяют после гидролиза в 4 н. N-метансульфокислоте в течение 24 часов /Simpson et al., J. Biol. Chem. 251, 1936 - 1940 /1976//. Затем образцы анализируют на аминокислотном анализаторе. Получены следующие результаты /данные приведены в % от полного количества аминокислот/: Gly = 8,3, Ala = 1,6, Ser = 8,9, Thr = 10,7, Val = 8,7, Leu = 6,6, Ile = 2,5, Pro = 4,5, Cys = 3,0, Met = 1,0, His = 2,3, Tyr = 4,3, Asp = 6,2, Glu = 7,2, Lys = 11,0, Arg = 1,8, Asn = 5,7, Gln = 2,3, Phe = 2,5 и Trp = 1,1.

Пример 17. Определение аминокислотных последовательностей

Протеин секвенируют на автоматическом аминокислотном секвенаторе Applied Biosystems, Inc. /IBI/ /Foster City, CA/ в соответствии с инструкцией изготовителя. Последовательность аминокислот 1- 20 /с N-конца/ представляет:



Пример 18. PCR-амплификация, субклонирование и ДНК секвенирование основных фрагментов трех форм ингибиторной кДНК из кДНК слюнных желез Friatoma pallidipennis.

Часть 1. Получение РНК слюнных желез Friatoma pallidipennis и синтез первой нити кДНК.

Начиная с полной очищенной РНК из слюнных желез, последовательности РНК транскрибируют обратной транскриптазой до получения первой нити кДНК. Для синтеза первой нити кДНК используют специальный олигонуклеотид в качестве затравки. Полную РНК выделяют из слюнных желез Friatoma pallidipennis способом, который включает растворение ткани в гуанидин-тиоцианате с последующим ультрацентрифугированием лизата в градиенте хлорида цезия /Sambrook, J, Fritsсh, E.T. Maniatis, T.: Molecular Cloning гл. 18 - 22, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989/. 10 мкг полной РНК слюнных желез, полученной таким образом, используют для синтеза первой нити комплементарной ДНК /кДНК/. Для этой цели используют обратную транскриптазу вируса мышиной лейкемии Moloney, соответствующий реакционный буфер деоксинуклеотиды и блок II РНазы, коммерчески доступной от "Ist Strand Synthesis kit" /Стратагене Клонинг Систем, La Yolla, Калифорния, США/ в соответствии с указаниями изготовителя. Олигодеоксинуклеотид, включенный в стадию отжига реакции примирования первой нити кДНК синтеза, не является нуклеотидом, включенным в "Ist Strand Synthesis kit", но является линкер-праймером /1,4 мкг/, взятым из коммерчески доступного набора "ZAP-CDNA^TM Synthesis kit" / Стратагене Клонинг Системз/. Его последовательность представлена далее /а Xh ol последовательность, распознающая реатрикционную эндонуклеазу, подчеркнута: см. также фиг. 25/.

Часть 2. PCR амплификация фрагментов кДНК ингибитора из кДНК первой нити слюнных желез.

Исходя из аминокислотной последовательности, которая определена расщеплением по Эдману очищенного протеина настоящего изобретения, разрабатывают и синтезируют три олигодеоксинуклеотида и один линкерный олигодеоксинуклеотид. На основании выбранных фрагментов аминокислотной последовательности, определенной для N-конца очищенного ингибитора /пример 17/, три дегенеративных олигодеоксинуклеотида разрабатывают и синтезируют для амплификации основной части кДНК ингибитора. Их последовательности следующие/"1" обозначает дезоксиинозин, две буквы в скобках, разделенные штрихом, указывают положение, куда встраивают два различных дезоксинуклеотида, причем соответствующая аминокислотная последовательность указывается трехбуквенным кодом под дезоксинуклеотидной последовательностью, последовательность, распознающая Sphl рестрикционную эндонуклеазу, подчеркнута/:







Эти олигодеоксинуклеотиды соответствуют частично перекрывающимся частям найденной в результате расщепления по Эдману аминокислотной последовательности. Олигодеоксинуклеотид N 3 содержит олигодеоксинуклеотид N 1 в начале, а олигодеоксинуклеотид N 2 в конце.

Дополнительный олигонуклеотид получают с последовательностью, полученной из линкер-праймера, использованного для затравки синтеза первой нити кДНК /см. часть 1/:

Олигонуклеотид N 4



После синтеза на ДНК синтезаторе Applied Biosystems PCR-Mate^TM 391 четыре деоксиолигонуклеотида очищают гель- фильтрацией на коммерчески доступных NaP-5 колонках /Pharmacia Biosystems/ и используют в качестве праймеров в трех отдельных полимеразных цепных реакциях PCR, патент США 4800159/ как описано далее. Реагенты получают из коммерческого набора "Cepe-Apm^TM DNA Amplification kit "c Amplitag^TM рекомбинантной Tag ДНК полимеразой от Perkin-Elmer Cetus /Norfalk, ст. США/, используют в соответствии с указаниями изготовителей. 5% /2,5 мкл/ от полного количества первой нити кДНК, синтезированной из полной РНК слюнных желез Friatoma /см. часть 1/, служит матрицей в каждой из трех реакций. Олигодеоксинуклеотидные праймеры объединяют следующим образом: олигодеоксинуклеотид N 1 и N 4 в PCR реакции N 1, олигодеоксинуклеотиды N 2 и N 4 в PCR реакции N 2, олигодеоксинуклеотиды N 3 и N 4 в PCP реакции N 3. Три PCR реакции инкубируют в Perkin-Elmer Cetus Thermal DNA Cycler, используя следующие программы реакций с 38 циклами, включающими стадии реакций N 1 - 3:

* начальная стадия: 3 мин при 94^oC

* программа реакции:

* стадия реакции N 1 : 1 мин 30 с при 94^oC;

* стадия реакции N 2 : 2 мин при 40^oC;

* стадия реакции N 3 : 3 мин при 72^oC;

/Последовательность стадии реакций N 1 - 3 повторяют 38 раз/

* Финальная стадия: 10 мин при 72^oC

5% /5 мкл полного реакционного объема разделяют электрофорезом на 1,5% агарозном геле, используя в качестве стандарта размеров лестничную ДНК из 123 пар оснований /Gibco-BPL Life Technоlogies, Jaithersburg, MD США/. После окрашивания геля этидиумбромидом, полосы однонитевой ДНК находят в каждой из трех PCR реакций, причем их кажущиеся размеры в соответствии со стандартной по размерам ДНК составляют приблизительно 530 - 560 пар оснований /фиг. 11 слева направо; лестница из 123 пар оснований, PCR реакции N 1, 2 и 3/.

Часть 3. Субклонирование и секвенирование фрагментов кДНК ингибитора.

ДНК-фрагмент, содержащийся в оставшемся объеме PCP реакции N 1 /см. часть 2/, выделяют после электрофореза на 1,5% агарозном геле и способе, включающем связывание и элюирование ДНК из NA-45 ДЕАЕ мембран /Schleicher and Schuell D-3354 Dassel Германия/ с последующей экстракцией н-бутанолом и осаждением этанолом /Sambrook, J.Fritsch, E.F., Maniatis, T." Molecular Cloning, гл. 6: 24-27, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989/. Концы выделенных ДНК фрагментов подготавливают для лигирования к вектору двойным перевариванием рестрикционными энзимами Sph 1 и Xhol /Boehringer Mannheim GmbH. Д-6800 Mannheim Германия/, а затем дважды экстрагируют смесью фенол/хлороформ /1: 1/ и затем дважды хлороформом. 3 мкг дНК плазмидного вектора pGEM^R-5 zf/ /Promega Madison, W 1, США/ линеаризируют за счет двойного переваривания, используя рестрикционные энзимы Sphl и SalI/ Boehringer Mannheim GmbH/, и затем разделяют и выделяют из 1,5% агарозного геля, как было указано ранее. Объединяют 50% расщепленного и экстрагированного амплифицированного ДНК фрагмента и 20% переваренной и очищенной на геле векторной ДНК, осаждают этанолом и лигируют, используя реагенты и протокол коммерческого набора "DNA Ligation Kit /Стратагене Клонинг Систем/. Полную реакцию лигирования используют для трансформации коммерчески доступных "Epicurian Coli^R XLI-Blue Supercompetent Cells /Стратагене Клонинг Системз/ в соответствии с инструкцией изготовителей. Реакцию полной трансформации ведут на B агаровых пластинах, содержащих ампициллин /100 мкг/мл/ 20 колоний клеток E. соli, устойчивых к ампицилину, находят после инкубирования и выращивают в LB бульоне, содержащем ампициллин /100 мкг/мл/, и их плазмидные ДНК выделяют с помощью процедуры щелочного лисиса "минипреп" Sambrook Fritseb, E.F., Maniates T.: Molecular Cloning, Chapter I, 25-28, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989/.

После двойного переваривания плазмидной ДНК из 20 клонов рестрикционными эндонуклеазами Sph I и Sac I /Boehringer Mannheim GmbH/ и электрофореза на 1,5% агарозном геле, оказывается, что 13 из них содержат ДНК вставку размера приблизительно 580 bp /"позитивные клоны"/. ДНК секвенирование производят на экстрагированных смесью фенол/хлороформ плазмидных ДНК 5 из этих положительных клонов, используя коммерческий набор "Seguenase^R Version 2,0 DNA Seguencing kit" /Юнайтед Стейт Биокемикал Корпорейшн, Кливленд. Огайо, США/ после примирования как T7, так и SP6 праймерами /Promega/. Полные последовательности вставок различных плазмид определяют следующим способом. Отдельную считывающую рамку можно идентифицировать в каждой из пяти последовательностей вставок. Три типа последовательностей вставок найдены относительно аминокислотных последовательностей, полученных из открытой считывающей рамки, причем три из секвенированных плазмидных клонов принадлежат к типу N 1; по одному для каждого из типов N 2 и 3 из полученных аминокислотных последовательностей. Полные последовательности ДНК вставок из каждых представляющих три типа плазмид N 1 - 3 изображены на фиг. 12 вместе с аминокислотными последовательностями, транслированными из открытой считывающей рамки. Последовательность первых 15 аминокислот, полученная из каждого типа плазмидных вставок, идентична последовательности определенной для положения аминокислот 6-20 N-конца ингибитора, выделенного из слюны Triatoma /Пример 17/.

Пример 19. Положение, выделение и клонирование гена, кодирующего ингибитор агрегации тромбоцитов

Геномную библиотеку, содержащую клонирование рестрикционные фрагменты из рестрикционных эндонуклеазных переваров T.pallidipennis ДНК, скринируют зондами на репликативных фильтрах в соответствии со стандартными способами. Клоны, которые гибридизуются с зондами, отбирают. Затем ДНК вставку из этих клонов субклонируют в соответствии со стандартными способами до тех пор, пока не выделяют минимального размера ДНК, которые связываются с этими зондами.

Эти фрагменты секвенируют, а затем переносят в подходящий эукариотный вектор экспрессии, встраивая кодирующий участок в вектор экспрессии за счет включения кодирующего участка в вектор экспрессии, содержащий все элементы, необходимые для экспрессии, например, промотерную последовательность, терминаторную последовательность и источник репликации, причем все они операбельно связаны с PAI геном /PAI = ингибитор агрегации тромбоцитов/, а также маркер селекции для выделения полученного таким образом вектора экспрессии. Вектор экспрессии трансформируют затем в эукариотного хозяина, для которого он сконструирован, и выделяют продукт EAI экспрессии.

Пример 20. Секвенирование гена, кодирующего ингибитор агрегации тромбоцитов /PAI/

Секвенирование однонитевых и двунитевых ДНК проводят, используя способ терминации дидеоксинуклеотидных цепей по способу Sanger et al., Proс. Natl. Aсad. Sci. США /1977//, 74, 5463 - 5467.

Скринирование геномных библиотек и клонов мутантов на предмет новых последовательностей, родственных последовательности T. pallidipennis /Пример 21/. Как и ранее, зонды, полученные из аминокислотных последовательностей ингибитора, выделенного из T. pallidipennis, используют для скринирования других геномных библиотек на предмет последовательностей, родственных с рассматриваемыми ингибиторами. Аналогично, библиотеки мутантных ингибиторов, полученные в результате обычного мутагенеза векторов, содержащих ген для T. pallidipennis ингибитора, полученных описанным ранее способом. NNMG и сайт-направленным мутагенезом скринируют по их активности.

Пример 22. Выделение, характеризация и секвенирование полных кДНК клонов для двух протеинов изобретения, как изоформ.

a/ Общий подход.

Библиотеку кДНК, полученную из полиА/+/РНК, экстрагированных из T.pallidipennis скринируют двумя зондами примера 18 на репликативном фильтре стандартными способами. Положительные клоны очищают раздельным культивированием и повтором гибридизации бляшек на фильтре. кДНК самых длинных кДНК клонов секвенируют дидеоксинуклеотидным способом Сангера.

b/ Подробное описание анализов.

Часть 1. Конструирование библиотеки кДНК из РНК слюнных желез Triatoma pallidipennis.

Примерно 500 мкг полных РНК, выделенных из слюнных желез Triatoma pallidipennis? как указано ранее /Пример 18, часть 1/, используют для выделения полиА+мРНК с помощью двойной афинной хроматографии на олиго/d T/-целлюлозе/. Для этой цели используют набор "mRNA Purification Ket"/Pharmacia Biosystems. GmbH, W - 7800 Фрайбург, Германия /для двух последовательных циклов обогащения, как указано в инструкции изготовления. Окончательный выход после второй стадии очистки составляет 13 мкг полиА+мРНК. 5 мкг этого препарата используют для конструирования кДНК библиотеки в "Lambda ZAP II" векторе бактериофага с реагентами и процедурами коммерческого набора "ZAP-cDNA^TM - Gigapack II Gold Cloning Kit" /Стратагене Клонинг Системз/. 33% окончательного выхода первой фракции кДНК после фракционирования по размерам лигируют 2 мкг векторной ДНК бактериофага. После упаковки полной реакции лигирования в 7 отдельных аликвот получают неамплифицированную кДНК библиотеку с 2010⁶ независимыми рекомбинантными фагами.

Часть 2. Выделение клонов кДНК ингибитора из кДНК библиотеки слюнных желез Triatoma pallidipennis.

Всего 510⁵ рекомбинантных фагов из кДНК библиотеки, описанной ранее /1/, скринируют с помощью ДНК-ДНК гибридизации двойных бляшек на найлоновых мембранах Biogene A /Pall Biosupport, East Hills, NY, США/. Гибридизацию ведут в растворе, содержащем 5хSSC, 5 x раствор Denhardt, 0,2% SDS и 100 мкг/мл ДНК спермы лосося денатурированной, экстрагированной фенолом и обработанной ультразвуком /Сигма Кемикал Компани, Сан Луи, МО, США/ с радиомеченными ДНК зондами, полученными как указано ранее. Вставки ДНК плазмидного клона типа N 1 из примера 18 выделяют после двойного переваривания, используя рестрикционные эндонуклеазы SphI и SacI, как указано ранее. Приблизительно 25 нг выделенных вставок ДНК радиометят, используя набор "Prime-IT^TM Random Primer Labeling Kit" /Стратагене Клонинг Системз/ в присутствии /³² P/ d CTP /3000 Кюри/ммоль; Amersham Buchler, W-3300 Германия/. Меченый фрагмент ДНК выделяют из остального радиоактивного вещества хроматографически на колонке N AP^TM-5"" /Фармациа Биосистемз/. Температура на фильтре гибридизации и у промывок 50^oC, последняя стадия промывки проходит в 2SSC 0,2% SDS. После авторадиографии при -70^oC в течение 48 ч обнаруживают более 300 бляшек, которые дают сигналы на обоих фильтрах. Бактериофаги с 80 участков вокруг таких положительных сигналов элюируют с исходно-перекрывающихся пластин и повторно культивируют отдельно при плотности, которая позволяет осуществить очистку отдельных фаговых клонов. Процедуру гибридизации бляшек, описанную ранее, повторяют, используя тот же зонд ДНК, и с пластин выделяют 76 независимых фаговых клонов, дающих положительные сигналы.

Часть 3. Характеризация и секвенирование клонов кДНК ингибитора

Фаговые клоны отдельно подвергают ин виво иссеканию по способу, описанному в протоколе набора для конструирования кДНК библиотеки Стратагене, описанной ранее. "Минипреп" плазмидную ДНК из 76 различных плазмидных клонов pAluescript SR, выделенную после ин виво иссечения, расщепляют в двойном переваривании рестрикционными эндонуклеазами EcoRI и XboI (Bochringer Maunheim), разделенными на 1,5% агарозном геле и окрашивают этидиумбромидом. Несколько вставок различных размеров вплоть до около 620 пар оснований получают в результате. ДНК секвенирование Т3 и Т7 праймерами /Стратагене Клонинг Системз/ проводят как описано ранее на плазмидных ДНК из 8 клонов, которые, как обнаружено, содержат самые большие ДНК вставки из всех 76 исследованных независимых клонов. Таким образом были обнаружены кДНК клоны, которые принадлежат к 2 классам в соответствии с аминокислотной последовательностью, транслированной из открытой считывающей рамки, причем один класс соответствует точно типу N 1 плазмидной вставки/ клонов, именуемых "ингибитор-1", описанных в примере 18/3/, и другой класс к типу N 2 плазмидных вставок /2 клона, именуемые "ингибитор-2"/. Далее эксперименты по ДНК секвенированию проводят для подтверждения установленных к этому моменту последовательностей, используя дополнительные олигодеоксинуклеотидные основания известных последовательностей:

Олигонуклеотид N 5:

5"-TATCACTCTGAACTCAAAGTG-3".

Олигонуклеотид N 6:

5"-TTACCGCCGTTTCCATTTGG-3".

Олигонуклеотид N 7;

5"-TTACTTCAAAGTTGCACC-3";

Олигонуклеотид N 8:

5"-GCAACATGAAGGTGATCATTGCAGCAAC-3",

5"-концы большинства из самых длинных независимых клонов, как было обнаружено, были идентичны, причем 5"-нетранслированный участок из 5 пар оснований, дают возможность предположить, что кДНК полных мРНК транскриптов, включающих участки инициирования транскрипции, были клонированы. Полные ДНК и полученные аминокислотные последовательности кДНК клонов для ингибитора 1- и инигибитора-2- изображены на фиг. 13. Сайт расщепления между сигнальным пептидом и зрелым протеином, полученный из N-терминальной аминокислотной последовательности, описан в примере 17.

Пример 23. Экспрессия и секретирование рекомбинантного ингибитора в стабильно трансфектированные клетки почек детеныша хомяка /ВНК/.

a/ Общий подход.

Затем кодирующую последовательность из кДНК клонов переносят в стабильный эукариотный вектор экспрессии, включая кодирующий участок в вектор экспрессии, содержащий все элементы, необходимые для экспрессии, например, промоторную последовательность, терминаторную последовательность и источник репликации, причем все они операбельно связаны с PAI геном, а также с маркером селекции для выделения получаемого таким образом вектора экспрессии. Затем вектор экспрессии трансформируют в эукариотного хозяина, для которого он сконструирован, а PAI продукт экспрессии выделяют.

b/ Конкретное описание анализов.

Часть 1. Конструирование плазмид экспрессии для ингибитора, используя pMPS V/CMV вектор.

Два олигодеоксинуклеотида синтезированы для PCR амплификации кодирующих ингибитор последовательностей как из ингибитора-1, так и ингибитора-2 плазмидных кДНК клонов. Один из них /N 9/ создают из кодирующей нити участка вокруг ATG кодона инициирования, удлиненного 5"-концом, включая Hind III распознающую последовательность и оптимизированный "Kozak Site" /x/ Kozak, M: Точечные мутации определяют последовательность, ограничивающую AG кодон инициирования, который модулирует трансляцию эукариотными рибосомами. Cell. 44, 283-292, 1986/, тогда как другой /N 10/ получают из некодирующей нити участка вокруг TAA кодона терминации открытых считывающих рамок, удлиненных 5"-хвостом, включая Hind III - распознающую последовательность /распознающие последовательности рестрикционной эндонуклеазы Hind III подчеркнуты, оптимизованный "Kozak Site" или эффективной инициации трансляции указан звездочками, участки последовательностей, совместимые с одной или другой нитью исходных последовательностей кДНК клонов, отмечены курсивом/





Используя примерно 3 мкг каждой кДНК клонированной плазмиды в качестве матрицы, проводят две отдельные PCR амплификации в присутствии двух олигонуклеотидных праймеров N 9 и 10, как указано ранее /пример 18 часть 2/, однако с 18 вместо 38 циклами, включая N 1 - 3. Амплифицированные кодирующие последовательности ингибитора-1 и ингибитора-2, которые содержат оптимизированный сайт Kozак, но не содержат полного сигнала полиаденилирования /"... . AATAAA... -3"/, находящегося сразу после 3"-терминационного кодона, исходных кДНК клонов, а затем выделяют и делают пригодным для лигирования за счет переваривания рестрикционной эндонуклеазой Hind III/ Boehringer Mannheim/ и последующих стадий экстракции, как указано ранее /пример 18, часть 3/. 3 мкг плазмидной ДНК вектора pMP SV/CMV - HE/ With, M., Schumacher. L., Hauser, H.: Конструирование новых векторов экспрессии для клеток млекопитающих, используя немедленный ранний энхансер цитомегаловируса человека для повышения экспрессии из гетерологических энхансеров/ промотеров. B Conradt, H./ Eo/ Protein Glycosylation: Cellular, Biotechnical and Analytical Aspects, t. 15, 49-52, VCH publishers Weinhein 1991; Kratzschmar, J., Haendler, B., Bringmann, P. , Dinter, H., Hess, H., Donner, P., Schleuning W-D.: Секреция с высоким уровнем четырех плазминогенных активаторов из обыкновенных вампиров Desmodus rotundus стабильно трансфектированными клетками почек детенышей хомяков, Gene /1992/ 116, 281-284 линеаризуют за счет переваривания рестрикционной эндонуклеазой Hind III и выделяют описанным ранее способом. Выделенные плазмидные ДНК дефосфолируют, используя 1 единицу щелочной фосфатазы кишечника теленка/ Boehringer Mannheim/, экстрагируя, а затем используя для субклонирования кодирующих ингибитор фрагментов PCR по способу примера 18, часть 3.

ДНК полученной pMPSV/CM - ингибитор -1 или -2 конструкции, содержащей Hind III вставки, переваривают рестрикционной эндонуклеазой EcoR1/Boehringer Mannheim/ и примерно в половине случаев, EoRI рестрикционный фрагмент около 580 пар оснований обнаруживают, что указывает на то, что в этих конструкциях кодирующая ингибитор вставка находится в правильной ориентации по отношению к промотору вируса Миелопролиферативной саркомы вектора pMPSV/CMV. Полные кодирующие ингибиторы вставки таких pMPSV/CMV - ингибитор - и -2 конструкций затем секвенируют, используя олигодеоксинуклеотиды N 5 - 8, и два дополнительных праймера /олигодеоксинуклеотиды N 12 и 11/, получают из расположенных по краям вставки участков вектора экспрессии для контроля за мутациями, которые могли произойти во время PCR амплификации:

Олигонуклеотид N 11:

5"-ACCAGAAAGTTAACTGG-3",

Олигонуклеотид N 12:

5"-CCTAGTTTGTGGTTGTCC-3".

Таким образом получают две конструкции для экспрессии ингибитора-1- и ингибитора-2- в клетки млекопитающих, кодирующие протеины, идентичные по своей аминокислотной последовательности протеинам, изображенным на фиг. 13. Схематическая карта конструкции приведена на фиг. 14/ "Амр": устойчивый к ампициллину маркер; "MPSV" промотер": промотер вируса миелопролиферативной саркомы, "SY" : SV40 интрон, включающий границу сплайсинга, "peby A region" : SV 40 участок полиаденилирования, "CMV enhancer": энхансер цитомегаловируса, "ori" : pBR 322 источник репликации/.

Часть 2. Трансфекция и селекция BHK клеток.

Плазмидные ДНК двух pMPSV/CMV - ингибитор-1 и -2 конструкций выделяют, используя колонки "Qiagen=lip 100"/ Qiagen Inc. Chatworth, Калифорния, США/ Аналогично, две плазмиды, которые содержит маркерные гены устойчивости, один для гидромицин B киназы /pSR/ HMR272, сконструированный за счет субклонирования BamHI-Hind III фрагмента, содержащего HSVtk промотер, связанный с геном гигромицин B киназы в Bluescript Sk, причем фрагмент этот взят из pPMP272 вектора, описанного: Bernard, H. U., Krammer. J., Rowekamp. W.G. Конструирование гена слияния, который придает устойчивость против гигромицина B клеткам млекопитающих в культуре, Experimental Cell Research, 158, 237-243, 1985/, а другой для пуромицин- N-ацетилтрансферазы/ pSV pacАp; DeLaLuna, S., Soria. J., Pulido, D., Ortin. J., Jimenez. A.: Эффективная трансформация клеток млекопитающих конструкциями, которые содержат маркер устойчивости к пуромицину, Gene 62, 121-126, 1988/, получают в результате. Приблизительно 20 мкг конструкции экспрессии ингибитора-1- или -2,6 мкг пуромицин-устойчивой плазмиды и 2 мкг гигромицин-устойчивой плазмиды используют для трансфекции клеток почки детеныша хомяка /BHK/ как описано у Kratzsсhmar. J. , Haеndler, B. , Bringmann,P., Dinter, H., Hess, H., Douner. P., Schleuning, W. -D. 1992. Высокоэффективное секретирование четырех слюнных плазминогенных активаторов из вампиров Desmodus rotundus за счет стабильно-трансфектированных клеток почки детеныша хомяка /Gene, 116 - 281-284/, используя "Lipofectin ^TM Reagent" /Gibco-BRL Life Technologies/. Процедуру двойной селекции используют, используя DMEM /10% FCS/Gibco BRL Life Technologies/, содержащей 0,7 мг/мл гигромицина B/ Calbiochem Corporation, La Golla Калифорния, США/ и 5 мкг/мл пуромицина /Сигма Кемикал Компани/. Смесь клеток BHK, обладающих двойной устойчивостью трансфектированных pMPSV/CMV - ингибитор-1 или -2, полученных после двух недель селекции, выращивают в несодержащей сыворотке OPTI-MEM /Gibco-BRL Life Technologies /как описано Kratschmar, J. , Haendler, B. , Bringmann, P., Dinter, H, Hess, H., Douner, P., Schleuning W-D. : Высокоэффективное секретирование четырех слюнных плазминногенных активаторов из вампиров Desmodus rotundus за счет стабильно трансфектированных клеток почек детеныша хомяка. Gene /1992/ 116, 281-284/. Кондиционную среду собирают спустя 24 ч, освобождают от клеточного дебриса центрифугированием при 2000 g и хранят в замороженном виде.

Часть 3. Определение рекомбинантного ингибитора в надосадочных жидкостях культуры клеток BHK.

Аликвоты кондиционной среды тестируют по продуцированию ингибитора в Вестерн-блоттинге /см. пример 24/. Антиингибиторная антисыворотка реагирует специфически с 19 кДА протеином, присутствующим в кондиционной среде из pMPSV/CMV- ингибитор-1 трансфектированных BHK клеток из pMPSV/CMV - ингибитор-2- трансфектированных BHK клеток. Не наблюдается реакция с контрольной средой из клеток, трансфектированных pMPSV/CMV конструкцией, содержащей ингибиторную вставку, или со свежей контрольной средой /см. фиг. 15/. Экстракты трансфектированных клеток дают лишь слабый сигнал, указывающий на то, что рекомбинатные протеины секретируются в среду. Помимо иммунологического детектирования двух рекомбинантных ингибиторных форм, надосадочные жидкости трансфектированных BHK клеток также можно тестировать в функциональном анализе. Ингибирование индуцируемых коллагеном агрегации тромбоцитов можно измерять в агрегационном анализе по способу примера 1.

Пример 24. Получение антител.

Около 100 мкг ингибитора, очищенного по способам примеров 2 и 15, добавляют к 0,5 мл полного адъюванта фреунда, и полученную эмульсию вводят подкожно кролику. Спустя 2 недели вводят вторую инъекцию около 80 мкг очищенного ингибитора и 0,5 мл неполного адъюванта Фрейнда. После инъекции отбирают несколько образцов сыворотки для проверки продуцирования антител. Их анализируют Вестерн-блоттингом. 20 нг очищенного ингибитора наносят на 12,5% SDS акриламидный гель, и проводят электрофорез, блоттинг и детектирование стандартными способами, описанными Harlowe, D., Lane /1988/ Антитела: лабораторное руководство, Cold Spring Harbour Laboratory /разбавление тестовой сыворотки 1: 500, козлиная анти-кролик пероксидазный конъюгированный IgG в качестве второго антитела, детектирование ECL-набором от Amersham International, Amersham Великобр. Блоттинг показывает, что антисыворотка специфически реагирует с очищенным ингибитором.