способ получения биомассы рекомбинантного штамма бактерий escherichia coli, обогащенной полипептидом со свойствами лимфотоксина человека

Формула изобретения

Способ получения биомассы рекомбинатного штамма бактерий Escherichia coli, обогащенной полипептидом со свойствами лимфотоксина человека, включающий трансформацию компетентных клеток Escherichia coli SG 200 - 50 плазмидой pLT21, высев на селективную среду, содержащую ампициллин, получение инокулята, ферментацию и сбор биомассы, отличающийся тем, что для получения инокулята производится предварительный отбор высокопродуктивных клеток-трансформантов и амплификация плазмидной ДНК при подращивании клеток на селективной среде, содержащей дополнительно 150 мкг/мл хлорам феникола, а сбор биомассы проводят в конце логарифмической фазы роста культуры.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и представляет собой способ получения биомассы рекомбинантного штамма E. coli, содержащего плазмидную ДНК, кодирующую биосинтез полипептида со свойствами лимфотоксина человека. Полученная биомасса может быть использована для выделения из нее и очистки лимфотоксина с целью детального исследования его свойств и применения в медицинской практике.

В организме человека лимфотоксин (ЛТ, он же фактор некроза опухолей-бета, ФНО-бета) продуцируется главным образом активированными T-лимфоцитами. Лимфотоксин, как природный (гликозилированный), так и рекомбинантный (негликозилированный), обнаруживает широкий спектр противоопухолевой активности и существенно ингибирует рост твердых опухолей человека [1]. В ряде случаев его действие эффективнее, чем у ФНО-альфа [2]. Как и фактор некроза опухолей альфа, лимфотоксин является иммуномодулятором широкого спектра действия. Кроме того, лимфотоксин имеет противовирусное действие [3 - 5]. Все это делает перспективным применением лимфотоксина в медицине. Для глубокого исследования свойств лимфотоксина, его биологических и медицинских испытаний требуется значительное количество препарата.

Известен способ получения ЛТ из активированной лимфобластоидной линии клеток человека RPM1-1788 [6]. Недостатки способа: сложные, трудоемкие методы культивирования клеточной линии. Низкое содержание целевого продукта (около 3 мкг ЛТ на 1 л культуры).

Известны способы получения ЛТ микробиологическим синтезом с использованием рекомбинантных плазмид. Один из способов основан на использовании штамма E. coli HB 101, трансформированного плазмидой pCG 402, содержащей ген ФНО - под контролем триптофанового промотора [7]. Согласно этому способу клетки выращивают на глюкозосолевой среде с добавлением казаминовых кислот, тиамина, триптофана и ампициллина. Для экспрессии гена ФНО - проводят индукцию индолакриловой кислотой с заменой среды. Недостатки способа следующие: использование на стадии культивирования дефицитных добавок (тиамин и др. ), индуктора для экспрессии целевого гена, замены среды на несодержащую триптофан. При очистке ЛТ из полученной биомассы удается извлечь не более 10 - 12% целевого полипептида от суммарного клеточного белка (около 5 мг из 1 г клеток на стадии получения клеточного экстракта).

Известен способ получения биосмассы для очистки из нее ЛТ., основанный на использовании штамма E. coli M15, трансформированного плазмидой pDS78/RBS11, кодирующей целевой белок [8]. Клетки выращивают стандартным способом. Для экспрессии гена проводят индукцию лактозного оперона изопропил-1-тио -- D-галактопиранозидом. Недостатки способа: использование штамма E. coli M-15, требующего индукции лактозного оперона и содержащего протеазы различных типов, способные инактивировать ЛТ в процессе его дальнейшей очистки, а также низкое содержание ЛТ в биомассе (на конечном этапе авторы получают 0,17 мг препарата из 1 г клеток или около 1 мг из 1 г клеток на стадии получения клеточного экстракта).

Наиболее близким (прототипом) к заявляемому способу является способ получения биомассы рекомбинантного штамма E. coli SG 200-50/pLT 21, описанный в патенте РФ N 2048521 [9]. Способ основан на использовании штамма E. coli SG 200-50, трансформированного плазмидой pLT 21, обуславливающей биосинтез ФНО-бета. Клоны клеток первичных трансформантов получают кальциевым способом [10] и затем их используют для получения биомассы, которую выращивают стандартным способом в L-бульоне в присутствии ампициллина; клетки собирают центрифугированием. К основным недостаткам способа следует отнести крайнюю нестабильность процесса получения биомассы (содержание ЛТ колеблется от 0,5% до 10% от суммарного клеточного белка) и относительно низкое содержание целевого полипептида в биомассе (от 0,26 и до 5 мг на стадии получения грубого экстракта клеток).

Технической задачей предлагаемого изобретения является стабилизация процесса биосинтеза ЛТ и повышение его процентного содержания в биомассе.

Задача решается путем использования отбора высокопродуктивных клонов клеток-трансформантов для получения инокулята биомассы, в процессе получения инокулята проводится амплификация плазмидной ДНК путем подращивания трансформированных клеток на плотной среде, содержащей хлорамфеникол, а сбор биомассы проводится в конце логарифмической фазы роста культуры (но не в стационарной, как в способе-прототипе).

Сущность предлагаемого способа получения биомассы рекомбинантного штамма E. coli, обогащенного полипептидом, со свойствами ЛТ человека представлена на следующей схеме, которая приведена в конце описания.

Сравнительный анализ культуры E. coli SG 200-50 на содержание плазмидной ДНК pLT 21 и целевого белка лимфотоксина в процессе культивирования представлены в табл. 1.

Из таблицы видно, что при использовании предлагаемого способа содержание целевого белка в биомассе повышается в 2 - 2,5 раза (аналогично и плазмидной ДНК в 1,5 - 2,0 раза) по сравнению со способом-прототипом.

Новыми по сравнению со способом-прототипом признаками являются:

1 - первоначальный отбор высокопродуктивных клонов клеток-трансформантов для получения инокулята;

2 - проведение амплификации плазмидной ДНК на плотных средах, содержащих хлорамфеникол в процессе получения инокулята;

3 - сбор биомассы, когда культура находится в конце логарифмической фазы роста (но не в стационарной).

Совокупность указанных признаков позволяет получать биомассу с повышенным содержанием целевого продукта (в среднем в 2,0 - 2,5 раза) и стабилизировать процесс биосинтеза ЛТ при культивировании. Специфическая активность получаемого препарата как в способе-прототипе, так и в предлагаемом одинакова и составляет не менее 310⁷ ед/мг белка (по цитолитическому действию на клетки мышиных фибробластов линии L 929 в присутствии актиномицина).

Ниже следует примеры конкретного выполнения способа получения биомассы рекомбинантного штамма E. coli, обогащенной полипептидом со свойствами лимфотоксина человека.

Пример 1. Получение трансформированных клеток и отбор высокопродуктивных клонов.

Трансформацию компетентных клеток E. coli SG 200-50 плазмидной ДНК pLT 21 проводят кальциевым способом, как описано ранее [10]. После проведения трансформации полученную суспензию клеток высевают на питательный агар, содержащий ампициллин в концентрации 50 мкг/мл и подращивают в течение 18 - 20 ч при 32^oC. Выросшие отдельные клоны трансформированных клеток отбирают уколом и рассевают на свежий питательный агар, также содержащий ампициллин. Клетки из подросших клонов (18 - 20 ч при 32^oC) отбирают и суспендируют в 100 мкл буфера и анализируют при помощи гель-электрофореза в 13,5%-ном полиакриламидном геле в присутствии 0,1% SDS [11]. Типичная картина по процентному содержанию ЛТ в отдельных клонах представлена в табл. 2.

Как видно из таблицы, процентное содержание целевого продукта в разных клонах значительно варьируется (от 5 до 15%).

Для дальнейшей работы клоны с наибольшим содержанием целевого продукта (в данном случае клон N 4).

Пример 2. Проведение амплификации плазмидной ДНК при выращивании клеток на плотных средах, содержащих хлорамфеникол в процессе получения инокулята.

Отобранные на предыдущей стадии высокопродуктивные клоны суспендируют в 1 - 3 мл L-бульона и вновь рассевают газоном на агаризованную среду, содержащую ампициллин (50 мкг/мл) и хлорамфеникол (150 мкг/мл); инкубируют в течение 18 - 20 ч при 32^oC.

Пример 3. Ферментация.

Ферментацию проводят в качалочных колбах с объемом среды 250 мл в течение 8 - 9 ч при температуре 32^oC и скорости вращения качалки 150 - 160 об/мин. Для засева используют бактериальную суспензию, полученную смывом колоний, выросших на чашках с хлорамфениколом. Инокулят вносят в количестве 2 - 3% (об/об) от засеваемого объема среды. Содержание ампициллина в среде для ферментации составляет 50 мкг/мл. По окончании ферментации культуральную жидкость быстро охлаждают до 5 - 10^oC, клетки собирают центрифугированием и хранят при температуре - 20^oC.

Анализ биомасс, полученных на различных стадиях ферментации, по процентному содержанию ЛТ представлен в табл. 3.

Из таблицы видно, что наибольшее содержание лимфотоксина в процессе ферментации в клетках наблюдается в конце логарифмической фазы роста культуры и резко снижается в поздней логарифмической фазе.

Таким образом, предлагаемый способ получения биомассы позволяет стабилизировать процесс биосинтеза лимфотоксина при культивировании рекомбинантного штамма E.coli SG 200-50/pLT21 и повысить содержание целевого белка в клетках (в биомассе) в среднем в 2-2,5 раза (до 5-8 мг/г клеток вместо 0,5-4,5) по сравнению со способом-прототипом. Предлагаемый способ не предусматривает использования дефицитных добавок при культивировании и индукции биосинтеза целевого белка.

ЛИТЕРАТУРА

1. Fisher Н. , Dohlsten М., Anderson W. et al.//J. lmmunol. -1990. -v. 144, N 12.-P. 4663-4669.

2. Lui S.K., Jakowatz J. G., Pollack R.B. et al.// Lymphokine Cytokine Res. - 1991. -v. 10, N 3.-p. 189-194.

3. Wong G.H.W. and Goeddel D.V. // Nature. - 1986. - v. 323, N 6091. - p. 819-822.

4. Mestan J., Digel W., Mittnacht S. et al. // Nature. -1986. - v. 323, N 6091. - p. 816-819.

5. Paul N. L. and Ruddle N.H. // Ann. Rev. Immunol. - 1988. -v. 6 - p. 407-438.

6. Agarwal В.В., Moffat В. and Harkins R.N. // J. of Biol. Chem.- 1984. - v. 259, N 1. - p. 686-691.

7. Seow H.-F., Goh C.R., Kristman L., Porter A. Biotechnology. - 1989. -v. 7, N 4.-p. 363-368.

8. Schoenfeld H.-J., Poesche D., Frey J.R. et al. // J. of Biol. Chem. - 1991, - v. 266, N 6. -p. 3863-3869.

9. Патент РФ N 2048521, кл. C 12 P 21/00, 1992 г.

10. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. // Молекулярное клонирование. - М. : Мир - 1984.

11. Laemmli U.K. // Nature - 1970, - v. 277. - p. 680-685.