композиция, оптимизирующая жизнедеятельность клеток и клеточных систем организма в неблагоприятных условиях

Формула изобретения

Композиция на основе смесей биологически активных веществ со служебными добавками, содержащая в качестве биологически активных веществ смесь натриевых солей тримера, тетрамера и пентамера (п-диокси-o-фенилен)-тиосерной кислоты при следующем соотношении ингредиентов в смеси, мол.%:

Тример - 3 - 45

Тетрамер - 1 - 25

Пентамер - 2 - 35

Служебные добавки - До 100,

оптимизирующая жизнедеятельность клеток и клеточных систем в неблагоприятных условиях.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биохимии, в частности к веществам, оказывающим защитное или нормализующее воздействие на клетки и клеточные системы в условиях действия неблагоприятных факторов окружающей среды или патологии развития организма, и может быть использовано в промышленной биотехнологии, медицине, ветеринарии и других смежных областях.

Известно использование для защиты клеточных систем от негативных факторов внешней среды различных фармацевтических препаратов, таких как цитокины, в частности, интерферон, гормоны, антибиотики и т.д. (М.Д. Машковский, Лекарственные средства, т.1-2, М., Медицина, 1985, 1999 с.)

Недостатками большинства препаратов является специальность защитного действия, т.е. ограниченная область применения, например для защиты от вирусного поражения, радиационного поражения, гипоксии, стресса, связанного с обезвоживанием клетки.

Одними из наиболее эффективных препаратов подобного типа являются ионол (2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол) (В.Е. Коган и др. Сб. "Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии", М., Наука, 1982, с.50-59) и убихинон (коэнзим Q), обладающие широким спектром воздействия на клетки в связи с возможностью воздействия на системы дыхания клеток (Г.И. Андреева, Микробиология, N 6, 1979, с.48). Недостатками указанных препаратов являются ограниченный спектр воздействия на клетки, обусловленный, в частности, относительно большими размерами молекул активного начала, что вследствиe стерических и иных затруднений не позволяет эффективно влиять на многие процессы, проходящие в организме, а также их высокая себестоимость.

В качестве неспецифических адаптагенов, обладающих широким спектром воздействия на клетки и клеточные системы наиболее широко применяются препараты, представляющие собой поликомпонентную смесь, в частности, получаемые из природного сырья, например экстракты женьшеня, элеутерококка, облепихи, котовника, мумие, прополиса (В.И. Машанов, А.А. Покровский, Пряно-ароматические растения, М. , Агропромиздат, 1991; И.С Соколова и др. Дикорастущие и культурные растения, М., Медицина, 1990).

Влияние таких смесей обычно полифункционально, т.е. воздействие осуществляется одновременно на ряд элементов, определяющих жизнедеятельность клетки, причем в ходе этого воздействия, как правило, наблюдается синергетическое взаимовлияние компонентов смеси и происходящих в клетках процессов, что расширяет спектр воздействия такого препарата.

Недостатком указанных препаратов является ограниченность природных ресурсов, нестандартность сырья, наличие побочных эффектов.

Прототипом заявляемого изобретения является композиция на основе набора синтетических полипептидов различной длины, применяемого, как правило, в виде раствора или смеси с компонентами, решающими вспомогательные задачи. Использование такой композиции позволяет воздействовать на различные звенья иммунного ответа (пат. Франции N 2570278, кл. A 61 K 39/41).

Недостатком композиции является относительно узкий спектр действия, наличие побочных эффектов, высокая стоимость синтеза.

Задачей, стоящей перед авторами, являлось создание композиции, способной оказывать защитно-адаптационное воздействиe на более широкий спектр процессов, протекающих в клетке, за счет использования смесей биологически активных компонентов с различным молекулярным весом.

Указанная задача решалась созданием композиции на основе смеси натриевых солей тримера, тетрамера и пентамера (п-диокси-о-фенилен)-тиосерной кислоты (солей ФТК) с добавками служебного (вспомогательного) характера при следующем соотношении ингредиентов в смеси (мол.%):

Тример - 3-45,

Тетрамер - 1-25,

Пентамер - 2-35,

Служебные добавки - До 100%

В качестве служебных добавок могут быть использованы, в частности, различного рода наполнители, в частности, крахмал, декстран, растворители: вода, эфир, этанол и т.д., а также ароматизаторы и т.п. вещества, выполняющие при использовании композиции в практике вспомогательные функции. Конкретный выбор добавок определяется исходя из особенностей патологического фактора и формы введения композиции.

Общая характеристика физико-химических свойств смеси, лежащей в основе композиции, приведена в табл. 1.

Композицию получают конденсацией пара-бензохинола с серноватокислым натрием в ацетоне при кипячении с обратным холодильником. Полученный осадок отделяют, сушат на воздухе, перекристаллизовывают и в зависимости от состава полученного продукта или подразделяют на индивидуальные олигомеры, или используют в качестве основы для композиции, вводят в смесь недостающие количества соответствующей соли и служебные добавки.

Особенностью заявляемой композиции является выбор индивидуальных компонентов смеси и их соотношения. Причем особое значение имеет последнее обстоятельство, т.к. среди гомологов, составляющих основную часть композиции, с ростом молекулярного веса уменьшается проникающая способность молекулы и ее возможность воздействия на реологию биологических жидкостей при одновременном нарастании антигипоксических и комплексообразующих характеристик.

При этом, если основное воздействие на жизнедеятельность клеток тример и тетрамер осуществляют внутри клетки, то деятельность пентамера наиболее эффективна на клеточных мембранах и во внеклеточной жидкости.

Основные свойства новой композиции иллюстрируются примерами.

Пример 1. Синтез композиции.

В аппарат с мешалкой, рубашкой и обратным холодильником, емкостью 80 л заливают 17 л ацетона и растворяют в нем 5,0 кг п-бензохинола. Раствор подогревают до 40-45^oC. 1925 г NaS₂O₃5H₂O растворяют при подогревании в 1,3 л воды, температуру раствора доводят до 40-45^oC, после чего полученный раствор при перемешивании добавляют к раствору п-бензохинола. Перемешивание осуществляют до окончания кипения смеси. Затем выключают охлаждение и оставляют содержимое реактора на сутки для созревания осадка. Надосадочную жидкость декантируют и отгоняют.

Осадок сушат на воздухе до постоянного веса, перекристаллизовывают и анализируют.

Вес полученного продукта 6,7 кг. Конечный продукт содержит тримера 39,6% тетрамера - 20,8%, пентамера 30,2%, вода - 9,2% неидентифицированные примеси - 0,2%. Для получения смеси целевого состава к продукту добавляли различные количества тримера, тетрамера и пентамера, а также различные растворители и другие вспомогательные ингредиенты. Результаты испытания композиций различного состава приведены в дальнейших примерах.

Пример 2. Влияние композиции на энергопродуцирование изолированных митохондрий скелетных мышц крыс.

Исследования проводили на искусственной композиции, содержащей (мас.%): тримерра - 3,0, тетрамера - 1,0, пентамера - 2,0, воды - 94,0.

Суспензию митохондрий, выделенную из гомогената скелетных мышц крысы, в среде состава (моль): сахароза - 0,25, MOPS - 0,01, калиевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (КЭТК) - 0,002 при pH среды 7,4, помещали в среду инкубации, состоящей (моль): хлористый калий - 0,12, MOPS - 0,011, при pH 7,4.

Дыхание митохондрий измеряли на полиграфической ячейке, в которой содержалось 0,004 моль глютамата калия в качестве субстрата окисления, 0,0006 моль аденозиндифосфата (АДФ) и 0,00005 моль 2,4-динитрофенола.

Влияние композиции по сравнению с ионолом на потребление митохондриями кислорода в различных условиях представлено в табл. 2.

Как следует из данных табл. 2, введение композиции солей вызывает сильное ингибирование дыхания в 4-м метаболитном состоянии, тогда как ионол не влияет на этот параметр. Добавление разобщителя типа 2,4-динитрофенола в этом состоянии стимулирует дыхание. Полученные результаты указывают, что композиция ингибирует АТФ-азу митохондрий, при этом наибольший эффект наблюдается при введении в суспензию 0,00024 моль активного начала. В этом случае потребление АДФ на единицу поглощенного кислорода возрастает примерно на 50%.

С повышением или понижением концентрации активного начала его воздействие на митохондрии понижается.

Пример 3. Влияние композиции на рост микробных клеток культуры Escherichia coli штамм М 17.

Культуру выращивали на глюкозо-минеральной питательной среде следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 1,0; NaCl - 5,0, Na₂HPO₄ 12H₂O - 1,0, Na₂CO₃ - 2,0, MgSO₄7H₂O - 0,1, цитрат аммония - 4,4, никотиновая кислота - 0,0005, глюкоза - 0,3.

Оценивали выход биомассы микроорганизмов в присутствии различных количеств водного раствора, содержащего 6% тримера, 2% тетрамера и 4% пентамера по сравнению с контролем.

Опыты проводили в колбах емкостью 100 мл, куда помещали 50 мл взвеси культуры, содержащей (0,3-9,5) млрд клеток бактерий в 1 мл. Колбы помещали на качалку, культивирование проводили при 37^oC в течение 7 ч. Выход биомассы оценивался после центрифугирования культурной жидкости.

Результаты опытов приведены в табл. 3. Оптимальное стимулирующее действие композиции в этих условиях проявляется при концентрации активного начала 1 мг в 1 л. Выход микробных клеток повышается на 45%.

Пример 4. Влияние композиции на функциональную активность клеток.

Эксперименты по воздействию композиции проводились на системах перевиваемых клеток человека Hela и бласттрансформированных лимфоцитах (по методике Засухина Г.Д. и др. Вопросы вирусологии, 1981, N 1, с.94-96; Hangerfort D.A. Stein. Techn., 1965, v.40, p.333-338).

Клетки Hela выращивали в стационарных условиях в течение 48-72 ч, после чего в среду вносили композицию, содержащего 45% тримера, 25% тетрамера, 25% пентамера и 5% воды в различных разведениях и считывали количество клеток, выросших в матрасах через 48 ч. Было установлено, что добавка 10^-4 препарата повышает количество клеток на 15 5%, 10^-3 - на 28 7%, 10^-2 - на 8 3%.

Дальнейшие эксперименты проводили с концентрацией препарата 10^-3 на матрасах объемом 100 мл по 100 клеток на матрасе. Количество клеточных колоний определяли через 14 дней прокрашиванием красителем Гимза. В результате было установлено, что число колоний возросло с 69 5 до 97 7 (на 45%), причем число колоний, содержащих более 50 клеток, увеличилось с 4 до 12.

Лимфоциты культивировали по обычной методике. Через час после стимуляции клеток ФГА в среду вводили препарат в концентрации 10 мкл/л (разведение 10^-5). На 66 ч роста число клеток по сравнению с контролем возросло на 28 7%.

Полученные эксперименты показали, что применение композиции стимулирует рост клеток человека, в частности, повышая их пролиферативную активность.

Пример 5. Влияние композиции на активность ферментов дыхательной цепи.

Воздействие композиции, содержащей 35% тримера, 25% тетрамера 35% пентамера и 5% липидов головного мозга изучали на кроликах массой 1,5 - 3,4 кг по оценке состояния ферментов цепи передачи электронов мозговой ткани кроликов при гипоксии и в ранний восстановительный период. Гипоксическое состояние достигалось забором крови. На стадии трансфузии контрольной группе вводили кровь, обогащенную кислородом.

В табл. 4 представлены данные по соотношению концентраций окисленной формы флавопротеинов к восстановительной форме NADH (K), парциальному давлению кислородa (PO₂), окислительно-восстановительному потенциалу крови (E_МВ) при введении водного раствора 10^-4 г/мл названного препарата в дозе 35 мг/кг, а также по потреблению глюкозы (C_ГЛ) и содержанию молочной кислоты (C_МК) при введении 10 мг/кг вышеуказанного раствора.

Полученные данные показали, что введение препарата вызывает немедленный запуск ферментов дыхательной цепи.

Пример 6. Влияние композиции по примеру 5 на жизнедеятельность клеток в условиях радиации.

Культуру клеток китайского хомячка линии Y-79 обучали дозой 150 рад. Мутагенные эффекты оценивали по числу индуцированных микроядер. Через 2 мин после облучения в культуру на 1 ч вводили композицию в виде водно-спиртового раствора, до концентрации активного начала 10^-6, 10^-5, 10^-4, 10^-3 г/мл. Число микроядер составило в контроле 15.6 0.6, без облучения - 5.8 0.3; при введении композиции в дозе 10^-3 г/мл - 7.2 1.0; 10^-4 г/мл - 7.4 1.0; 10^-5 г/мл - 10.1 0.6; 10^-6 г/мл - 12.1 0.6.

Доля живых клеток в клеточной культуре через 72 ч после облучения составила в контроле 75 2%, при введении указанных доз препарата соответственно: 88 5, 90 4, 85 4, 82 6%.

Пример 7. Защитное действие композиции при повышенных нагрузках.

Адаптация организма к перегрузке оценивалась в примере композиции, содержащей 25% тримера, 10% тетрамера, 15% пентамера, 40% декстрана, 5% глюкозы и 5% воды.

Композицию вводили перорально по 2 г 3 раза в день. Воздействие изучалось на основе обследования состояния групп добровольцев после 48-часовых маршей-походов в равнинной и горных местностях. Эффективность определялась исходя из времени поддержания мощности 170 Вт/кг на тренажере без изменения показателей. Препарат сравнения дексаметазон в терапевтических (1 мг) дозах. Композиция принималась три раза в день после еды по 1 капле на 10 кг веса.

При использовании плацебо в группе из 48 человек исходный результат: 3.08 0.08 мин, после равнинного марша - 2.96 0.07 мин, после марша в горах - 2.43 0.05 мин. Для дексаметазона соответственно - 3.45 0.09; 3.02 0.08; 2.51 0.08 мин; для композиции - 3.87 0.08; 3.46 0.11; 3.60 0.11 мин.

Пример 8. Антигипоксическое действие композиции по примеру 4.

Влияние активного начала оценивалось по состоянию ферментов цепи подачи электронов мозговой ткани кроликов при гипоксии и в ранний восстановительный период. Гипоксическое состояние достигалось забором крови. На стадии трансфузии контрольной группе вводили кровь, обогащенную кислородом.

Антигипоксическая активность заявляемого препарата была исследована при различных видах гипоксии на крысах и кроликах. В опытах использовались кролики беспородные массой 1.5-3.5 кг и крысы массой 200-220 г. Гипоксия вызывалась:

1) гипоксическая - экспозицией животных в барокамере на критических высотах 11-12 км;

2) геморрагический шок - кровопотерей;

3) циркулярная - перевязкой сонных артерий.

Животные наркотизировались внутривенным введением нембутала (40.0 мг/кг). Развитие гипоксии подтверждалось характерной динамикой типографии. Заявляемый препарат и препараты сравнения (убихинон и цитрохром C) вводили животным одноразово внутрибрюшинно следующим способом:

1) заявляемый препарат - в дозе 30 мг/кг;

2) убихинон в виде раствора из расчета 200 мг/кг веса;

3) цитрохром C в виде раствора из расчета 10 мг/кг веса.

В контрольной группе животных тем же способом и в том же объеме вводили 0.9% водный раствор поваренной соли.

Оценка антигипоксического действия препарата по Нобель-Колибу (множественное сочетание повреждения) различной степени тяжести на модели травматического шока составила (в % по сравнению с контролем): легкая травма - 100(70), средняя - 100(50), тяжелая - 80(30), крайне тяжелая -80(0).

Результаты опыта приведены в табл. 5.4