способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума

Формула изобретения

Способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума для выявления антител к возбудителю иерсиниоза путем сенсибилизации эритроцитов смесью антигенов и использования серовариантов 05,27 и 06,30, экстрагированных мочевиной, отличающийся тем, что дополнительно используют сероварианты 03 и 09, при этом получают смесь всех названных серовариантов в равных дозах в течение 1 ч при температуре 56^oC.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к производству диагностических препаратов, и может быть использовано в медицине для серологической диагностики заболевания, вызываемого бактериями вида.

Известен способ получения бидиагностикума, заключающийся в одновременной сенсибилизации формализированных эритроцитов барана смесью антигенов типа Буавена-Ленди, выделенных из возбудителя иерсиниоза серовариантов 03 и 09 [1] . Однако диагностикум, полученный этим способом, не позволяет выявлять в сыворотках крови больных людей специфические антитела к возбудителю иерсиниоза других серовариантов (05,27; 06,30), патогенных для человека.

Известен способ получения диагностикумов на основе антигенов, экстрагируемых мочевиной из возбудителя иерсиниоза серовариантов 03; 09; 05,27; и 06,30 [2].

Однако для определения иерсиниозных антител, в сыворотках крови больных людей необходимо получение четырех индивидуальных диагностических препаратов путем сенсибилизации формализированных эритроцитов барана антигенами возбудителя иерсиниоза каждого сероварианта в отдельности. Применение таких диагностикумов для выявления антител к возбудителю иерсиниоза, патогенных для человека серовариантов 03; 09; 05,27; и 06,30 предусматривает постановку РНГА с каждым из них, что в свою очередь требует взятия значительного количества крови у больного для проведения одного анализа, а также увеличения времени, материальных и трудовых затрат (особенно при проведении массового серологического обследования).

Цель изобретения - сокращение времени изготовления диагностикума и упрощение способа тестирования антител к возбудителю иерсиниоза серовариантов 03; 09; 05,27; 06,30, обеспечивающее возможность одномоментного проведения исследования в малом объеме материала с помощью РНГА.

Цель достигается путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов одномоментно смесью антигенов, экстрагируемых мочевиной из возбудителя иерсиниоза серовариантов 03; 09; 05,27; 06,30 в течение 2-х часов при температуре 56^oC.

Преимущества заявляемого способа по сравнению с прототипом и признаки, обеспечивающие эти преимущества, представлены в табл. 1.

Предлагаемый диагностикум выявляет четыре вида антител одномоментно, что позволяет экономить антиген в 2-4 раза, время проведения одного анализа в 4 раза, объем материала в 4 раза по сравнению с известными диагностикумами, где используется последовательное определение антител к каждому антигену в отдельности.

Способ получения диагностикума включает в себя следующие этапы: выделение антигена, сенсибилизация эритроцитов антигенами, лиофилизация готового препарата.

Пример 1 (оптимальный вариант)

Для получения антигенов используют штаммы V. enterocolitica 741 0:9; 896 0:3; 742 0:6,30; 738 0:5,27. Антигены возбудителя иерсиниоза выделяют из бактериальной массы, выращенной при температуре 29^oC в течение 24 часов и обезвоженной ацетоном.

Для этого 1,2 г сухой массы бактерий суспендируют в 40 мл 0,1М натрий-фосфатно-солевого буфера (ФСБ) pH 7,4 и нагревают на водяной бане при 100^oC в течение 1 часа при периодическом перемешивании. Для отделения осадка суспензию в течение 20 минут центрифугируют при 6000 об/мин.

Осадок суспендируют в 30 мл 0,1М ФСБ и выдерживают при 60^oC в течение 10 минут. После чего осадок отделяют центрифугированием при указанном выше режиме и повторяют его обработку 20 мл 0,1М ФСБ при температуре 60^oC в течение 10 минут. Осадок отделяют центрифурированием. Для экстракции целевого антигена осадок суспендируют в 40 мл 2,5М раствора мочевины и выдерживают при температуре 37^oC в течение 72 часов. Взвесь центрифугируют при 6000 об/мин 30 мин. Супернатант, представляющий раствор антигена, диализуют против воды до pH 6,5 и лиофильно высушивают.

Сенсибилизацию эритроцитов барана проводят раствором сенситина, содержащим антигены, полученные из возбудителя иерсиниоза 4-х сероваров (09; 03; 05,27; 06,30).

Раствор сенситина готовят следующим образом: смешивают по 3,2 мг каждого антигена, полученную смесь растворяют в 8 мл 0,15М ФСБ pH 7,2, добавляя по каплям 0,1N раствор едкого натра до pH 8. Затем объем сенситина доводят до 20 мл 0,15М ФСБ pH 7,2.

Для сенсибилизации к 20 мл раствора сенситина прибавляют 20 мл 5%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов в 0,15М ФСБ pH 7,2. Процесс сенсибилизации проводят при температуре 56^oC в течение 1 час. Сенсибилизующая доза составляет по 80 мкг каждого из 4-х антигенов на 1 мл 2,5% взвеси формалинизированных эритроцитов.

После трехкратного отмывания 0,85%-ным раствором хлорида натрия pH 7,2 (центрифугирование при 1500 об/мин 10 минут) осадок сенсибилизированных эритроцитов суспендируют в защитной среде и лиофилизуют.

Контроль сенсибилизации проводят в РНГА с сыворотками крови кроликов, иммунизированных возбудителем иерсиниоза тех серовариантов, антигены которых используются для получения диагностикума.

В результате получают 50 мл поливалентного иерсиниозного антигенного диагностикума. Титры специфической активности полидиагностикума в РНГА с гипериммунными кроличьими сыворотками к возбудителю иерсиниоза серовариантов 09; 03; 05,27 и 06,30 представлены в табл. 2.

Пример 2

Выделение антигенов и приготовление сенситина проводят как в примере 1. Сенсибилизацию формализированных эритроцитов осуществляют при температуре 45^oC в течение 30 мин. Изменение параметров сенсибилизации снижает специфическую активность полидиагностикума (табл. 2).

Пример 3.

Выделение и приготовление сенситина проводят как в примере 1. Сенсибилизацию осуществляют при температуре 62^oC в течение 2 ч. Увеличение температуры и времени процесса сенсибилизации приводит к уменьшению специфической активности полидиагностикума, полученного при данном режиме сенсибилизации (табл. 2).

Источники информации

1. Королюк А.М. и др. //Тез. Всес. науч.-практич. конфер. "Иерсиниозы". Владивосток, 1989, ч. 2, с. 106-107.

2. Дзадзиева М.Ф. и др. Авторское свидетельство N 1489377, G 01 N 33/531 "Способ получения диагностикума для выявления иерсиниозов".