аналог пептида фактора гормона роста (фгр), способ стимулирования секреции гормона роста и композиция для стимулирования секреции

Формула изобретения

1. Аналог пептида фактора гормона роста (ФГР) на основе первичной аминокислотной последовательности естественного пептида ФГР, имеющий в положении 2 аминокислотный остаток Гли, Тре, Вал или Иле в положении 15 - Ала, Вал, Лей, Иле, а в положении 19 - Вал или Иле.

2. Аналог пептида ФГР по п. 1, имеющий в положении 2 - Тре, Вал, или Иле.

3. Аналог пептида ФГР по п. 1, имеющий формулу

R-R₁-R₂-R₃ - Ала-Иле-Фен-Тре-R₈ -Сер-Тир-Арг-R₁₂-R₁₃-Лей-R₁₅-Глн-Лей-R₁₈-R₁₉-Арг- R₂₁-R₂₂-Лей-Глн-R₂₅-Иле-R₂₇-R₂₈- Арг-Глн-Глн-Гли-Глу-R₃₄-R₃₅-Глн-Глу-R₃₈- R₃₉-R₄₀-Арг-R₄₂-Арг-Лей-Z,

где

R - H, алкил C₁-C₅ или бензол;

R₁ - Тир или Гис;

R₂ - Гли, Тре, Вал или Иле;

R₃ - Асп, Глу, или цистеиновая кислота;

R₈ - Асн или Сер;

R₁₂ - Лиз или Арг, или N -- алкил, или N- - бензил- Лиз, где R - алкил C₁-C₅ или бензол;

R₁₃ - Вал или Иле;

R₁₅ - Ала, Вал, Лей, Иле или Гли;

R₁₈ - Сер или Тир;

R₁₉ - Вал или Иле;

R₂₁ - Лиз или Арг, или N -- алкил, или N -- бензил - Лиз,

где

R - алкил C₁-C₅ или бензол;

R₂₂ - Ала или Лей;

R₂₅ - Асп или Глу;

R₂₇ - Мет, Иле или Лей;

R₂₈ - Асп или Сер;

R₃₄ - Сер или Арг;

R₃₅ - Асн или Сер;

R₃₈ - Арс или Слн;

R₃₉ - Гли или Арг;

R₄₀ - Ала или Сер;

R₄₂ - Ала, Вал или Фен;

Z обозначает карбоксильную часть аминокислотного остатка на C-конце и является радикалом - COO Ra - CR_aO - CONHNH Ra - CON(R_a)(R_b) или CH₂OR_a, где R_a и R_b являются алкилом C₁-C₈ или водородом, или биологически активным фрагментом, простирающимся от R на амино- конце до остатка в любом положении от 27 до 44 на C-конце, или гомоСер (лактон), гомоСерOH или гомоСерN (R_a)(R_b) вышеупомянутого и/или нетоксичную соль вышеупомянутого.

4. Аналог пептида ФГР по п. 3, в котором R₂ является Тре, Вал или Иле.

5. Аналог пептид ФГР по п. 4, выбранный из группы, состоящей из: Тре²Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷бФГР (1-29)NH₂, Тре²Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷бФГР (1-29)NH₂,

Вал²Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷бФГР (1-29)NH₂, Иле²Ала¹⁵Иле¹⁹Иле²⁷бФГР (1-29)NH₂,

Вал²Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷бФГР (1-29)NH₂, Иле²Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷бФГР (1-29)NH₂,

Тре²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁰бФГР (1-30)NH₂, Тре²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁰бФГР (1-30)NHэтил, Тре²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³³бФГР (1-33)NH₂, Тре²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³³бФГР(1-33)NH-этил, Тре²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁷бФГР (1-37)NH₂, Тре²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер⁴⁴бФГР(1-44)NH₂, Тре²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁰бФГР(1-30)NH₂, Тре²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³³бФГР(1-33)NH₂, Тре²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁷бФГР(1-37)NH₂, Тре²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер⁴⁴бФГР(1-44)NH₂, Иле²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁰бФГР(1-30)NH₂, Иле²Сер⁸Aла¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁰бФГР(1-30)NH-этил, Иле²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³³бФГР(1-33)NH₂, Иле²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³³бФГР(1-33)NH-этил, Иле²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁷бФГР(1-37)NH₂, Иле²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер⁴⁴бФГР(1-44)NH₂, Вал²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁰бФГР(1-30)NH₂, Вал²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³³бФГР(1-33)NH₂, Вал²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁷бФГР(1-37)NH₂, Вал²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер⁴⁴бФГР(1-44)NH₂, Иле²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁰бФГР(1-30)NH₂, Иле²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³³бФГР(1-33)NH₂, Иле²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁷бФГР(1-37)NH₂, Иле²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер⁴⁴бФГР(1-44)NH₂, Вал²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁰бФГР(1-30)NH₂, Вал²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³³бФГР(1-33)NH₂, Вал²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁷бФГР(1-37)NH₂, Вал²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁷бФГР(1-37)NH-н-пропил или Вал²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер⁴⁴бФГР(1-44)NH₂, или нетоксичная соль пептида.

6. Аналог пептида ФГР по п. 3, где R₁₄ - Ала, Вал, Лей или Иле.

7. Аналог пептида ФГР по п. 6, где R - H и R₁₅ - Ала.

8. Аналог пептида ФГР по п. 7, R₁ - Тир.

9. Аналог пептида ФГР по п. 8, где R₈ и R₂₈ - Сер.

10. Аналог пептида ФГР по п. 6, где R₂ - Вал.

11. Аналог пептида ФГР по п. 6, где R₂ - Иле.

12. Аналог пептида ФГР по п. 6, где R₁₉ - Вал.

13. Аналог пептида ФГР по п. 6, где R₁₉ - Иле.

14. Способ стимулирования секреции гормона роста у животного, включающий введение животному эффективного количества пептида ФГР, отличающийся тем, что в качестве пептида используют аналог ФГР по п. 1.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что в качестве пептида используют аналог ФГР по п. 3.

16. Композиция для стимулирования секреции гормона роста у животного, содержащая пептид ФГР и общепринятый носитель, отличающаяся тем, что в качестве пептида содержит аналог ФГР по п. 3 в эффективном количестве в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к пептидам, оказывающим влияние на функцию гипофиза у человека и животных, особенно у млекопитающих. В частности, настоящее изобретение направлено на пептиды, стимулирующие секрецию гипофизом гормона роста. Пептиды настоящего изобретения сильно действуют in vivo, более стабильны в плазме, а некоторые пептиды более стабильны в водной среде при нейтральном pH, чем последовательности естественного ФГР.

Физиологам давно известно, что гипоталамус регулирует секреторную функцию аденогипофиза, продуцируя особые вещества, стимулирующие или ингибирующие секрецию каждого из гормонов гипофиза. В 1982 г. из экстрактов опухолей поджелудочной железы у человека были выделены панкреатические (опухолевые) рилизинг-факторы человека (чпФГР). Эти факторы были очищены, идентифицированы, синтезированы, испытаны, и было установлено, что они стимулируют секрецию гормона роста (ГР) гипофизом. Gufllemin R. et. al., Science 218, 585-585 (1982).

После этого были идентифицированы и синтезированы также соответствующие гипоталамические рилизинг-факторы ГР других видов животных, включая крыс, свиней, овец, быков и морских свинок, и человека.

Было обнаружено, что гипоталамический ФГР человека (чФГР) имеет такую же формулу, как чпФГР, а именно H-Тир-Ала-Асп-Ала-Иле-Фен-Тре-Асн-Сер-Тир-Арг-Лиз-Вал-Лей-Гли-Глн-Лей-Сер-Ала-Арг-Лиз-Лей-Лей-Глн-Асп-Иле-Мет-Сер-Арг-Глн-Глн-Гли-Глу-Сер-Асн-Глн-Глу-Арг-Гли-Ала-Арг-Ала-Арг-Лей-NH₂.

Было обнаружено, что ФГР крыс (кФГР) имеет остаток Сер в положении 8 и формулу H-Гис-Ала-Асп-Ала-Иле-Фен-Тре-Сер-Сер- Тир-Арг-Арг-Иле-Лей-Гли-Глн-Лей-Тир-Ала-Арг-Лиз-Лей-Лей-Гис-Глу-Иле-Мет-Асн-Арг-Глн-Глн-Гли-Глу-Арг-Асн-Глн-Глу-Глн-Арг-Сер-Арг-Фен-Асн-OH. (Например, см. патент США 4595676).

Было обнаружено, что бычий ФГР (бФГР) имеет формулу H-Тир-Ала-Асп-Ала-Иле-Фен-Тре-Асн-Сер-Тир-Арг-Лиз-Вал-Лей-Гли-Глн-Лей-Сер-Ала-Арг-Лиз-Лей-Лей-Глн-Асп-Иле-Мет-Асн-Арг-Глн-Глн-Гли-Глу-Арг-Асн-Глн-Глу-Глн-Гли-Ала-Лиз-Вал-Арг-Лей-NH₂.

Было обнаружено, что свиной ФГР имеет остаток Сер в положении 28.

Описано, что последовательности естественного ФГР подвергаются быстрой инактивации ферментами плазмы крови. Быстрое разрушение осуществляется за счет расщепления 2-3 связи пептида дипептидилпептидазой IV типа (ДПП-IV), которая раньше называлась также дипептидиламинопептидазой IV. Frohman L.A. et. J. Clin. Invest., 78, 906-913 (1986).

Метаболическая стабильность ФГР и различные способы защиты пептидов ФГР от расщепления дипептидилпептидазой описаны в различных источниках, включая Felix et al., Synthesis and biological activity of novel linear and cyclic GRF analogs, in Peptides. Chemistry and Biology, Proc 10 th Am. Peptide Symp. Ed.GR. Morshall Leidin. pp. 465-467 (1988), где сообщается об аналогах ФГР с замещениями на дезаминированный Тир в положении 1 и/или D-Ала в положении 2, что повышает устойчивость их аминоокончаний к разрушению ферментами. Эту информацию недавно подтвердили Frohman et al., Dipeptidylpeptidase-IV and trypsin - like enzymatic degradation of human growth hormone-releasing hormone in. .. (1989). К тому же, последняя группа исследователей показала, что N-ацилирование и N-метилирование N-окончания тирозинового остатка или замещение на D-Тир-1- в ФГР полностью ингибирует расщепление во 2-3 положении. С другой стороны, альфа-метилирование Тир-1 только частично блокировало разрушение дипептидилпептидазой IV. Murphy W.A. and Coy D.H., Potent long-acting alkylated analogs of growth hormone releasing factor, Peptide Researсh, 1, 36... описывают аналоги ФГР с повышенной резистентностью к разрушению ферментами в результате N-алкилирования или N-арилалкилирования N-терминальной аминокислоты с или без сопутствующего N-алкилирования боковых групп лизинов в пептидной цепи.

Последовательности естественного ФГР имеют остаток Гли в 15 положении. Известно, что аналоги с Ала или Лей в 15 положении сильнее стимулируют секрецию ГР. Например, см. патенты США 4649131 и 4734399, а также Ling N. et al, Quo vadis? Symposium, Sanofi Group, May 29-30, 1985, Toulouse - Labege, France (pp. 309-322). Замещение Гли-15 на Вал или альфа-изомасляную кислоту также усиливает действие аналогов ФГР, Felix et al. Synthesis and biological activity of novel growth hormone relеasing factor analogs, in Peptides 1986, Walter de Gruyter & Co., Berlin-New York, pp.481-484 (1987).

A. M. Felix сообщил о программе для синтеза аналогов с повышенной и/или пролонгированной биологической активностью, включая получение и испытание Ала¹⁵ чФГР (1-29) NH₂ и des NH₂- Тир¹, D-Ала², Ала¹⁵ чФГР (1-29) NH₂. Например, см. патенты США 4649131 и 4734399, а также A.M.Felix, E.P. Heimer, T. F. Mowles, H. Bisenfeis, P. Leund. T.J. Lambros, M. Ahmad, C.T. Waug & Paul Bruzeau; Synthesis and biolodical activity of novel drowth hormone releasind factor analogs. in Peptides 1986, pp. 481-484 (1987); Felix A.M., Wang C.T., Heimes E. , Fourmer A. Bolin D., Ahmad M., Lambros T., Mowles T. and Miller L.: Synthesis and biological activity of novel linear and cyclic GRF analogs in Peptides Chemistry and Biology. Procecdiuds of the 10th American Peptide. Symposium, Ed. G. R. Marshall. Escom Acience Publishers, Leiden, Fhe hetherlauds (1988), pp. 465-467; D. Petriderc, H.Lapierre, G. Pelletier, P. Dubrenil, P. Gaudrean, T. Mowles, A. Felix and P. Brazean: Effect of a potent analog of human growth hormone-releasing factor (hGRF) on growth hormone (GH) release and milk production of dairy cows. Meeting Abstract, p. 223, 82 nd Meeting American Dairy Sci. Assn. Columbia, MO, June 21 - 24 (1987).

Аналог ФГР с Сер во втором положении, помимо 8 других модификаций, описан Joll et al., Amphiphilic Groath Hormone-Releasing Factor (GRF) analogs; peptide design and biological activity in vivo, Biochem. Biophis, Res. Commun. 139, 763 - 770 (1986). Этот аналог по описанию проявляет 165% активности в организме овец по сравнению с бФГР (1 - 44) NH₂.

В патенте США 4734399 раскрыты аналоги ФГР с замещением Ала, N-метил-D-Ала или D-Ала во 2 положении и Ала, Лей, Вал, Иле, нор-Лей, нор-Вал или бета-Ала в положении 15. См. также патент США 4649131.

В Европейской патентной заявке Coy и Murphy, публикация N 0188214, заявка N 86100127, 9 раскрыты аналоги ФГР с Лей или Фен в положении 2, помимо пептидов ФГР, замещенных различными, не встречающимися в природе аминокислотами L- или D-конфигурации в положении 2.

Аналоги ФГР с очень низкой биоактивностью, вызванной замещением Ала² НА САРКОЗИН или Про, описаны Coy et al., Strategies in the design of synthetic agonists and antagonists of growth hormone-rebasing factor, Peptides, Vol.7, Suppe. 49-52 (1986).

Hing et al., Growth hormone releasing factor analogs with potent antagonistics activety in Peptides. Chemistry and Biology Proceeding of the 10th American Ptptide Symposium Ed. G. R. Marshall, Escom Science Publishers, heiden, The Hetherlands (1988), рр. 484-486, описали серию аналогов ФГР с замещениями либо Арг, либо различными аминокислотами в положении 2. Все они менее активны, чем исходный гормон, а некоторые из них проявляют анатагонистическую активность.

В известном изобретении представлены синтетические полипептиды ФГР, имеющие остаток Сер вместо нормального аминокислотного остатка в положениях 8 и 28 полипептида для подавления химического разрушения (дезаминирования) в водной среде. См. патентную заявку США, серийный N 07/303518, поданную 27 января 1989 г., и серийный N 07/323955, поданную 15 марта 1989 г. См. также A. R. Friedman, A.K.Schkpuriapi, D.M. Brown, R.M.Hillman, L.F.Krabill, R.A. Mortin, H.A.Lureher-Heely and D.M. Guido, Fhe Degradation of Growth Hormone Rellasing Factor Analogs in Heutral Agulons Solutian is Delated to Dlamidation of Aspargine Residuss by Serine Stabilizer, Int, J. Peptide Protein Res., 37, 14-20 (1991).

В известном изобретении представлены синтетические полипептиды ФГР с замещением остатка цистеиновой кислоты на аминокислотный остаток в положении R₃ и/или R₂₅. См. патентную заявку США, серийный N 07/150301, поданную 29 января 1988 г., и серийный N 89/00245, поданную 27 января 1989 г.

Аналог чФГР из 29 аминокислот был создан G. Velicellbi et al., Proc. Motl. Aca. Sci. USA, Vol. 83, 5397-5399 (1986), в котором на амино-конце - последовательность первых шести аминокислот, а в остатке последовательности с Сер в положении 8 имеется отличие от естественного полипептида по 13-ой аминокислоте. Аналог в форме амида и свободной кислоты имел формулу Н-Тир-Ала-Асп-Ала-Иле-Фен-Сер-Сер-Ала-Тир-Арг-Арг-Лей-Лей-Ала-Глн-Лей-Ала-Сер-Арг-Арг-Лей-Лей-Глн-Глу-Лей-Лей-Ала-Арг-NH₂ /OH. При проверке на способность стимулировать секрецию гормона роста (ГР) в первичной культуре клеток передней доли гипофиза крыс установлено, что амидный аналог активнее чФГР (1-40) OH в 1,57 раза, тогда как его форма в виде свободной кислоты в том же опыте имела только 1/6 часть активности. Vall et al. (патентная заявка США, серийный N 053233, поданная 22 мая 1987 г.) описывают аналоги чФГР из 31 остатка, в которых пользуются остатком в 31 положении, обладающим функциональной группой боковой цепи, которую можно конъюгировать с отдельным протеином. В аналогах чФГР из 31 остатка возможны также замещения других остатков, встречающихся в естественной последовательности ФГР, такие как Асн или Сер в положении 8, Фен в положении 10 или Ала в положении 15. Асн или Сер могут быть представлены в 28 положении.

Описывается, что при некоторых условиях, в присутствии воды, остатки Асн в полипептидах подвергаются дезаминированию. Неясно, однако, какими правилами определяется степень дезаминирования. Например, в таком полипептиде, как трипсин, дезаминированию подвергаются только остатки Асн в последовательности Асн-Сер, в то время как другие остатки Асн не дезаминируются. См. Kossiakoff A.A., Science 240, 181-190 (1988).

Европейская патентная заявка N 86308337.4, публикация N 0220958, раскрывает класс соединений, имеющих формулу Н-Х-Про-пептид, где Х является остатком аминокислоты, встречающейся в природе. Про относится к встречающейся в природе аминокислоте, пролину, и пептидом является последовательность остатков аминокислот, определяемая как биологически активный пептид или белок. Примеры Н-Х-Про-пептидов включают Мет-Про-(рилизинг-фактор гормона роста), который можно химическим путем превратить в ФГР.

Описаны аналоги, созданные путем удлинения амино-конца пептидов, не относящихся к ФГР, и служащие различным целям, например: M.A. Tallon et al., Biochem, 26: 7767-7774 (1987), создали серию аналогов альфа-фактора спаривания дрожжей с присоединенными к амино-концу остатками: Ала, Глу-Ала, Ала-Глу-Ала или Глу-Ала-Глу-Ала. Эти пептиды использовались в исследованиях взаимосвязи структуры и активности. D. Andren et al., 20th Eur. Peptide Symp. , Tubingen, GFR, September 4-9, 1988, Symposium Abstracts, p. 33, синтезировали целиком последовательность предшественника цекропина А из 64 аминокислот вместе с несколькими более короткими пептидами, соответствующими потенциальным промежуточным продуктам. Среди них была полная последовательность цекропина, удлиненная на Ала-Про-Гли-Про на амино-конце, которую использовали для того, чтобы показать, что присоединенная часть на самом деле может отщепляться частично очищенным ферментным препаратом, напоминающим дипептидилпептидазу, полученным из куколки павлиноглазки цекропин. См. также H. Boman et al., J. Biol. Chem., 264: 5852-5860 (1989).

G. Kreil et al., Enr. J. Biochem., 111: 49-58 (1980) сообщают, что меллитин, главный компонент пчелиного яда, образуется из про-меллитина. Пред-последовательность про-меллитина состоит из шести Х-Про и пяти Х-Ала чередующихся дипептидильных остатков. Результаты, представленные Kreil et al., наводят на мысль, что превращение продукта-предшественника может происходить путем постепенного отщепления дипептидных единиц ферментом типа дипептидилпептидазы IV, присутствующим в экстрактах из ядовитых желез. C. Mollay et al. , Eur. J. Biochem., 160: 31-35 (1986). Церулеин и ксенопсин - два пептида, обнаруженные в кожном секрете у Xeropus Laevis. У их предшественников к амино-концу присоединены последовательности Фен-Ала-Асп-Гли у первого и Сер-Ала-Глу-Ала у последнего. Дипептидилпептидаза IV типа, выделенная из кожного секрета лягушки, обладает специфичностью, требуемой для отщепления этих присоединенных последовательностей от амино-конца, ведущего к образованию зрелых продуктов.

D. Julins et al., Cell, 32: 839-852 (1983). Альфа-фактор феромона спаривания является пептидом из 13 аминокислот, выделяемым альфа-клетками Saccharomyces cervisiae. Неспаривающиеся мутанты альфа-клеток, лишенные связанной с оболочкой дипептидилпептидазы, не вырабатывают нормальный альфа-фактор, а секретируют совокупность соединений, на прошедших полной обработки, со структурой Глу-Ала-Глу-Ала-альфа-фактор или Асп-Ала-Глу-Ала-альфа-фактор, обладающих заметно сниженной биологической активностью. Показано, что для нормальной обработки предшественника альфа-фактора требуется связанная с оболочкой дипептидилпептидаза и что в нормальных альфа-клетках дрожжей этот процесс может ограничивать степень созревания альфа-фактора. C.L. Choy et al. , Eur. J. Biochem., 160: 267-272 (1986). Последовательность предшественника белка, препятствующего замерзанию, у ньюфаундлендской зимней камбалы состоит из четырех Х-Про и семи Х-Ала чередующихся повторений на амино-конце. Хотя превращения этого предшественника не были исследованы, авторы предположили, что этот процесс может проходить в сыворотке крови с помощью фермента, относящегося к дипептидилпептидазам, который мог бы последовательно отщеплять дипептидильные единицы от удлиненной части с тем, чтобы высвободить зрелый белок, препятствующий замерзанию.

После зарегистрированной даты приоритета по основной заявке Subr et al. сообщили о выделении и характеристике всей протяженности цДНК клона, кодирующей ФГР у мышей. Предсказано, что мышиный ФГР должен быть пептидом, состоящим из 42 аминокислотных остатков со свободным карбоксильным концом. У этого пептида в положении 2 находится остаток Вал, что резко отличает его от ФГР других видов, в которых положение 2 занято Ала. См. Mol. Endocrinology 3: 1693-1700, 1989.

На основании соображений, высказанных другими исследователями, были получены аналоги ФГР с замещением аминокислоты в 19 положении на Лей, а именно Тре² Ала¹⁵ Лей¹⁹ Лей²⁷- бФГР (1-29)NH₂ трифторуксусная соль, соединение N3: Лей¹⁹ Лей²⁷- бФГР(1-29)NH₂ трифторуксусная соль; Тре² Лей¹⁹ Лей²⁷ бФГР(1-29)NH₂ трифторуксусная соль; Ала¹⁵ Лей¹⁹ Лей²⁷ бФГР(1-29)NH₂. При проверке на клетках передней доли гипофиза крыс in vitro аналоги с Лей¹⁹ (а именно Тре² Ала¹⁵ Лей¹⁹ Лей²⁷ бФГР (1-29)-NH₂, трифторуксусная соль, соединение N3: Лей¹⁹ Лей²⁷ бФГР (1-29)NH₂ трифторуксусная соль, Тре² Лей¹⁹ Лей²⁷ бФГР (1-29)NH₂ трифторуксусная соль и Ала¹⁵ Лей¹⁹ Лей²⁷ бФГР(1-29)NH₂, трифторуксусная соль) значительно менее активно стимулировали секрецию гормона роста (ГР), чем соответствующие аналоги Ала¹⁹. При проверке in vivo на растущих быках в дозе 10 пмоль/кг количество ГР, выделенного за двухчасовой испытательный период после введения аналогов Лей¹⁹, незначительно отличалось (p > 0,05) от уровня после введения соединений с Ала¹⁹. При проверке на стабильность в бычьей плазме соединения с Лей¹⁹ были более стабильными, чем аналоги с Ала¹⁹.

В молекуле ФГР остаток 19 расположен в области молекулы, которая имеет спиральную форму в окружении, напоминающем оболочку клетки [Clore G.M., Martin S. R. and Gronenborn A.M., J. Mol. Biol., 191, 553-561 (1986)]. Не известно, является ли роль остатка Ала¹⁹ в молекуле ФГР структурной или обусловливающей контакт рецептора с молекулой [Soto K., Hotta M., Kagegama J. , Chiang T. C. , Hu H.Y., Dong M.H. and Sing N., Biochem. Biophys, Res, Commun. , 149(2) 531 - 537 (1987); Schiffer M. and Edmundson A.B., Biophys, J., 7, 121 (1967)] Ahmed M., Lambros Т., Mowles Т. and. Miller L. "Synthesis and Biological activity of Novel Linear & Cyclic GRF Analogs" in Peptides. Chemistry and Biology, Proc. 10th Am. Peptide Symposium, Ed. G.R.Marshall, ESGOM Sci Publishers, Leiden, The Hetherland, pp. 465-467 (1988); Tou J.S., Kaempfe L. А. , Vineyard B.D., Buonomo F.C., Della-Fera M.A. and Baile C.A. "Amphiphilic Growth Hormone Releasing Factor Analogs. Peptide Design and Biological Activity in vivo", Biochem. Biophys. Res. Commun. 139/2, pp. 763-770 (1986); Coy D.H., Murphy W.A. Sueires-Diaz J., Coy E.J., Lance V.A. "Structure Activity Studies on the N-Terminal Region of Growth Hormone Releasing Factor", J. Med. Chem. 28, pp. 481-485 (1985); Felix A.M., Heimer E. P. , Mowles Т.Е., Eisenbeis H., Leung P., Lambros T.J., Ahmed M. and Wang C. T. "Synthesis and Biological Activity of Novel Growth Hormone Releasing Factor Analogs", in Peptides 1986, Walter de Gruyter & Co., Berlin-New York, pp. 481-484 (1987); Velicelebi G., Patthi S. and Kaiser E.T. "Design and Biological Activity of Analogs of Growth Hormone Releasing Factor with Potential Amphiphilic Helical Garboxyl Termini", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 85, pp. 5397-5399 (1986); Ling N., Baird A., Wehrenberg W.B., Munegumi Т. and Ueno N. "Synthesis GRF Analogs as Competitive Antagonists of GRF Therapeutic Agents Produced by Genetic Engineering", Quo Vadis? Symposium, Sanofi Group, May 29-30, 1985, Toulouse-Labege, France, pp. 309-329; Murphy W. A. and Coy D.H. Potent long-acting alkylated analogs of growth hormone-releasing factor, Peptide Research 1, 36-41 (1988). J. С.Тоu, L.A.Kaempfe, В. D. Vineyard, F. С.Buonomo, M.A. Della-Fera and C.A.Baile; Amphiphilic Growth Hormone-Releasing Factor (GRF) analogs: peptide design and biological activity in vivo, Biochem. Biophys. Res. Commun. 139, 763-770 (1986). Термин пептид ФГР включает нетоксические соли этого соединения.

Для определения пептида ФГР использована номенклатура, приведенная в книге Schroder Lubke "The Peptides", Akademic Press (1965), где в соответствии с общепринятыми представлениями аминогруппа на амино-конце изображается слева, а карбоксильная группа на C-конце - справа. Если остатки аминокислот имеют изомеры, имеются в виду L-формы, кроме специально указанных случаев.

Настоящее изобретение представляет синтетические аналоги пептида ФГР, имеющие следующие формулы:

R-R₁-R₂-R₃-Ала-Иле-Фен-Тре-R₈-Сер-Тир-Арг-R₁₂-R₁₃-Лей-R₁₅-Глн-Лей-R₁₈-R₁₉-Арг-R₂₁-R₂₂-Лей-Глн-R₂₅-Иле-R₂₇-R₂₈-Арг-Глн-Глн-Гли-Глу-R₃₄-R₃₅-Глн-Глу-R₃₈-R₃₉-R₄₀-Арг-R₄₂-Арг-Лей-Z,

где R - H, алкил C₁-C₅ или бензол, предпочтительно H; R₁ - Тир или Гис, предпочтительно Тир; R₂ - Гли, Тре, Вал или Иле, предпочтительно Вал или Иле; R₃ - Асп, Глу или цистеиновая кислота, предпочтительно Асп; R₈ - Асн или Сер, предпочтительно Сер; R₁₂ - Лиз, N -- алкил или N -- бензил-Лиз или Арг, предпочтительно Лиз, или N -- алкил или N --бензил-Лиз, когда R представлен C₁-C₅-алкилом или бензолом, R₁₃ - Вал или Иле, предпочтительно Вал, R₁₅ - Ала, Вал, Лей, Иле или Гли (предпочтительно Ала, Вал или Иле, более предпочтительно Ала), R₁₈ - Сер или Тир, предпочтительно Сер, R₁₉ - Вал или Иле (предпочтительно Вал), R₂₁ - Лиз, N -- алкил или N -- бензил-Лиз или Арг, предпочтительно Лиз, или N -- алкил, или N -- бензил-Лиз, когда R представлен C₁-C₅-алкилом или бензолом, R₂₂ - Ала или Лей, предпочтительно Лей, R₂₅ - Асп или Глу, предпочтительно Асп, R₂₇ - Мет, Иле или Лей, предпочтительно Лей, R₂₈ - Асн или Сер, предпочтительно Сер, R₃₄ - Сер или Арг, предпочтительно Арг, R₃₅ - Асн или Сер, предпочтительно Асн, R₃₈ - Арг или Глн, предпочтительно Глн, R₃₉ - Гли или Арг, предпочтительно Гли, R₄₀ - Ала или Сер, предпочтительно Ала, R₄₂ - Ала, Вал или Фен, предпочтительно Вал, и Z - означает карбоксильную часть аминокислотного остатка на C-конце и является радикалом - COOR_a, -CR_aO, -CONHNHR_a, -CON(R_a)(R_b) или -CH₂OR_a, где R_a и R_b представлены C₁-C₈-алкилом или водородом; или биологически активный фрагмент этого соединения, отходящий от R на амино-конце к остатку в любом из 27-44 положений на C-конце; или гомосерин (лактон), гомо СерOH или гомоСер N (R_a) (R_b) вышеуказанного и/или нетоксическая соль вышеуказанного.

R_a - предпочтительно водород (H).

R_b - предпочтительно этил.

Примерами C₁-C₈-алкила являются метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил, октил и их изомеры.

Символ iPr относится к изопропилу.

Символ Bz1 относится к бензилу.

Воплощением этого изобретения являются пептиды ФГР, где R₁₉ является Вал или Иле, включая пептиды Тре² Ала¹⁵ Вал¹⁹ Лей²⁷ бФГР(1-29)NH₂, Тре²Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷бФГР(1-29)NH₂, Вал²Ала¹⁵ Иле¹⁹Лей²⁷-бФГР(1-29)NH₂,

Иле²Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷-бФГР(1-29)NH₂, Вал²Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷-бФГР(1-29)NH₂,

Иле²Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷-бФГР(1-29)NH₂, Гли²Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷-бФГР(1-29)NH₂,

Гли²Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷-бФГР(1-29)NH₂, предпочтительно пептиды Тре²Сер⁸Ала¹⁵ Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸гомоСер³⁰-бФГР(1-30)NH₂ , Тре²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹ Лей²⁷Сер²⁸гомоСер³³-бФГР( 1-33)NH₂, Тре²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³⁷-бФГР(1-37)NH₂, Тре²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер⁴⁴-бФГР(1-44)NH₂, Тре²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁰-бФГР(1-30)NH₂, Тре²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³³-бФГР(1-33)NH₂, Тре²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁷-бФГР(1-37)NH₂, или Тре²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер⁴⁴-бФГР(1-44)NH₂, более предпочтительны Иле²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁰-бФГР(1-30)NH₂, Тре²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁰-бФГР(1-ЗО)NHэтил, Иле²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³³-бФГР(1-33)NH₂, Иле²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³³-бФГР(1-33)NHэтил, Тре²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³³-бФГР(1-33)NHэтил, Иле²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁷-бФГР(1-37)NH₂, Иле²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер⁴⁴-бФГР(1-44)NH₂, Вал²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹ Лей²⁷Сер²⁸гомоСер³⁰-бФГР(1-30)NH₂, Вал²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³³-бФГР(1-33)NH₂, Вал²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер-бФГР(1-37)NH₂, Вал²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер⁴⁴-бФГР(1-44)NH₂, Иле²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷-Сер²⁸ гомоСер³⁰-бФГР(1-30)NH₂, Иле²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³³-бФГР(1-33)NH₂, Иле²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁷-бФГР(1-37)NH₂, Иле²Сер⁸ Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸гомоСер⁴⁴-бФГР(1-44) NH₂, Вал²Сер⁸Ала¹⁵ Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸гомоСер³⁰-бФГР(1-30)NH₂ Вал²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³³-бФГР(1-33)NH₂, Вал²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷ Cep²⁸гомоCep⁴⁴-бФГР(1-44)NH₂, Вал²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁷-бФГР(1-37)NH-н-пропил или его нетоксическая соль.

Самым предпочтительным пептидом ФГР предмета изобретения является Иле²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁰-бФГР(1-30)NH-этил.

Еще одним воплощением этого изобретения являются пептиды с удлиненным амино-концом, включая, например, N -- (Тир-Ала-Фен-Про-Фен-Ала)-Тир¹Тре²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹ Лей²⁷Сер²⁸-бФГР(1-29)NH₂; N -- (Лей-Про-Гли-Про-Тир-Ала)-Тир¹Тре²Сер⁸Ала¹⁵ Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸-бФГР(1-29)NH₂; N -- (Ала-Про-Гли-Про-Тир-Сер)₂-Тир¹Вал²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³²-бФГР(1-32)NH₂; N -- (Лей-Про-Тир-Ала-Тир-Ала) -Тир¹Иле²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷ Cep²⁸-бФГP(1-29)NH₂; N -- (Гис-Ала-Тир-Про-Тир-Ала)-Тир¹Иле² Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸- бФГР(1-29)NH₂; N -- (Глу-Про-Фен-Ала-Тир- Про-Гис-Ала)-Тир¹Иле²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹ Лей²⁷Сер²⁸-бФГР(1-29)NH₂; N -- (Гис-Про-Гис-Про-Гис-Ала-Тир-Ала)-Тир¹Тре²Сер⁸Ала¹⁵ Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸-бФГР(1-37)NH₂; N -- (Тир-Ала-Гли-Про-Лей- Про-Фен-Ала)₂-Тир¹Иле²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹ Лей²⁷Сер²⁸гомоСер³²-бФГР(1-32)NH₂, N -- (Вал-Про-Арг-Про-Фен-Про-Тир-Сер)-Тир¹Вал²Сер⁸ Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸гомоСер³³- бФГР(1-33)NHэтил; N -- (Арг-Про-Тир-Ала-Иле-Про-Фен-Ала)-Тир¹Иле²Сер⁸Ала¹⁵ Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸гомоСер³⁰-бФГР(1-30)NHэтил; N -- (Тир-Ала)₄-Тир¹Вал²Сер⁸Ала¹⁵ Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸гомоСер³⁴-бФГР(1-34)NHCH₃; N -- (Иле-Про-Глу-Ала-Тир-Ала)-Тир¹Иле²Сер⁸Ала¹⁵ Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸-бФГР(1-37)NH₂.

Другим воплощением этого изобретения является любое из вышеупомянутых воплощений, в котором цистеиновая кислота замещается на Асп в положении 3 и/или 25, предпочтительно в положении 3.

Соединения с Вал¹⁹ и Иле¹⁹ предмета изобретения являются такими же активными (а иногда более активными) в выделении ГР in vitro (клетками гипофиза крыс), чем аналогичные соединения с Ала¹⁹ (таблица I и рисунок 1). Они более устойчивы к протеолизу при инкубации в бычьей плазме. Доказательство повышенной метаболической стабильности соединений этого изобретения (при сравнении с естественной последовательностью ФГР в виде соединения Лей²⁷ -бФГР (1-29)NH₂), полученное при исследовании стабильности in vitro, представлено в таблице II. Соединения этого изобретения более активны in vivo в дозе 10 пмоль/кг, чем аналоги с Лей¹⁹ (рисунок 2) и, как правило, больше способствуют выделению гормонов роста и эффект сохраняется дольше, чем при введении аналогов с Ала¹⁹ и Лей¹⁹ при испытаниях на быках в дозе 30 пмоль/кг (таблица III). На рисунках 1 и 2 (испытаны трифторуксусные соли соединений) T2 означает Тре², A15 означает Ала¹⁵, L27 означает Лей²⁷, L19 означает Лей¹⁹, V19 означает Вал¹⁹ и I19 означает Иле¹⁹.

В таблице III и на рисунке 2 освещено повышение in vivo силы действия соединений этого изобретения при R₁₉ = Вал. Например, из сопоставления силы действия in vivo специалисту должно быть ясно, что в дозе 10 пмоль/кг (рисунок 2) Тре² Ала¹⁵ Вал¹⁹ Лей²⁷ бФГР (1-29)NH₂, трифторуксусная соль и Тре²Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷ -бФГР (1-29) NH₂, трифторуксусная соль так же, как в дозе 30 пмоль/кг (таблица III), соединения с Вал¹⁹ и Иле¹⁹ обладают большей биоактивностью, чем естественный ФГР.

Для технологии промышленного производства предпочтительнее, чтобы остаток на C-конце был представлен гомосерином, лактоном гемосерина, амидом гомосерина или C₁-C₈-алкилом (предпочтительнее C₁-C₄-алкилом), вторичными или третичными амидами гомосерина.

Синтетические аналоги пептида ФГР синтезируются соответствующим способом, включая, например, способы, раскрытые в патенте США 4529595 (столбец 2, строка 35 по столбец 5, строка 64) и патенте США 4689318 (со столбца 2, строки 23 по столбец 9, строку 13), включенные в настоящую заявку в порядке ссылки.

Методика A представляет собой синтез аналогов пептида ФГР предмета изобретения.

Методика A

Пептиды синтезируются твердофазным способом с применением синтезатора пептидов Applied Biosystems 430 A (Applied Biosystems, Foster City, California), используя циклы синтеза, предоставляемые этими системами. Аминокислоты и другие реактивы получены от этой же фирмы и из других коммерческих источников. Для получения карбоксамидов на C-конце использовалась химическая процедура Вос создания последовательностей с двойными спаренными протоколами и производилось прикрепление к исходной пара-метилбензгидриламидной смоле. Для получения кислот на C-конце применялась соответствующая смола РАМ. Присоединение аспарагина, глутамина и аргинина производилось при помощи ранее образованных гидроксибензтриазоловых эфиров. Все другие аминокислоты присоединялись при помощи ранее образованных симметричных ангидридов Вос аминокислот.

Применялась следующая защита боковой цепи:

Арг, тосил

Асп, бензол

Цис, 4-метилбензол

Глу, бензол

Сер, бензол

Тре, бензол

Тир, 4-бромкарбобензокси

Лиз, 2-хлоркарбобензокси

Снятие защиты Вос производится трифторуксусной кислотой (ТФК) в метиленхлориде. Когда хотят получить аналоги, содержащие гомосерин, нужно включить метионин при помощи твердой фазы, а затем модифицировать цианогенбромидом после расщепления фтористым водородом способами, хорошо известными специалистам. Это отщепление цианогенбромида превращает метионин в лактон гомосерина на C-конце пептида. Обработкой соответствующим амином в таком растворителе, как метанол или диметилформамид, он может быть превращен в гомосеринамидный пептид. C - терминальный гомоСер (лактон), гомоСерOH и гомоСерN(R_a)(R_b) аналоги можно получить способами, раскрытыми в Kempeet al., Bioferhnology, vоl. 4, pp. 565-563 (1986).

После завершения синтеза с пептидов снимают защиту и отделяют их от смолы при помощи безводного фтористого водороводорода, содержащего 10% пара-крезола. Отщепление защитных групп от боковых цепей и пептида от смолы проводится при температуре 0^oC или ниже, предпочтительно при -20^oC в течение 30 минут и в течение следующих 30 минут при 0^oC. После удаления хлористого водорода смолу с пептидом промывают эфиром, пептид экстрагируют ледяной уксусной кислотой и лиофилизируют. Перед очисткой пептиды, содержащие цистеин, подвергают оксидированию надмуравьиной кислотой при температуре в диапазоне от -10^oC до 10^oC, предпочтительно при 0^oC, до получения соединения, содержащего цистеиновую кислоту, как описано Стюартом и соавт., Solid Phase Peptide Synthesis, p. 113, Pieree Chemical Company, Rorkford, Illinois, 1984.

Превращение в C-терминальные лактоны и амиды гомосерина проводится так, как описано выше.

Очистка проводится при помощи ионообменной хроматографии на катионнообменной колонке Synchroprep 8-300 (Synchrom Inc. Linden, Indiana).

Пептид вводится в буфере из 20 миллимолярного Трис (pH 6,8) в 20% ацетонитриле и элюируется градиентом 0-0,3 молярного хлористого натрия в том же растворителе. Дальнейшая очистка соединений и освобождение от соли происходит при жидкостной хроматографии с обращенными фазами на колонке Vydac C-18 (Separation Group, Hesperia, California) при помощи градиента вода/ацетонитрил, содержащих в каждой фазе 0,1 ТФК. Нужные фракции собирают и лиофилизируют, получая трифторуксусную соль заданного пептида ФГР. По желанию трифторуксусная соль может превращаться в другие подходящие соли при помощи хорошо известных ионообменных способов.

Пептиды подвергают гидролизу в вакууме способом фракционного испарения в Pico-Tag Work Station (Waters), пользуясь постоянно кипящей соляной кислотой (Пирс), в присутствии фенола в качестве акцептора при 110^oC в течение 24 часов. Гидролизаты исследуются в аминокислотном анализаторе Бекмана, модель 6300. Содержание пептида вычисляется по норлейцину, который используют как внутренний стандарт, так как концентрация его известна.

Масс-спектрометрию осуществляли масс-спектрометром Applied Biosystems Time of Flight Mass Spectrometer.

Примеры

Пример 1.

Получение соединения N 1 - трифторуксусная соль

Тре² Ала¹⁵ Вал¹⁹ Лей²⁶ бФГР (1-29)NH₂.

Синтез пептида аналога ФГР, имеющего формулу

H-Тир-Тре-Асп-Ала-Иле-Фен-Тре-Асн-Сер-Тир-Арг-Лиз-Вал-Лей-Ала-Глн-Лей-Сер-Вал-Арг-Лиз-Лей-Лей-Глн-Асп-Иле-Лей-Асн-Арг-NH₂ (в виде соли CF₃COOH), проводится способом "шаг-за-шагом" по методике A. Анализ аминокислот (теоретические показатели даны в скобках): Асн 4,06 (4); Тре 1,57 (2), Сер 1,64 (2); Глу 2,10 (2); Ала 2,25 (2); Вал 2,00 (2); Иле 1,68 (2); Лей 5,15 (5), Тир 1,88 (2); Фен 0,94 (1); Лиз 2,00 (2), Арг 2,94 (3).

Пример 2.

Получение соединения N 2 - трифторуксусная соль

Тре² Ала¹⁵ Иле¹⁹ Лей²⁷ - бФГР (1-29)NH₂.

Синтез аналога пептида ФГР, имеющего формулу

H-Тир-Тре-Асп-Ала-Иле-Фен-Тре-Асн-Сер-Тир-Арг-Лиз-Вал-Лей-Ала-Глн-Лей-Сер-Иле-Арг-Лиз-Лей-Лей-Глн-Асп-Иле/Лей-Асн-Арг-NH₂ (в виде соли CF₃COOH), проводится способом "шаг-за-шагом" по методике A. Анализ аминокислот, теоретические показатели даны в скобках: Асп 4,09 (4); Тре 1,98 (2); Сер 1,64 (2); Глу 2,05 (2); Ала 2,25 (2); Вал 1,0 (1); Иле 2,84 (3); Лей 5,07 (5); Тир 1,87 (2); Фен 0,82 (1); Лиз 1,97 (2); Арг 2,94 (3).

Пример 3.

Получение соединения N 3 - трифторуксусная соль

Тре² Ала¹⁵ Лей¹⁹ Лей²⁷ - бФГР (1-29)NH₂.

Синтез аналога пептида ФГР, имеющего формулу

H-Тир-Тре-Асп-Ала-Иле-Фен-Тре-Асн-Сер-Тир-Арг-Лиз-Вал-Лей-Ала-Глн-Лей-Сер-Лей-Арг-Лиз-Лей-Лей-Глн-Асп-Иле-Лей-Асн-Арг-NH₂ (в виде соли CF₃COOH), проводится способом "шаг-за-шагом" по методике A. Анализ аминокислот, теоретические показатели даны в скобках: Асп 4,01 (4); Тре 1,87 (2); Сер 1,72 (2); Глу 2,07 (2); Ала 1,93 (2); Вал 1,04 (1); Иле 1,88 (2); Лей 6,11 (6); Тир 1,90 (2); Фен 0,93 (1); Лиз 2,03 (2); Арг 3,09 (3).

Пример 4.

Получение соединения N 4 - трифторуксусная соль

Вал² Ала¹⁵ Лей¹⁹ Лей²⁷ -бФГР (1-29)NH₂.

Синтез аналога пептида ФГР, имеющего формулу

H-Тир-Вал-Асп-Ала-Иле-Фен-Тре-Асн-Сер-Тир-Арг-Лиз-Вал-Лей-Ала-Глн-Лей-Сер-Лей-Арг-Лиз-Лей-Лей-Глн-Асп-Иле-Лей-Асн-Арг-NH₂ (в виде соли CF₃COOH), проводится способом "шаг-за-шагом" по методике A. Масс-спектральный анализ (методом десорбции плазмы Cf - 252), m/z для [M + H]⁺: наблюдавшийся 3454,6; теоретический 3452,1. Анализ аминокислот, теоретические показатели даны в скобках: Асп 4,01 (4); Тре 0,93 (1); Сер 1,68 (2); Глу 2,03 (2); Ала 2,00 (2); Вал 1,85 (2); Иле 1,88 (2); Лей 6,11 (6); Тир 1,94 (2); Фен 0,94 (1); Лиз 1,97 (2); Арг 3,11 (3).

Пример 5.

Получение соединения N 5 - трифторуксусная соль

Иле²Ала¹⁵Лей¹⁹Лей²⁷-бФГР (1-29)NH₂.

Синтез аналога пептида ФГР, имеющего формулу

Н-Тир-Иле-Асп-Ала-Иле-Фен-Тре-Асн-Сер-Тир-Арг-Лиз-Вал-Лей-Ала-Глн-Лей-Сер-Лей-Арг-Лиз-Лей-Лей-Глн-Асп-Иле-Лей-Асн-Арг-NH₂ (в виде соли CF₃COOH), проводится способом "шаг-за-шагом" по методике A. Масс-спектральный анализ (методом десорбции плазмы Cf-252), m / z для [M + H] : наблюдавшийся 3468,6; теоретический 3466,1. Анализ аминокислот, теоретические значения даны в скобках: Асп 4,02 (4); Тре 0,94 (1); Сер 1,67 (2); Глу 2,05 (2); Ала 2,00 (2); Вал 0,94 (1); Иле 2,83 (3); Лей 6,12 (6); Тир 1,92 (2); Фен 0,95 (1); Лиз 1,99 (2); Арг 3,13 (3).

Пример 6.

Получение соединения N 6 - трифторуксусная соль

Вал²Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷ бФГР (1-29) NH₂.

Синтез аналога пептида ФГР, имеющего формулу

Н-Тир-Вал-Асп-Ала-Иле-Фен-Тре-Асн-Сер-Тир-Арг-Лиз-Вал-Лей- Ала-Глн-Лей-Сер-Иле-Арг-Лиз-Лей-Лей-Глн-Асп-Иле-Лей-Асн-Арг-NH₂ (в виде соли CF₃COOH), проводится способом "шаг-за-шагом" по методике A. Масс-спектральный анализ (методом десорбции плазмы Cf-252), m/z для [M + H]: наблюдавшийся 3453,4: теоретический 3452,1. Анализ аминокислот, теоретические значения даны в скобках: Асп 4,03 (4); Тре 0,94 (1); Сер 1,69 (2); Глу 2,03 (2); Ала 2,04 (2); Вал 1,89 (2); Иле 2,85 (3); Лей 5,11 (5); Тир 1,95 (2); Фен 0,95 (1); Лиз 1,99 (2); Арг 3,08 (3).

Пример 7.

Получение соединения N 7 - трифторуксусная соль

Иле²Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷ - бФГР (1-29) NH₂.

Синтез аналога пептида ФГР, имеющего формулу

Н-Тир-Иле-Асп-Ала-Иле-Фен-Тре-Асн-Сер-Тир-Арг-Лиз-Вал-Лей-Ала-Глн-Лей-Сер-Иле-Арг-Лиз-Лей-Лей-Глн-Асп-Иле-Лей-Асн-Арг-NH₂ (в виде соли CF₃COOH), проводится способом "шаг-за-шагом" по методике A. Масс-спектральный анализ (методом десорбции плазмы Cf-252), m/z для [M + H]⁺: наблюдавшийся 3469,7; теоретический 3466,1. Анализ аминокислот, теоретические значения даны в скобках:

Асп 4,03 (4); Тре 0,94 (1); Сер 1,69 (2); Глу 2,06 (2); Ала 2,04 (2); Вал 0,94 (1); Иле 3,78 (2); Лей 5,12 (5); Тир 1,94 (2); Фен 0,95 (1); Лиз 1,98 (2); Арг 3,09 (3).

Пример 8.

Получение соединения N 8 - трифторуксусная соль

Вал²Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷-бФГР (1-29) NH₂.

Синтез аналога пептида ФГР, имеющего формулу

Н-Тир-Вал-Асп-Ала-Иле-Фен-Тре-Асн-Сер-Тир-Арг-Лиз-Вал-Лей-Ала-Глн-Лей-Сер-Вал-Арг-Лиз-Лей-Лей-Глн-Асп-Иле-Лей-Асн-Арг-NH₂ (в виде соли CF₃COOH), проводится способом "шаг-за-шагом" по методике A. Масс-спектральный анализ (методом десорбции плазмы Cf-252), m/z для [M + H]⁺: наблюдавшийся 3440,6; теоретический 3438,1. Анализ аминокислот, теоретические значения даны в скобках:

Асп 4,02 (4); Тре 0,93 (1); Сер 1,67 (2); Глу 2,08 (2); Ала 2,00 (2); Вал 2,78 (3); Иле 1,86 (2); Лей 5,09 (5); Тир 1,92 (2); Фен 1,04 (1); Лиз 1,98 (2); Арг 3,05 (3).

Пример 9.

Получение соединения N 9 - трифторуксусная соль

Иле²Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷ бФГР (1-29) NH₂.

Синтез аналога пептида, ФГР, имеющего формулу

H-Тир-Иле-Асп-Ала-Иле-Фен-Тре-Асн-Сер-Тир-Арг-Лиз-Вал-Лей- Ала-Глн-Лей-Сер-Вал-Арг-Лиз-Лей-Лей-Глн-Асп-Иле-Лей-Асн-Арг-NH₂ (в виде соли CF₃COOH), проводится способом "шаг-за-шагом" по методике A. Масс-спектральный анализ (методом десорбции плазмы Cf-252), m/z для [M + H]⁺: наблюдавшийся 3454,9; теоретический 3452,1. Анализ аминокислот, теоретические значения даны в скобках: Асп 4,02 (4); Тре 0,93 (1); Сер 1,69 (2); Глу 2,04 (2); Ала 2,06 (2); Вал 1,86 (2); Иле 2,84 (3); Лей 5,10 (5); Тир 1,94 (2); Фен 0,94 (1); Лиз 1,98 (2); Арг 3,07 (3).

Способом "шаг-за-шагом" по методике A также можно получить следующие пептиды:

Иле²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷Сер²⁸ гомоСер³⁰-бФГР(1-30)NH₂

Иле²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³³-бФГР (1-33)NH₂

Иле²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³⁷-бФГР (1-37)NH₂

Иле²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер⁴⁴-бФГР (1-44)NH₂

Вал²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³⁰-бФГР (1-30)NH₂

Вал²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³³-бФГР (1-33)NH₂

Вал²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³⁷-бФГР (1-37)NH₂

Вал²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер⁴⁴-бФГР (1-44)NH₂

Иле²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³⁰-бФГР (1-30)NH₂

Иле²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³³-бФГР (1-33)NH₂

Иле²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³⁷-бФГР (1-37)NH₂

Иле²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер⁴⁴-бФГР (1-44)NH₂

Вал²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³⁰-бФГР (1-30)NH₂

Вал²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³³-бФГР (1-33)NH₂

Вал²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³⁷-бФГР (1-37)NH₂

Вал²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер⁴⁴-бФГР (1-44)NH₂

Тре²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³⁰-бФГР (1-30)NH₂

Тре²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³³-бФГР (1-33)NH₂

Тре²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³⁷-бФГР (1-37)NH₂

Тре²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер⁴⁴-бФГР (1-44)NH₂

Тре²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³⁰-бФГР (1-30)NH₂

Тре²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³³-бФГР (1-33)NH₂

Тре²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³⁷-бФГР (1-37)NH₂

Тре²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер⁴⁴-бФГР (1-44)NH₂

Тре²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³⁰-бФГР (1-30)NH этил

Тре²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³³-бФГР (1-33)NH этил

Иле²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³⁰-бФГР (1-30)NH этил

Иле²Сер⁸Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³³-бФГР (1-33)NH этил

Вал²Сер⁸Ала¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷ Сер²⁸гомоСер³⁷-бФГР (1-37)NH-H-пропил

Методика B

Помимо получения аналогов ФГР твердофазными способами эти аналоги можно получать при помощи рекомбинантной ДНК по методике, описанной для Лей²⁷-бФГР (1-44)OH (Европейская патентная заявка 0212531), со следующими модификациями в сегменте ДНК, кодирующем бФГР (1-44)OH: кодоны Ала², Асн⁸, Гли¹⁵ и Асн²⁸ замещены кодонами, например, (АЦТ) Тре² или (АТТ) Иле², или (ГТТ) Вал², (АГТ) Сер⁸, (ГЦТ) Ала¹⁵, (АГТ) Сер²⁸ соответственно.

Дополнительно, для аналогов ФГР, содержащих цистеиновую кислоту³, кодон ГАТ (Асп³) замещен на кодон ТГТ для Цис³. После экспрессии белка и отщепления цианогенбромидом в муравьиной кислоте, как описано в вышеуказанной европейской патентной заявке, при температуре около 0^oC к раствору добавляется перекись водорода, чтобы окислить остаток Цис до цистеиновой кислоты. Затем пептид очищается описанными способами.

Дополнительно, для аналогов ФГР с удлиненным амино-концом, добавляются следующие сегменты ДНК, кодирующие удлинение амино-конца: (ТАТАЦТ) для Тир-Тре, (ТАТАЦТ)_n для (Тир-Тре)_n или (ТАТАГТ) для Тир-Сер, (ТАТАГТ)_n для (Тир-Сер)_n, или (ТАТАГТТАТАЦТ) для Тир-Сер-Тир-Тре или (ТАТАЦТТАТАГТ) для Тир-Тре-Тир-Сер, (ГАТГЦТ) для Асп-Ала и т.д. и т.п. Ген для белка предшественника встраивается в экспрессирующий вектор E. coli. После экспрессии изолята белка инклюзионных телец и последующего их расщепления цианогенбромидом в муравьиной кислоте, как описано в указанной европейской патентной заявке, муравьиная кислота удаляется в вакууме. Неочищенный пептид в последующем подвергается очистке описанными способами.

Получение соединений, являющихся предметом изобретения, при помощи известных методик с рекомбинантной ДНК возможно потому, что заявленные пептиды целиком состоят из аминокислот, встречающихся в природе. Это отличает их от известных аналогов, содержащих некодирующиеся ДНК компоненты, такие как D-Ала и/или дезаминированный Тир, которые требуют для промышленного производства дорогостоящего химического синтеза или сочетания методов генной инженерии с химическими реакциями.

Рекомбинантный микроорганизм-хозяин, использованный в этом изобретении, создан методами рекомбинантной ДНК, хорошо известными специалистам и изложенными, например, в Molecular Cloning, T. Maniatis et al. Cold Spring Horbor Laboratory (1982), B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons (1984), ссылка на которые дана в этом тексте.

Аналоги с гомоСер (лактона, гомоСерOH и гомоСер N(R_a)(R_b) на C-конце можно получить способами, раскрытыми в Kempe et al. Biotechnology, vol. 4, pp. 565 - 568 (1986).

Методика C

Эта методика относится к получению N-алкилированных аналогов ФГР, описанных в предмете изобретения. Эти пептиды создаются при помощи либо химических, либо биотехнологических методов (методика A или методика B соответственно). После этого N-алкилирование можно производить известными способами, напр. Murphy W.A. and Coy D.H. Pаtent long-acting alkylated aralogs of growth hormone-releasing faсtor, Peptide Research 1, 36 - 41 (1988), V. Sythyamoorthy et al. Reductive methylation of botnlinum neurotoxin types A and B. Mol. Cell Biochem. 83, 65 - 72 (1988).

По методике C можно получить также следующие пептиды:

N-(-iPr-Тир¹Тре²Сер⁸N -- iPr-Лиз^12,21, Вал¹⁵Иле¹⁹Лей²⁷Сер²⁸-бФГР (1-29)NH₂

N -- iPr-Тир¹Тре²Сер⁸N -- iPr-Лиз^12,21, Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷-бФГР (1-40)NH₂

N -- Bz1-Тир¹Тре²Сер⁸N -- Bz1-Лиз^12,21, Вал¹⁵Иле¹⁹Иле²⁷Сер²⁸ -бФГР (1-32)NH₂

N -- iPr-Тир¹Иле²Сер⁸N -- iPr-Лиз^12,21, Ала¹⁵Вал¹⁹Лей²⁷-бФГР (1-40)NH₂

N -- Bz1-Тир¹Вал²Сер⁸N -- Bz1-Лиз^12,21 Вал¹⁵Вал¹⁹Иле²⁷Сер²⁸ -бФГР (1-32)NH₂

Все синтетические пептиды ФГР предмета изобретения, включая пептиды, приведенные в примерах, считаются биологически активными и применимыми для стимуляции секреции ГР гипофизом.

Дозировки в пределах от приблизительно 10 нанограммов до приблизительно 5 микрограммов этих пептидов на килограмм (кг) массы тела считаются особенно эффективными для того, чтобы вызвать секрецию ГР.

Стимуляция секреции ГР такими пептидами должна вызвать заметное увеличение роста у людей, быков и других животных с нормальным уровнем ГР. Более того, введение пептидов должно изменить содержание жира в теле и модифицировать другие метаболические, иммунологические процессы и ход развития организма. Например, эти аналоги могут оказаться полезными как средство стимуляции анаболических процессов у человека при некоторых состояниях, таких как после получения ожогов. В качестве другого примера, эти аналоги могут вводиться теплокровным животным, которых выращивают с коммерческой целью, таким как цыплята, индейки, свиньи, козы, крупный рогатый скот и овцы, и их можно применять в сельском хозяйстве для разведения рыбы и других холоднокровных морских животных, например морских черепах и угрей, и амфибий, для того, чтобы ускорить их рост и повысить соотношение белка к жиру, достигаемые путем скармливания эффективного количества этих пептидов. Эти аналоги можно использовать для стимуляции иммунных функций у человека и животных, для лечения диабета, возникшего в результате нарушения образования гормона роста, или для улучшения заживления переломов, ран или ожогов, или при остеопорозе. Эти аналоги можно применять для усиления роста волос.

Суточные дозировки в пределах от 10 нанограммов/кг до приблизительно 50 микрограммов/кг массы тела считаются особенно эффективными для повышения лактации, роста и стимуляции иммунных функций.

Для введения людям и животным эти синтетические пептиды должны быть очищены, по крайней мере, на 93% и предпочтительно на 98%.

Эти синтетические пептиды или их нетоксические соли, в сочетании с фармацевтически или ветеринарно-приемлемыми носителями для образования фармацевтической композиции предпочтительно в виде препаратов пролонгированного действия, могут вводиться животным, включая людей, внутривенно, подкожно, внутримышечно, чрезкожно, напр. интраназально. Врач может назначить введение этих пептидов для стимуляции секреции ГР, если больному требуется такое лечение. Необходимые дозировки будут варьировать в зависимости от особенностей состояния, по поводу которого назначено лечение, тяжести заболевания и необходимой продолжительности лечения.

Такие пептиды часто вводятся в виде нетоксических солей, таких как кислые сложные соли или комплексы с металлами, напр. с цинком, железом и т. п. (которые рассматриваются как соли в применении к этой заявке). Примерами таких кислых сложных солей являются гидрохлорид, гидробромид, сульфат, фосфат, малеат, ацетат, цитрат, бензоат, сукцинат, малат, аскорбат, тартрат и т. п. Если активный ингредиент нужно вводить внутривенно в изотоническом солевом растворе, можно пользоваться фосфатным буфером или подобными растворами.

Эти пептиды должны вводиться людям по назначению врача, и фармацевтическая композиция обычно должна содержать пептид в сочетании с общепринятым, твердым или жидким фармацевтически приемлемым носителем. Обычно основная дозировка должна составлять от приблизительно 100 нанограммов до приблизительно 50 микрограммов на килограмм массы тела реципиента.

Хотя данное изобретение описано применительно к предпочтительным его воплощениям, необходимо понимать, что различные изменения и модификации, как должно быть очевидно любому специалисту, можно осуществить, не выходя за рамки этого изобретения, изложенные в пунктах формулы изобретения, данных в приложении. Например, модификации в цепи пептида, в частности удаление одного-двух остатков с C-конца пептида, можно произвести в соответствии с известными экспериментальными приемами, чтобы создать пептиды, сохраняющие значительную часть биологической активности этого пептида, и такие пептиды должны рассматриваться как находящиеся в рамках данного изобретения. Более того, можно включить добавки на C-конце и/или на амино-конце, и/или в принципе эквивалентными остатками можно заменить остатки, встречающиеся в природе, как известно из общих приемов химии пептидов, чтобы получить другие аналоги, обладающие повышенной резистентностью к протеолизу, например, и также сохраняющие, по крайней мере, значительную часть активности заявленного полипептида, не выходя за рамки этого изобретения, так, как это иллюстрируют соединения 1 - 15. Таким же образом известные замещения в карбоксильной части на C-конце, например, низшим алкиламидом также дают эквивалентные молекулы.

Таким же образом, как здесь описано, пептиды ФГР формулы



где 4 R" - (X-Y)-(X"-Y)_n, где n - 0 - 20 предпочтительно 0 - 10, X - любая встречающаяся в природе аминокислота, Y - аланин, серин, треонин или пролин, и если n = 0, тогда Y выбирается из группы, состоящей из аланина, серина или треонина, X" - любая встречающаяся в природе аминокислота, кроме пролина или гидроксипролина, R₁ - Тир или Гис, - Ала, Гли, Тре, Вал или Иле, R₃ - Асп, Глу или цистеиновая кислота, R₈ - Асн или Сер, - Лиз или Арг, R₁₃ - Вал или Иле, R₁₅ - Ала, Вал, Лей, Иле или Глн, R₁₈ - Сер или Тир, R₁₉ - Вал или Иле, R₂₁" - Лиз или Арг, R₂₂ - Ала или Лей, R₂₅ - Асп, Глу или цистеиновая кислота, R₂₇ - Мет, Иле или Лей, R₂₈ - Асн или Сер, R₃₄ - Сер или Арг, R₃₅ - Асн или Сер, R₃₈ - Арг или Глн, R₃₉ - Глн или Арг, R₄₀ - Ала или Сер, R₄₂ - Ала, Вал или Фен, и

Z обозначает карбоксильную часть аминокислотного остатка на C-конце и является радикалом -COOR_a, -CR_aO, -CONHNHR_a, -CON(R_a)(R_b) или -CH₂OR_a, где R_a и R_b являются C₁-C₈-алкилом или водородом; или биологически активным фрагментом, распространяющимся от R на амино-конце к любому из остатков, занимающих положение 27 - 44 на C-конце или гомоСер(лактоном), гомоСерOH или гомоСер N(R_a)(R_b) вышеуказанного и/или нетоксическую соль вышеуказанного;

могут быть созданы в соответствии с известными на сегодняшний день экспериментальными приемами, чтобы образовать пептиды, сохраняющие самые существенные части биологической активности пептида, и такие пептиды рассматриваются как другой аспект раскрытого здесь изобретения.

Расширенная часть (R") пептида ФГР, соответствующего представленному изобретению, имеет аминокислотную последовательность, соответствующую формуле

(X-Y)-(X"-Y)_n,

где n представляет количество последовательно связанных X"-Y групп, это количество представлено от 0 до 20 таких групп предпочтительно от 0 до 10 групп;

X избирается из группы, состоящей из любых аминокислот, встречающихся в природе;

Y избирается из группы, состоящей из пролина, аланина, серина и треонина, кроме случаев с n = 0, когда Y избирается из группы, состоящей из аланина, серина и треонина;

X" избирается из группы, состоящей из любых встречающихся в природе аминокислот, кроме пролина и гидроксипролина.

Соответственно этой формуле, когда n=1, имеются два Y остатка. Далее, в одном воплощении может быть до двадцати одного Y остатка и двадцати X" остатков. Отдельные Y остатки и X" остатки соответственно могут быть любым остатком группы, из которой они избираются. То есть все эти отдельные Y остатки не должны быть одними и теми же в данном воплощении. Таким же образом в воплощении, содержащем более одного X" остатка, каждый отдельный остаток X" в молекуле может быть остатком любой аминокислоты, кроме пролина и гидроксипролина, безотносительно того, какими остатками могут быть другие X" остатки. Каждый отдельный остаток Y и X соответственно должен соответствовать правилам, установленным для этой частной группы, и необходимо только, чтобы различные отдельные остатки в конкретных положениях следовали правилам, оговоренным выше.

Рисунок 1

Действие аналогов Тре²Ала¹⁵Лей²⁷-бФГР (1-29)NH₂ на секрецию гормона роста (ГР) в культуре клеток гипофиза крысы in vitro. Анализ производили по методике Frohman and Downs, Methods Enzymol. 124, 371-389 (1986).

Отметьте, что замещение Лей¹⁹ снижает способность аналога стимулировать секрецию ГР, тогда как модификации Вал¹⁹ и Иле¹⁹ либо усиливают, либо оставляют неизменной биоактивность аналогов по сравнению с Тре²Ала¹⁵Лей²⁷-бФГР (1-29)NH₂, Лей²⁷-бФГР (1-29)NH₂ служил стандартом в этом анализе.

По оси абсцисс - концентрации аналогов в нМ.

По оси ординат - концентрация ГР крыс в нг/на лунку /за 4 часа.

Рисунок 2

Средняя концентрация гормона роста (ГР) в сыворотке у быков породы Голстейн на мучном вскармливании после внутривенной инъекции (10 пмоль/кг) аналогов ФГР. Анализ производился по методике, описанной Moseley et al. J. Endocrinol, 117, 252-9(1988).

Бычий ФГР (1-44) NH₂ использовался в качестве стандарта для этого анализа.

По оси абсцисс - время в минутах.

По оси ординат - ГР сыворотки (нг/мл).

Справа от графика надпись: соединение.