штамм kluyveromyces marxianus var. bulgaricus t₃ - продуцент супероксид дисмутазы и сопутствующих ферментов

Формула изобретения

Штамм Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus T₃ - 1984 (Коллекция Национального банка промышленных микроорганизмов и клеточных культур национального биотехнологического центра, Болгария, София) - продуцент супероксиддисмутазы и сопутствующих ферментов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и касается микробиологических методов получения ферментных препаратов, а более конкретно способов получения супероксиддисмутазы и сопутствующих ферментов.

Супероксиддисмутаза является металлопротеином и представляет существенный практический интерес в связи с широко проводимыми исследованиями по использованию этого фермента в медицине и пищевой промышленности.

Наиболее известные источники супероксиддисмутазы - эритроциты крови [1] и такие животные ткани, как печень, почки, легкие, сердце, мозг и другие [2] .

Вместе с тем известно и то, что супероксиддисмутаза может быть получена и микробиологическим путем с использованием таких микроорганизмов, как Pseudomonas putida [3], Nocardopsis [4], Gluconobacter [5], Saccharomyces cerevisiae [6], рекомбинантные штаммы E. Coli [7].

Приходится констатировать, однако, что микробиологические методы не нашли пока промышленного применения и используются только в лабораторных условиях.

Поставленная заявителем цель - изыскание штамма-продуцента супероксиддисмутазы, пригодного для осуществления крупномасштабного производства этого фермента в производственных условиях.

Заявитель также имел в виду, что ферментные препараты, получаемые из разных природных источников, могут весьма отличаться по некоторым свойствам.

В результате длительной поисковой и селекционной работы заявителем был выделен и идентифицирован штамм T₃ дрожжей Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus, обладающий искомыми свойствами.

Впервые выделенный заявителем штамм-продуцент супероксиддисмутазы оказался способным накапливать количества супероксиддисмутазы, достаточные для организации рентабельного ее производства, проявил способность активно развиваться и биосинтезировать комплекс ферментов при выращивании на отходах молочного производства, показал умеренную термофильность.

Наиболее ценным качеством вновь выявленного продуцента была способность синтезировать супероксиддисмутазу с повышенной устойчивостью к высоким температурам.

Полученный заявителем новый штамм Kluyveromyces marxianus var.bulgaricus T₃ депонирован в Национальном банке промышленных микроорганизмов и клеточных культур Национального биотехнологического центра Болгарии под регистрационным номером 1984.

Штамм выделен из сыра и характеризуется следующими признаками.

Рост на солодовом экстракте 15 Б: в процессе роста образует осадок; клетки имеют размеры 0,05-0,1 х 0,2 мкм; размножение осуществляет почкованием.

Рост на солодовом агаре 10 Б: при выращивании при 28^oC за 3-5 дней образуются гладкие колонии с матовой поверхностью, белого цвета, мягкой консистенции, вогнутые, с неровным центром и гладкими краями.

Образование аскоспор: образует 1-2-4 сферические аскоспоры, расположенные по-отдельности или тетрадами на ацетатном агаре, агаре Mc Clari и на солодовом агаре.

Образование псевдомицелл: псевдомицелл не образует.

Образование хламидоспор: на кукурузном и рисовом агаре хламидоспор не образует.

Толерантность к хлористому натрию: устойчив к 8-9 хлористого натрия.

Биохимические характеристики: ферментация сахаров - ферментирует глюкозу, галактозу, сахарозу (100%) и не ферментирует мальтозу, лактозу, раффинозу.

Ассимиляция сахаров - ассимилирует глюкозу, галактозу, сахарозу, лактозу, раффинозу, инулин, D-ксилозу, D-арабинозу, этанол, L - молочную кислоту.

Ассимиляция нитрата калия - не ассимилирует.

Рост на безвитаминных средах - не растет на безвитаминных средах; нуждается в никотиновой кислоте.

Образование пигментов - пигментов не образует.

Расщепление арбутина - арбутин не расщепляет.

Рост на 50%-ном глюкозном агаре - рост отсутствует.

Температура роста - минимальная 5-6^oC, оптимальная 35-42^oC, максимальная 50^oC.

Штамм не показал высокой требовательности к условиям культивирования и оказался способным расти на сравнительно простых средах, используя как основу отходы молочного производства, что частично следует из данных табл.1.

Исходная питательная среда содержала 50 мл фильтрата молочной сыворотки и 50 мл дистиллированной воды и обогащалась компонентами среды Ридера. Начальная концентрация лактозы составляла 16,4 мг/мл. Культивирование проводилось при 40^oC и продолжалось 20 ч.

Полученные результаты показывают, что рост культуры на разведенном вдвое фильтрате молочной сыворотки лимитируется лишь источником азота, а в остальных компонентах среды Ридера не нуждается.

Предложенный штамм показал выраженную зависимость от наличия в среде никотиновой кислоты и это его свойство подтверждается данными табл. 2.

Культивирование проводили на полной среде Ридера, приготовленной на разведенном вдвое фильтрате молочной сыворотки. Начальная концентрация лактозы составляла 16,4 мг/мл. Выращивание продолжалось 20 ч при 40^oC.

Хорошо видно, что нелимитированный рост имеет место лишь при концентрации никотиновой кислоты порядка 75 мкг/100 мл. Однако было показано, что потребность клеток в никотиновой кислоте может быть полностью удовлетворена при введении в ростовую среду до 20% фильтрата дрожжевого гомогената, получаемого при отделении клеточного дебриса.

Параллельно с биосинтезом супероксиддисмутазы штамм биосинтезирует такие сопутствующие ферменты, как бета-галактозидаза и каталаза, которые также представляют практический интерес.

Супероксиддисмутаза, получаемая с помощью предложенного штамма, обладает оригинальными свойствами, отличающими ее от препаратов супероксиддисмутазы, выделяемых из других природных источников, и это показано в табл. 3.

Необходимо отметить, что и накопление предложенным штаммом сопутствующих ферментов - каталазы и бета-галактозидазы - достаточно высоко и составляет примерно 8-10 E/мин/мг и 0,750 E/мин/мг соответственно.

Сущность предложения дополнительно поясняется нижеприведенным примером.

Пример. Штамм Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus T₃выращивали на ультрафильтрате молочной сыворотки - отходе производства молокоперерабатывающего предприятия в г. Силистра. Предварительно сыворотку прогревали при pH 7,3 и подвергали ультрафильтрации через мембрану с размером пор 5 kD. Ультрафильтрат молочной сыворотки был обогащен никотиновой кислотой из расчета 75 мкг никотиновой кислоты на каждые 100 мл среды.

Выращивание проводили в ферментере с рабочим объемом 4 л при температуре 35 градусов, pH 5,0 и pO₂ 30-40% в течение 30 ч. Значение pH поддерживали с помощью 10%-ного раствора гидроксида аммония.

Динамика накопления супероксиддисмутазы и сопутствующих ферментов показана в табл. 4. Активность ферментов определяли в фильтрате разрушенных клеток.

По мнению заявителя, предлагаемый штамм является оригинальным и имеет существенные преимущества перед известными штаммами-предуцентами супероксиддисмутазы.