способ получения гибрида днк-рнк, обладающего иммунотропной противовирусной активностью

Формула изобретения

Способ получения гибрида ДНК-РНК, обладающего иммунотропной противовирусной активностью, путем обработки исходного материала, отличающийся тем, что клеточный материал из молок осетра гомогенизируют, обрабатывают детергентом, осаждают белок, очищают от примесей, инкубируют в течение 20 - 90 мин при давлении 1,5-2 атм, температуре 105-115^oС и рН 8,5-9,0, сбрасывают давление и инкубируют продукт при 55-60^oС и рН 5,5-7,5 в течение 1-4 ч с последующим осаждением и промывкой спиртом.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и биологии и касается способов получения гибридов ДНК-РНК, обладающих биологической активностью.

Известен способ получения гибрида путем смешивания растворов ДНК и РНК в формальдегиде в определенных температурных условиях. Полученный гибрид не обладает выраженной биологической активностью, а создание гибрида осуществляют в основном с аналитической целью. Кроме того, в условиях высокой концентрации формальдегида возможна модификация ДНК по первичным аминогруппам [3], ведущая к потере специфической активности и мутагенности.

В настоящее время известен способ достижения антивирусной иммуномодулирующей активности препарата ДНК [9] путем ее модификации через преобразование ее в апуриновую или апиримидиновую кислоты, то есть производные ДНК, лишенные в первом случае апуриновых, а во втором - пиримидиновых оснований.

В соответствии со способом апуриновую кислоту получают из препарата ДНК в кислой среде термолизином.

Получаемые при этом апуриновые кислоты имеют олигомерный характер с молекулярной массой, не превышающей 1519 CD [2, 3]. Кроме того, известно, что ДНК денатурирует в этих условиях. Оба фактора отрицательно влияют на биологическую активность ДНК.

В соответствии с тем же способом при получении апиримидиновой кислоты путем щелочного гидролиза либо с помощью гидразинолиза препаратов ДНК происходит денатурация и деструкция длинноцепочечной структуры, а там же превращение пуринов в их производные.

Таким образом конечное соединение частично теряет пуриновые основания или частично пуриновые основания трансформируются в производные.

Такие соединения не могут считаться перспективными в качестве лекарственных препаратов, так как они содержат мутации, не являются однородными по составу и таким образом не обеспечивают стабильный и воспроизводимый фармакологический эффект.

Указанных недостатков лишен препарат ДНК, получаемый согласно изобретению, не обладающий цитотоксичностью, но имеющий выраженную иммуностимулирующую активность.

Сущность изобретения состоит в том, что для получения гибрида целевой продукт из молок осетра, полученный известным способом [7], перед осаждением в спирт, дополнительно инкубируют в течение 20-90 мин при давлении 1,5-2 избыточных атмосферы, температуре 105-115^oC и pH 8,5 - 9,0. Затем давление сбрасывают, pH доводят до значения 5.5-7,5 и раствор инкубируют при 55-60^oC в течение 1-4 ч, после чего проводят выделение путем осаждения и последующей многократной промывкой спиртом.

Полученный продукт представляет собой натриевую соль гибрида ДНК с РНК, содержащего 0,5 - 5,0% комплементарно связанной РНК. Содержание основного вещества в продукте в пересчете на ДНК - не менее 80%; содержание белка - не более 1,5%.

Продукт представляет собой белый порошок, хорошо растворимый в воде и физиологическом растворе.

Гибридная структура полученного продукта подтверждена тестами с РНКазой [5].

Существенными признаками изобретения следует считать инкубацию при определенном технологическом режиме и значениях pH.

Данные признаки - существенные, поскольку использование их в совокупности позволяет получить вещества, обладающие широким спектром биологической активности.

Для раскрытия сущности изобретения приведены результаты экспериментальных исследований по изучению фармакологической активности, средства полученного предлагаемым способом.

1. Исследования по определению анти-ВИЧ активности средства, полученного заявленным способом

1.1. Материалы и методы: Использовали перевиваемую человеческую лимфобластную линию клеток H9 в концентрации 0,3510⁶ клеток в 1 мл. Клетки культивировали в среде сыворотки 300 мкг/мл J-глютамина, 100 мкг/мл генталицина, 10 мМ HEPES-буфера и выращивали в виде суспензии.

Аналогичным образом культивировалась клеточная линия H9/III B, инфицированная ВИЧ.

Определение количества клеток, экспрессирующих антигены ВИЧ, проводили по методике Coons A.H. (J.Exp.Ved 1985 vol. 102, p.49) с использованием сыворотки больного СПИД, содержащего антитела к ВИЧ.

Для инфицирования клеток использовали концентрат культуральной жидкости клеток H9/III B, полученный при центрифугировании материала через градиент 20% сахарозы при 24 000 об/мин.

1.2. Результаты исследований.

Для определения ингибирующего действия полученного вещества на репликацию ВИЧ использовали суспензию перевиваемой лимфобластоидной линии клеток H 9.

Клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием при 100 об/мин в течение 10 мин, а затем ресуспендировали в концентрации 510⁵ клеток/мл в свежей питательной среде, содержащей различные дозы исследуемого вещества.

Перед внесением в культуру клеток вещества, их инфицировали ВИЧ. Клетки отмывали три раза в чистой среде RPMI-1640 центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. Полученный осадок клеток ресуспендировали в ростовой среде и инкубировали 72 ч при 37^oC.

По окончании инкубации проводили отделение клеток от культуральной жидкости при аналогичном режиме центрифугирования и определяли в них наличие вирусоспецифического антигена методом иммуфлюоресценции (ИФ).

Результаты исследований представлены в табл. 1 (для контроля представлены литературные данные по РНК) [6].

Из представленной табл. 1 видно, что полученное средство в диапазоне концентраций 50 - 100 мкг/мл обладает противовирусным действием в отношении вируса СПИД. Причем эта активность превышает таковую у РНК.

2. Исследование иммунологической активности полученного средства.

2.1. Влияние на аллергические реакции замедленного типа. Исследовали влияние заявленного препарата на реакцию бласттрансформации лимфоцитов (РБЛ) спонтанную и ФГА - стимулированную. Для получения культуры лимфоцитов использовали общепринятый метод, описанный М.М.Авербахом [1]. Исследуемый препарат вносили в культуру в различных концентрациях и далее термостатировали в течение 4-х суток [8].

Подсчет трансформрованных клеток проводили в мазках под микроскопом и выражали величину РБЛ в % [8].

Результаты исследований представлены в таблице.

Из представленной табл. 2 видно, что исследуемый препарат обладает иммунстимулирующим действием. Он усиливает как спонтанную, так и ФГА-стимулированную РБЛ.

Из представленных данных видно, что полученное заявленным способом средство обладает способностью тормозить рост вирусов. Причем препарат эффективен в отношении вирусов гриппа, аденовирусов и герпес-вирусов.

В целом анализ экспериментальных данных позволяет сделать следующие выводы.

Полученное средство обладает иммуностимулирующим и противовирусным действием (эффективен против вируса СПИДа, гриппа, герпеса и в отношении аденовирусов).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 1,2 кг свежезамороженных молок осетра измельчают и гомогенизируют в 2 л цитратно-солевого раствора, состоящего из 0,15 М хлористого натрия и 0,0021 М цитрата натрия при комнатной температуре. Полученный гомогенат заливают в реактор, где находится 34 л цитратно-солевого раствора. Затем добавляют 4 л 6%-ного раствора додецилсульфата натрия в 45% растворе реактификата этилового спирта (240 г в 4 л 45% спирта).

Полученную реакционную массу нагревают в течение 1-1,5 ч. до 60-65^oC и выдерживают при этой температуре 1,5 ч. при перемешивании якорной мешалкой. После чего в раствор добавляют 40 л 5 М раствора хлористого натрия и перемешивают в течение 1,5 ч. Затем полученную реакционную массу охлаждают до 12-16^oC, перемешивают с кизельгуром в соотношении 10;1 мешалкой и фильтруют на нутч-фильтре.

Полученный фильтрат высокополимерной ДНК порциями в количестве 2,5 л подвергают электродиализному концентрированию в многокамерном аппарате-электродиализаторе фильтрпрессного типа, состоящего из чередующихся мембран типа МА-40 и МК-40 с промежуточным рамками из паронита и сепараторами-турбулизаторами. Катодом служит пластина из нержавеющей стали марки X18H10T с рабочей поверхностью 4 дм², анодом - платинированный титан с той же поверхностью.

Электродиализатор состоял из 7 камер "обессоливания" и 8 камер "концентрирования", а также двух электродных камер. Рабочая поверхность каждой мембраны 4 дм².

Реакционную массу высокополимерной ДНК насосом прокачивают через камеры "обессоливания" электродиализатора с линейной скоростью 2,3 см/с, одновременно через камеры "концентрирования" насосом прокачивают 0,5%-ный раствор хлористого натрия, а через электродные камеры - водопроводную воду. При 15-20^oC через электродиализатор пропускают постоянный ток, сила которого соответствует плотности тока 1,5 А/дм². В ходе электродиализа поддерживают pH раствора в интервале 6,5-7,5 добавлением разбавленной соляной кислоты (1: 3). Поддержание температуры в процессе электродиализа осуществляют подачей захоложенной воды в змеевике промежуточных емкостей. В процессе электродиализного концентрирования получают 1,2 л высокополимерной ДНК. Продолжительность процесса составляет 4,0 ч., удельная производительность аппарата - 1,0 л/м²хч, а энергоемкость процесса 216,0 Втхч/л. При этом выход по току составляет 70,0%. Сконцентрированный раствор высокополимерной ДНК заливают в модуль магнитостриктора и подвергают ультразвуковой обработке в течение 45 мин, после чего фильтруют в 3 раза на установке "БИОКОН". Далее продукт инкубируют в течение 20 мин при давлении 1,5 избыточных атмосферы, температуре 105^oC, pH 8,5, постепенно сбрасывают давление и далее инкубацию проводят при 55^oC и pH 5,5 в течение 1 ч. Далее продукт высаждают спиртом, осадок и высушивают.

Полученный белый порошок проанализирован. Он представляет собой натриевую соль гибрида ДНК с РНК, содержит 0,5 комплиментарно связанной РНК. Содержание основного вещества в продукте в пересчете на ДНК - 80%, содержание белка - 0,5%.

Гибридная структура полученного продукта подтверждена тестами и РНКазой.

В фармакологических и вирусологических исследованиях выявлена иммунотропная и антивирусная активность препарата в отношении ряда вирусов (ВИЧ, аденовирусы, герпес, грипп).

Пример 2. 1,2 кг свежезамороженных молок осетра измельчают и гомогенизируют в 2 л цитратно-солевого раствора, состоящего из 0,15 М натрия хлорида и 0,0021 М натрия цитрата при комнатной температуре. Полученный гомогенат заливают в реактор, где уже находится 34 л цитратно-солевого раствора. Затем добавляют 4 л 6% раствора натрия додецилсульфата в 45% растворе ректификата этилового спирта (240 г в 4 л 45% спирта). Полученную массу нагревают за 1-1,5 ч. до 60-65^oC и перемешивают якорной мешалкой в течение 1,5 ч. Затем добавляют 40 л 5 М раствора NaCl и перемешивают в течение 1,5 ч. Затем полученную массу охлаждают до 12-16^oC, перемешивают с кизельгуром в соотношении 10:1, на высокооборотной мешалке (миксер) и фильтруют на нутч-фильтре, фильтрующий материал: бельтинг, фильтровальная бумага, бязь.

Полученный таким образом фильтрат высокополимерной ДНК-Na концентрируют в камерах электродиализной установки.

После этого раствор заливают в модуль магнитострикта и озвучивают в течение 40 с, после чего фильтрат через миллипоровый фильтр, концентрируют в 3 раза на установке "Биокон".

Далее продукт инкубируют 90 мин при давлении 2 избыточных атмосферы, температуре 115^oC и pH-9,0, далее сбрасывают давление и инкубируют продукт при 60^oC, pH-7,5 в течение 4-х ч. Далее продукт высаждают спиртом, осадок собирают центрифугированием, промывают 96%-ным спиртом и высушивают.

Полученный белый порошок проанализирован. Он представляет собой натриевую соль гибрида ДНК и РНК, содержит 5,0% комплиментарно связанной РНК. Содержание основного вещества в продукте в пересчете на ДНК-90%, содержание белка - 1,5%. Гибридная структура полученного продукта подтверждена тестами с РНКазой.

В иммунологических и вирусологических исследованиях выявлена иммунотропная и антивирусная активность препарата в отношении ряда вирусов (ВИЧ, аденовирусы, герпес, грипп).

Из представленной табл. 4 видно, что введение препарата нормализует соотношение T_х/T_с, что является положительным прогностическим показателем при СПИДе и СПИД-ассоциированном симптомокомплексе.

В дальнейшем было изучено иммунотропное действие препарата в опытах in vivo.

Интактным кроликам однократно или в течение недели вводили изучаемый препарат. Исследовали реакцию бласттрансформацию лимфоцитов, спонтанную и ФГА-стимулированную [8]. Результаты эксперимента представлены в табл. 5.

Таким образом, из представленной табл. 5 видно, что заявленный препарат в опытах in vivo стимулирует иммунитет, причем более выражено при курсовом введении по сравнению с однократным.

Сущность изобретения поясняется следующим примером.

Пример 3. Для приготовления фармацевтического препарата 0,5 г субстанции, полученной заявленным способом, растворили в 99,5 мл дистиллированной воды или физиологического раствора.

Препарат представляет собой прозрачную жидкость.

Препарат исследован на анти-ВИЧ и иммунотропную активность.

При введении препарата ВИЧ-инфицированным больным наблюдали улучшение прогностического показателя - соотношения T_х/T_с. Оно увеличилось с 0,67 до 1,41.

В опытах in vivo введение препарата кроликам однократно способствовало увеличению показателей спонтанной и ФГА-стимулированной РБЛ. Так, спонтанная РБЛ увеличилась при однократном введении с 0,11 до 3,8, а при курсовом - с 0,11 до 4,2.

ФГА-стимулированная РБЛ повысилась с 3,0 до 10,9 при однократном введении и до 18,9 - при многократном.

Таким образом, представленный пример иллюстрирует иммунотропную и противовирусную активность препарата.

Пример 4. Для приготовления фармацевтического препарата 6,0 г субстанции, полученной заявленным способом и содержащей гибрид ДНК-РНК, растворяют в 94,0 мл дистиллированной воды или физиологического раствора.

Препарат представляет собой прозрачную жидкость, срок хранения 2 г.

Препарат исследован на анти-ВИЧ и иммунотропную активность.

При введении препарата ВИЧ-инфицированным больным наблюдали улучшение прогностического показателя - соотношение T_х/T_с увеличивалось с 0,62 до 1,42.

В опытах in vivo введение препарата кроликам однократно способствовало увеличению показателей спонтанной и ФАГ-стимулированной РБЛ. Так, спонтанная РБЛ увеличилась при однократном введении с 0,12 до 3,4, а при курсовом - с 0,15 до 4,8.

ФГА-стимулированная РБЛ повысилась с 3,1 до 11,2 при однократном введении и до 20,1 - при курсовом.

Таким образом, представленный пример иллюстрирует иммунотропную и противовирусную активность заявленного средства.

Сравнение результатов собственных исследований с литературными данными по изучаемому вопросу позволило охарактеризовать получение способом средство следующим образом (см. табл. 6).

Препарат, полученный заявленным способом, обладает широким спектром фармакологической активности, включающим иммунотропную и противовирусную активность.

Препарат нетоксичен, не вызывает побочных эффектов.

Он может быть перспективен для широкого использования в медицинской практике.

Список литературы

1. Авербах М.М. Повышенная чувствительность замедленного типа и инфекционный процесс.- М.: Медицина, 1974.

2. Кочетков Н.К. и др. Химическая модификация нуклеиновых кислот. Доклады АН СССР, Серия биология, т. 168, N 1. с. 102-103.

3. Оболенская М.Ю. Гибридизация нуклеиновых кислот в растворах формамида с высокой концентрацией, Молекулярная биология, Киев 1982, вып. 31. с. 27-32.

4. Оболенская М.Ю. и др. Некоторые методические особенности молекулярной гибридизации РНК и ДНК, Молекулярная биология, Киев 1979, с. 45-55.

5. Спигелман С. Гибридные нуклеиновые кислоты. В кн.: Молекулы и клетки. М., 1966, вып. 1, с. 49-63.

6. Фундаментальные и прикладные вопросы проблемы СПИД, Сборник научн. трудов, М., 1988.

7. Заявка организации-заявителя N 93-020155 / 14 на "Способ получения ДНК из молок осетровых рыб" положительное решение от 26.10.93.

8. Nowell P.C. Cancer Res, 1960, vol. 20, p. 462-466.

9. Патент DE 3724951 кл. C 07 H 21/04, 1989.