способ выделения немицеллярных транспортных форм холестерина из желчи

Формула изобретения

Способ выделения немицеллярных транспортных форм холестерина из желчи путем обработки сырья с последующим отделением целевого продукта, отличающийся тем, что в желчь нагнетают воздух до пенообразования и с поверхности желчи собирают пену, содержащую везикулярные и ламеллярные частицы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биологии и медицины, в частности к способам препаративной биохимии, и может быть использовано для выделения холестеринсодержащих транспортных частиц из биологических жидкостей.

Известные способы выделения транспортных форм холестерина из биологических жидкостей осуществляются путем ультрацентрифугирования, гель-фильтрации и осаждения (см. сб. Липопротеиды высокой плотности и атеросклероз. М.: Медицина 1983, с. 45, а также Клиническая лабораторная диагностика, 1992, N 1-2, М.; Медицина с.7).

Однако условия реализации способов не позволяют сохранять структуру выделяемых частиц в интактном состоянии из-за больших центробежных сил, высоких концентраций солей, многоэтапности и длительности обработки, достигающих 19 ч. и более. Кроме того, указанные способы не обеспечивают полного разделения транспортных форм холестерина желчи (см., например, Бюлл. эксперим. биол. и мед. М.: Медицина 1989, N 8, с. 251).

Известен способ выделения везикулярных транспортных форм холестерина из желчи, заключающийся в обработке желчи раствором дигитонина и помещении ее в центробежное поле (см. авт. св. N 1677631 от 15.05.91). Суммарное время необходимое для осуществления способа, сокращено до 90 мин.

Существующий способ не обеспечивает выделения всех морфологических вариантов немицеллярных транспортных частиц холестерина, а предназначен для получения одной (везикулярной) транспортной формы. При этом нельзя исключить дестабилизирующего действия дигитонина на динамическую структуру липидного бислоя как немицеллярных транспортных форм, так и смешанных мицелл. Кроме того, для реализации способа требуется наличие ультрацентрифуги, дорогостоящего импортного реактива и затраты времени на многоэтапную процедуру выделения: освобождение от возможных примесей, разведение желчи трио-буфером, центрифугирование при 6000 об/мин, инкубация желчи с дигитонином, получение осадка с помощью ультрацентрифугирования.

Целью изобретения является упрощение и ускорение процесса выделения немицеллярных (везикулярных и ламеллярных) транспортных форм из желчи, исключающее многоэтапность обработки и использование каких-либо дестабилизирующих агентов или центробежных сил.

Поставленная цель достигается приданием положительной плавучести холестерин-транспортным частицам путем вспенивания желчи, которая осуществляется продувкой через желчь атмосферного воздуха. В результате пенообразования производится концентрирование немицеллярных транспортных форм холестерина в составе пены и последующее отделение сконцентрированных форм непосредственно с пеной в отдельную емкость. Индикатором завершения процесса выделения транспортных форм служит прекращение пенообразования.

Пример. С помощью бытового компрессора "ВК-1" или резиновой груши, соединенных с пастеровской пипеткой, нагнетают воздух в желчь, вызывают пенообразование желчи и собирают пену в отдельный сосуд. Полученный из пены раствор ресуспендируют в фосфатном буфере (pH 7,2) и производят идентификацию выделенных частиц с помощью трансмиссионной электронной микроскопии, а также проводят анализ частиц на содержание холестерина. Суммарное время, необходимое для выделения немицеллярных транспортных форм холестерина предлагаемым способом, составляет от 30 с до 5 мин, в зависимости от требуемого объема получаемого материала.

На электронной микрофотографии (см. фиг. 1) представлены две морфологические разновидности немицеллярных транспортных форм холестерина, выделенных из желчи предлагаемым способом. К ним относятся везикулярные и ламелярные частицы. Поперечные размеры частиц составляют от 25 до 150 нм, что совпадает с данными литературы (Бюлл. эксперим. биол. и мед., 1989, N 8, с. 251). Все частицы равномерно рассеяны в поле зрения на пленке-подложке, они располагаются автономно и имеют четкие контуры, что свидетельствует о щадящем режиме их выделения.

При сопоставлении микрофотографий частиц, полученных с использованием прототипа (см. фиг. 2) и предлагаемым способом см. фиг. 1) видно, что транспортные формы холестерина на микрофотографии (см. фиг. 2) представлены одним морфологическим вариантом, а именно - везикулярными частицами. При этом везикулы часто деформированы, не имеют правильной конфигурации и четких контуров. Многие частицы находятся в агрегированном состоянии, размеры агломератов в поперечнике достигают 200 нм и более. Агломераты везикул неравномерно распределены на поверхности пленки-подложки.

Содержание холестерина в частицах при том и другом способах выделения составило в среднем 0,35 мМ/л.

Из сопоставления морфологии частиц, их размеров, конфигурации, характера локализации и распределения на пленке-подложке, а также способности к слипанию и образованию агрегатов следует, что предлагаемый способ по получаемому результату является более адекватным способом выделения немицеллярных транспортных форм холестерина, чем прототип.

Изобретение позволяет добиться большей эффективности выделения транспортных форм холестерина из желчи при минимальных затратах времени (0,5-5 мин, вместо 90 мин по прототипу) и обеспечивает высокую степень сохранности транспортных форм при выделении.