Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

очищенный фолликулостимулирующий гормон (фсг), фармацевтическая композиция, компонент фармацевтической композиции

Классы МПК:C07K14/59 гормон, стимулирующий фоликулы (ФСГ); хорионные гонадотропины, например ХСГ; гормон лютеинизации (ГЛ); гормон стимулирующий щитовидную железу (ГСТ)
C12N15/16 гормоны
A61K38/24 фолликулостимулирующий гормон (FSH); хорионные гонадотропины, например HCG, лютеинизированный гормон (LH); тироидостимулирующий гормон (TSH)
Автор(ы):, , ,
Патентообладатель(и):Институто ди Ричерка Чезаре Сероно С.п.А. (IT)
Приоритеты:
подача заявки:
1988-06-24
публикация патента:

Использование: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), имеющий очищенный фолликулостимулирующий гормон (фсг),   фармацевтическая композиция, компонент фармацевтической   композиции, патент № 2105012-субъединицу гонадотропина и очищенный фолликулостимулирующий гормон (фсг),   фармацевтическая композиция, компонент фармацевтической   композиции, патент № 2105012-субъединицу из 111 аминокислот, выделен из климактерической мочи. ФСГ свободен от лютеинирующего гормона, имеет активность не менее 6200 международных единиц ФСГ на мг лиофилизиpованного порошка, гликозилирован. Выделенный ФСГ использован в фармацевтической композиции, пригодной для подкожного введения. 3 с. и 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 ил.

Рисунки к патенту РФ 2105012

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3

Настоящее изобретение относится к мочевому фолликулостимулирующему гормону и фармацевтической композиции, содержащей его.

Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), как известно, применяется при лечении бесплодия. Препараты, содержащие данный гормон, используются для поддержания беременности с использованием методик in vivo и in vitro. Человеческий ФСГ выделен из гипофиза и постклимактерической мочи человека. Совсем недавно ФСГ получен методом рекомбинантной ДНК.

Первые коммерчески доступные препараты, включающие человеческий ФСГ (например, Пергонал(R) Сероно), содержали ЧМГ, то есть человеческий менопаузный гонадотропин, представляющий собой смесь ФСГ, лютеинизирующего гормона (ЛГ) и других мочевых белков. Между тем были сделаны попытки получить чистые ФСГ-препараты как для научных, так и для терапевтических целей. Продукт Метродин(R) (Сероно), в настоящее время имеющийся в продаже, представляет собой препарат мочевого ФСГ, содержащий другие мочевые белки, однако минимальные количества ЛГ, и используется для лечения бесплодия. Применение данного продукта особенно благоприятно, когда нежелательно вводить экзогенный ЛГ вместе с ФСГ, например, при синдроме поликистоза яичников (СПЯ).

До сих пор введение ФСГ для терапевтических целей осуществляли, и успешно, исключительно путем внутримышечной инъекции. Поскольку внутримышечные инъекции, как правило, осуществляют врачи или люди из числа профессиональных медиков, пациенту приходится регулярно посещать хирургический кабинет или больницу. Это означает значительное неудобство. Кроме того, время, необходимое для осуществления данного типа введения лекарственных веществ, обычно растягивается на несколько недель или даже месяцев.

Введение путем подкожной инъекции могло бы обеспечить возможность самовведения препарат пациентом.

Подкожное введение человеческого менопаузного гонадотропина (ЧМГ) уже было описано (Nakamura Y. et al., Fertility and Sterility 46 (1), стр. 46-54, 1985) в связи с лечением женского бесплодия путем пульсирующего введения его подкожным перистальтическим насосом. Подкожное введение ЧМТ может иметь такой недостаток, как местная аллергия, вызываемая примесями в используемом продукте.

P. Roos (Acta Endocrinologica Supplementum, 131, 1968) описал и охарактеризовал высокоочищенные препараты гипофизарных и мочевых ФСГ, полученные из замороженных гипофизов и из постклимактерического мочевого концентрата, соответственно. Биологические активности составляют около 14000 международных единиц активности на мг для гипофизарного ФСГ и 780 международных единиц активности на мг мочевого ФСГ. Содержание примесей ЛГ в большинстве активных гипофизарных и мочевых препаратов соответствует приблизительно 0,1% по массе. Методики очистки включают один или более таких способов, как хроматография на диэтиламиноэтилцеллюлозе, гель-фильтрация на Сефадекс G-100, гидроксилапатитовая хроматография, электрофорез в полиакриламидном геле и подобное.

Один из наиболее очищенных препаратов ФСГ был описан Donini et al. (in: Gonadotrophins and Ovarian Development, Proceeding of two workshop meetings, Edinburg and London, 1970) и имел биологическую активность 1255,6 международных единиц ФСГ на мг при контаминации ЛГ до 3,2 международных единиц ЛГ на мг. В данном случае исходным материалом являлся человеческий климактерический гонадотропин (ЧКГ) в виде препарата Пергонал(R), который, как указано выше, представляет собой смесь ФСГ и ЛГ, а также других мочевых белков. Этот результат был получен путем повторных очисток на DEAE-целлюлозе, последующей гель-фильтрации на сефадексе G-100 и препаративного гель- электрофореза.

Даже более высокие активности были получены H. Van Hell et al. (Gonadotropins. Proceedings of Int. I Symposium on Gonadotropins, 1971, New York) путем введения дополнительных стадий иммунохроматографии и гель-фильтрации в традиционный метод хроматографической очистки (ближайший аналог). Имуннохроматографию осуществляли с использованием "анти-хорионический гонадотропин человека (анти-ХГЧ)"-антител, связанных с Сефарозой для направленного удаления ЛГ из частично очищенных фракций ФСГ. Наиболее очищенная фракция ФСГ содержала 4720 международных единиц ФСГ на мг, а контаминация ЛГ составила всего 15 международных единиц ЛГ на мг (при испытании радиоиммуноанализом).

Иммунохроматографический подход уже описан Donini et al. (Acta Endocrinologica, 52, стр. 186-198, 1966), которые еще в 1966 году получили препарат ФСГ, имеющий активность 329,7 международных единиц ФСГ на мг и необнаруживаемые биологически количества примесного ЛГ. В другом эксперименте были получены фракции ФСГ с активностью 148,3 международных единиц ФСГ на мг и 2,4 международных единиц ЛГ на мг. Поскольку радиоиммунологического исследования препарата с активностью 329,7 международных единиц ФСГ на мг проведено не было, по аналогии с результатами H. Van Hell (см. выше) можно предположить, что имеются следовые количества ЛГ.

Физиологическая релевантность даже минимальных количеств примесей ЛГ была показана Donini et al. (Acta Endocrinologica, 58, стр. 463-472, 1968), где предложено новое количественное определение биологической активности ЛГ, состоящее во введении антиктным незрелым мышам постоянной дозы биологически чистого препарата ФСГ при возрастающих количествах ЛГ с последующим изменением повышения массы матки как ответа, пропорционального активности ЛГ. При данном методе всего 0,068 международных единиц ЛГ способны увеличивать массу матки при введении вместе с ФСГ в количестве 4,44 международных единиц.

Поэтому очевидно, что для лечения, требующего активности ФСГ при полном отсутствии активности ЛГ, желательно иметь абсолютно чистый препарат ФСГ.

Как упомянуто выше, поставляемый в настоящее время на рынок продукт Метродин(R) (Сероно) представляет собой очищенный препарат ФСГ, который получен методом, по существу, идентичным тому, который описан Donini et al. (Acta Endocrinologica, 52, стр. 186-198, 1966), и, следовательно, содержит примерно 0,7 международных единиц ЛГ на 75 международных единиц ФСГ, тогда как в некоторых терапевтических применениях желательно абсолютное отсутствие ЛГ. Кроме того, в Метродине(R) человеческий ФСГ загрязнен значительными количества других мочевых белков.

Заявка на патент Великобритании N 2173803 A предлагает еще один подход к очистке гипофизарных гликопротеидных гормонов, в том числе и ФСГ. Этот подход состоит в образовании комплекса гормона с иммобилизованными моноклональными антителами с последующим элюированием гормона кислотным водным буфером, имеющим pH от 3 до 4. Что касается ФСГ, то полученный высокоочищенный гормон все же загрязнен (0,1 мас.%) ЛГ и (0,5 мас.%) тиреостимулирующим гормоном (ТСГ).

Scott C. Chappel et al. описали в обзорной статье (Endocrine Reviews, 4/2/, стр. 179-211, 1983) микронеоднородность ФСГ и физиологическую природу углеводородных частей, сопровождающих молекулу ФСГ. Можно предположить, что некоторые модификации осуществляются в процессе метаболизма вплоть до конечной мочевой секреции, что может быть связано с химико-физическими различиями, продемонстрированными в экспериментах, проведенных заявителем, между высокоочищенным препаратом мочевого ФСГ (вомФСГ) в соответствии с настоящим изобретением и высокоочищенным препаратом гипофизарного ФСГ, использованным для целей сравнения.

Ко- или пост-трансляционные модификации, по-видимому, лежат в основе микрогетерогенного разнообразия ФСГ-гликопротеида, состоящего из двух различных, гликозилированных, не ковалентно связанных полипептидных цепей, известных как альфа и бета-субъединица. Бета-субъединица наделяет молекулу ее биологической специфичностью.

Следует отметить, что хотя и гипофизарный, и мочевой гормоны называются ФСГ, еще не получено неопровержимого доказательства того, что молекулы, выделенные из этих двух источников, являются одинаковыми или химически эквивалентными.

Настоящим изобретением показано, что человеческий ФСГ может быть выделен из концентрата постклимактерической мочи с такой степенью чистоты, что является совершенно свободным даже от следовых количеств ЛГ и других мочевых белков. Кроме того, аминокислотный анализ мочевого ФСГ в соответствии с настоящим изобретением выявил новую бета-субъединицу ФСГ из 111 аминокислот вместо 118 или 108, как следует из уровня техники (см., например, Scott C. Chappel et al., выше) для известной бета-субъединицы ФСГ.

Аминокислотная последовательность очищенный фолликулостимулирующий гормон (фсг),   фармацевтическая композиция, компонент фармацевтической   композиции, патент № 2105012-субъединицы имеет следующий вид:

очищенный фолликулостимулирующий гормон (фсг),   фармацевтическая композиция, компонент фармацевтической   композиции, патент № 2105012 .

Таким образом, настоящее изобретение предлагает новый белок, содержащий альфа-субъединицу гонадотропина и бета-субъединицу с последовательностью из 111 аминокислот, приведенной выше. Белок имеет биологическую активность фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Предпочтительно, он находится в гликозилированной форме.

Другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая очищенный ФСГ по изобретению и фармацевтически приемлемый наполнитель.

Наиболее предпочтительным является нахождение предлагаемой композиции в форме, пригодной для подкожного введения. Обнаружено, что подкожное введение фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением не приводит к возникновению тех аллергических реакций, которые обычно сопровождают применение известных препаратов ФСГ.

В соответствии с другим вариантом настоящего изобретения предлагается способ получения нового и высокоочищенного ФСГ в соответствии с настоящим изобретением. Способ получения ФСГ по изобретению в основном базируется на комбинации стадии иммуноочистки с жидкостной хроматографией высокого давления с обращенной фазой. Стадия иммуноочистки использует иммобилизованные моноклональные антитела, как это описано в вышеупомянутой заявке на патент Великобритании N 2173803A, однако имеет фундаментальное отличие, заключающееся в том, что элюирование ФСГ из иммунокомплекса осуществляют при более высоких значениях pH. В частности, элюирование удобно осуществлять с использованием водного раствора, имеющего pH выше 10 и молярность выше 0,5. Эксперименты, проведенные заявителем, показали, что при таких условиях иммобилизованное антитело почти не инактивируется. Это не согласуется с положением, высказанным в заявке на патент Великобритании, согласно которой (на стр. 1, строки 36-37) "использование элюентов, имеющих такие высокие значения pH, не представляется возможным на практике, поскольку это ведет к быстрой инактивации антитела".

Установленное различие может зависеть от различий в методах, применяемых для связывания антитела с полимером.

Согласно настоящему изобретению предпочтительным для элюирования является интервал от 11,3 до 11,7.

Наиболее пригодными элюэнтами являются аммиак, диэтиламин и такие буферы, как ТРИС-буфер, глицин - NaOH и подобные им, с полярностью, превышающей 0,8, предпочтительно около 1.

Последующая стадия жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой (ЖХВД) позволяет достичь полного удаления любых загрязняющих белков, которого не удается добиться только стадией иммуноочистки. То, что стадия ЖХВД не только эффективно удаляет следовые количества загрязняющих белков, но сохраняет при этом полную биологическую активность ФСГ, является неожиданностью в свете статьи, написанной P. Hablin and S.A. Khan (J. Lig. Chromat. , 9(13), стр. 2855-2868, 1986), которая показывает потерю биологической активности бычьим ФСГ и человеческим ФСГ (стандарт ЧКГ) после ЖХВД с обращенной фазой. С другой стороны, в той же статье показано удовлетворительное восстановление биологической активности, при частичном разделении, когда ЖХВД подвергают человеческий мочевой препарат (то есть содержащий как ФСГ, так и ЛГ).

После стадии жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой ФСГ восстанавливают с использованием традиционных методик. Для целей хранения и/или манипулирования продукт может быть лиофилизирован. Возможны также и другие операции, осуществляемые с целью концентрирования, стабилизации или другой обработки продукта.

Очевидно, что доступность постклимактерической мочи намного выше, чем доступность человеческого гипофиза. Это обстоятельство придает заявленному изобретению еще большую привлекательность.

ФСГ-специфическое моноклональное антитело для использования в способе настоящего изобретения может быть получено с применением известных приемов.

В типичном примере линия клеток гибридомы 9/14 подвергалась скринингу на оптимальное сродство к ФСГ (в Кембриджском университете). Моноклональные антитела продуцируют в среде методами культивирования клеток и очищают при помощи фракционирования 50%-ным (в отношении массы к объему) сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией с обращенной фазой, ЖХВД гель-фильтрацией и диализом.

Моноклональное антитело, продуцируемое линией клеток 9/14 и очищенное, как описано выше, имеет следующие технические показатели:

а) чистота белка: не менее, чем 90%

б) класс иммуноглобулина: IgG 1

в) константа сродства: 3,5очищенный фолликулостимулирующий гормон (фсг),   фармацевтическая композиция, компонент фармацевтической   композиции, патент № 2105012108 л.моль-1

г) специфичность:

Антиген - % перекрестной реакции

ФСГ - 100

ХГГ - 1

ХГГ-бета-субъединица - 1

ЛГ - 1

ТСГ - 1

д) связывающая способность с ФСГ в растворе: около 1000 международных единиц ФСГ на мг McAb.

ФСГ-специфичные моноклональные антитела химически связываются с Сефарозой 4B посредством дивинилсульфона в соответствии с методом, описанным J. Porath (Methods in Enzymology, 34, стр. 13-30, 1974).

В типичном примере 1 л Сефарозы 4B промывают на фильтре из пористого стекла вначале 5 л свежедистиллированной воды, а затем 5 л 1 M раствора карбоната натрия, pH 11. Промытую Сефарозу суспендируют в 1 литре 1 M раствора карбоната натрия (pH 11). При непрерывном перемешивании по каплям прибавляют 200 мл дивинилсульфона. Реакцию завершают в течение 70 мин при комнатной температуре, а затем прекращают путем прибавления 1 н раствора HCl (до pH 7,0).

Активированную смолу суспендируют в 1 л 0,25 M раствора бикарбоната натрия (pH 9,0), содержащего 2 г анти-ФСГ моноклонального антитела, с получением более чем 90% связывания антитела с активированной смолой. Полученную иммуносмолу хранят при температуре 4oC.

Следующий пример 1 иллюстрирует две стадии очистки способа по изобретению, примененные к коммерческому ЧКГ, являющемуся активным ингредиентом препарата Пергонал(R), Сероно.

Следует, однако, заметить, что хотя ЧКГ является предпочтительным исходным материалов в способе настоящего изобретения, последний также приемлем и для менее очищенных материалов, таких, как постклимактерические мочевые концентраты и тому подобное. Хорошие результаты получены с использованием в качестве исходного материала мочевого концентрата, содержащего всего 1 международную единицу ФСГ на мг.

Другие варианты и преимущества настоящего изобретения станут очевидными после рассмотрения следующих примеров, которые не ограничивают изобретение.

Пример 1. Получение высокоочищенного мочевого ФСГ (вом ФСГ)

Стадия 1. Иммуноочистка анти-ФСГ McAb-DVS-Сефарозы

В качестве исходного материала используют ЧКГ.

Иммуносмолу (анти-ФСГ McAb-DVS-Сефарозу) уравновешивают 0,1 M Трис-HCl, 0,3 M NaCl-буфером, pH 7,5 при температуре 4oC. Колонку загружают определенным количеством международных единиц ФСГ (РИА), соответствующим 80-90% общей связывающей способности ФСГ.

Неудерживаемые смолой белки элюируют уравновешивающим буфером до тех пор, пока OD 280 элюата не станет ниже, чем 0,02.

Абсорбированный мочевой ФСГ элюируют с иммуносмолы 1 M раствором аммиака при температуре 4oC. Аммиачные элюаты, соответствующие приблизительно 4-кратному объему иммуносмолы, объединяют, pH по возможности быстро доводят до 9,0 при температуре 4oC путем прибавления ледяной уксусной кислоты, раствор ультрафильтруют в аппарате Амикон (мембрана C.0.10000 дальтон) и концентрируют до малого объема.

Стадия 2. Жидкостная хроматография высокого давления с обращенной фазой

Полученный раствор, доведенный до pH 5,6, загружают в колонку C18 с обращенной фазой (Pre Pak waters), которую предварительно уравновешивают 0,05 M буферным раствором уксуснокислого аммония при комнатной температуре. Скорость перемещения фронта растворителя составляет 100 мл/мин, регистрацию ведут при 280 нм.

Очистку ЖХВД осуществляют с помощью аппарата Prep 500 A (waters), оборудованного УФ-детектором и генератором препаративного градиента.

Биологически активный, высокоочищенный мочевой ФСГ элюируют повышением концентрации изопропанола до 50% от подвижной фазы. Фракции проверяют аналитической гель-проникающей хроматографией и радиоиммуноанализом.

Органический растворитель удаляют дистилляцией в вакууме при температуре 40oC, после чего раствор замораживают и лиофилизируют.

Пример 2. Исследование ФСГ

Высокоочищенный препарат мочевого ФСГ настоящего изобретения подвергают химико-физическим, биологическим и иммунологическим испытаниям с тем, чтобы получить его полную характеристику. Как указано ниже, большинство испытаний осуществляют в сравнении с высокоочищенным препаратом гипофизарного ФСГ, полученным в соответствии с методом, описываемым ниже.

В качестве исходного материала используют неочищенный человеческий гипофизарный экстракт (HPG), побочный продукт, получаемый при экстракции человеческого гормона роста.

Методика очистки HPG включала следующие стадии:

1. Предварительную очистку сырого HPG путем экстракции 40%-ным этанолом, содержащим 6% уксуснокислого аммония, pH 5,6 и преципитацию супернатанта с помощью холодного 96%-ного этанола.

2. Дальнейшую очистку HPG ионообменной хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе с использованием 0,15 M раствора ацетата натрия, pH 7,0, в качестве элюента с последующей преципитацией 96%-ным холодным этанолом.

3. Дальнейшую очистку фракции ФСГ гель-фильтрацией на Сефадексе G-100 с использованием 0,05 M бикарбоната аммония в качестве буфера.

4. Окончательную очистку ФСГ ионообменной хроматографией на колонке SP Сефадекс C 50. Высокоочищенный гипофизарный ФСГ элюируют 0,1 M фосфатным буферным раствором, pH 6,2, и лиофилизируют.

Было определено, что биологическая удельная активность in vivo гипофизарного ФСГ (тест Стилмана-Ролей; международная единица второго IRP-HMG) составляет 4770 международных единиц ФСГ на мг лиофилизованного порошка. Для этого определения использовали методику, описанную ниже под заголовком "Количественное определение биологической активности".

Для характеристики ФСГ по изобретению проводились следующие испытания.

Контаминация ЛГ

Данный тест осуществляют при помощи специфического радиоиммуноанализа для ЛГ (лютеинизирующего гормона) с использованием стандарта ЛГ, градуированного с помощью тройного К1Т для ЛГ (код 10204), доставляемого в настоящее время на рынок компанией Биодата(R). В качестве антисыворотки используют овечью анти-ХГГ (хорионический гонадотропин человека) антисыворотку, полученную заявителем, которая имеет 100%-ную перекрестную реакцию с ЛГ и менее чем 0,01% с ФСГ.

Метод радиоиммуноанализа проводили в полном соответствии с наставлениями изготовителя, чтобы избежать даже незначительного загрязнения ЛГ, проявляющегося в высокоочищенном препарате мочевого ФСГ, полученном в соответствии с примером 1.

Вышеприведенные результаты подтверждают с использованием более чувствительного анализа, называемого DEL FIA (диссоциация - улучшенный лантанид-фтор-иммуноанализ), оборудование для проведения которого поставляется фирмой ЛКБ-фармация.

SDS-ПААГ

Электрофорез в пластине геля в присутствии додецилсульфата натрия осуществляют в восстановительных условиях на 13,5%-ном полиакриламидном геле, pH 8,8, в соответствии с методикой, описанной Лаеммли в Nature, 277, стр. 680-685 (1970).

Окрашивание осуществляют кумасси бриллиантовым синим R-250, 0,25% в смеси 25% метанола/75% уксусная кислота.

Данному испытанию подвергают как препарат вомФСГ в соответствии с настоящим изобретением, так и высокоочищенный препарат гипофизарного ФСГ (вогФСГ), полученный, как описано выше.

В обоих препаратах (мФСГ и гФСГ) основная большая полоса, типичная для гликопротеинов, обнаруживается при одной и той же молекулярной массе, соответствующей примерно 20000 дальтон, что совпадает с литературными данными. Вследствие известного "поведения" гликопротеидов в SDS-ПААГ, это значение слегка преувеличено.

Вытеснительная хроматография

Анализы как вомФСГ, так и вогФСГ осуществляют на колонке TSK G2000 SW фирмы ЛКБ с использованием 0,1 M фосфатного буфера, pH 6,8+0,2 M NaCl в качестве элюента. Скорость перемещения фронта растворителя составляет 0,7 мл/мин; регистрацию проводят при длине волны 230 нм.

Результаты приведены на чертеже, который показывает одинарные основные пики для мФСГ и гФСГ, по существу, с одинаковым временем удерживания (13,37 и 13,55 мин, соответственно).

Изоэлектрофокусирование

Изоэлектрофокусирование осуществляют на 5%-ном тонкослойном полиакриламидном геле (Амфолин ЛКБ(R), pH 3,5-9,5), фиксированном 11,5%-ной (мас.) трихлоруксусной кислотой и 3,5%-ной (мас.) сульфосалициловой кислотой, и проводят окрашивание серебром с помощью набора БИО-РЭД(R).

И мочевой, и гипофизарный ФСГ обнаруживают несколько полос, давая при этом совершенно различные картины их расположения, в частности, основные полосы мочевого ФСГ находятся в интервале pH ниже, чем 4,8, тогда как основные полосы гипофизарного ФСГ расположены в более высоком интервале pH.

Данное испытание показывает, что мочевые и гипофизарные ФСГ не являются идентичными молекулами, а также то, что различия заключаются, по крайней мере, в их углеводородных, если не в самих белковых, частях.

Количественное определение биологической активности

Биологическую активность высокоочищенного мочевого ФСГ in vivo определяют методом Стилмана-Ролей (Steelman-Rohiey, Endocrinolody, 53, стр. 604-616, 1953) с использованием в качестве эталонного вещества Хаус Эталон ЧКГ, градуированный по 2-му международному эталонному препарату ЧКГ для количественного определения биологической активности. Данный анализ принят всеми основными фармакопеями и службами здравоохранения для определения Международных единиц (1. v.) биологической активности ФСГ.

Показано, что вомФСГ-препарат, полученный в соответствии с описанием, приведенным выше, имеет удельную активность, равную 6200 1.V. ФСГ на мг лиофилизированного порошка, то есть наиболее высокую удельную активность, когда-либо описанную для мочевого препарата ФСГ.

Определение аминокислотной последовательности

а) Выделение субъединиц мочевого ФСГ

Выделение субъединиц мочевого ФСГ осуществляют с использованием системы ЖХВД Waters, оборудованной колонкой Аквапор RP-300, 200 х 4,6 мм, 7 мкм (Браунли Лэбз). Элюентами являются A=0,1% TFA (трифторуксусная кислота, классификация ЖХВД, Пиерс), B=0,055% TFA в ацетонитриле. Скорость перемещения фронта растворителя составляет 1 мл/мин при температуре 35oC, а начальный режим представляет собой 15% B. Градиент предусматривает повышение до 40% B в течение 20 мин. Уф-детектор устанавливают на 229 нм. Обычно проводят аналитические серии (20 мкл раствора 0,5 мг/мл вомФСГ и 0,5% TFA). Предварительная инкубация в растворе TFA необязательна. Препаративное разделение осуществляют с использованием той же колонки. Хорошее разрешение достигают путем ввода 0,5 мг высокоочищенного человеческого мочевого ФСГ (серия N032), растворенного в буфере A. Фракции собирают вручную и сушат с использованием концентратора Спид Вак. Субъединицы растворяют в воде, анализируют ЖХВД и хранят при температуре -20oC.

Бета-субъединицу элюируют приблизительно через 10,5 мин в виде широкого пика; альфа-субъединицу элюируют в течение 15 мин в виде острого пика, Идентификацию пиков (на содержание бета- и альфа-субъединицы) осуществляют специфическим радиоиммуноанализом. Обычно восстановление бета-субъединицы происходит вокруг значения 50%, тогда как восстановление альфа-субъединицы составляет при значении более, чем 90%.

б) Восстановление и карбоксиметилирование альфа- и бета-субъединиц

Восстановление субъединиц, разделенных, как описано в части а), осуществляют в 0,5 Трис, 0,1% ЭДТА, 6 М Гуанидин-HC1, pH 8,5, в течение 2 ч при температуре 37oC с использованием ДТТ (дитиотрейтола, Серва) при 15-кратном молярном избытке относительно содержания цистеина. Затем в реакционную смесь прибавляют йодоацетат натрия (2,1 молярный избыток относительно ДТТ) и оставляют на 30 мин в темноте. Для прекращения реакции прибавляют 1%-ный меркаптоэтанол и TFA. Карбоксиметилированные субъединицы очищают ЖХВД. Бета-карбоксиметилированная субъединица плохо растворяется в воде, поэтому конечный выход совершенно незначителен.

в) Восстановление, пиридилэтилирование и трипсин-переваривание бета-субъединицы.

Восстановление бета-субъединицы, разделенной, как описано в части а), осуществляют при комнатной температуре в течение 2 ч следующим образом: 0,1 мг бета-субъединицы, 0,5 мл 0,5 М раствора Трис, 0,1% ЭДТА, 6 М гуанидин-HC1, pH 8,5, 2,7 мг дитиотрейтола. Пиридилэтилирование осуществляют путем прибавления 0,02 мл 4-винилпиридина к предыдущему раствору. Реакция продолжается в течение 2 ч при комнатной температуре. Наконец, реакционную смесь загружают в С4-патрон (Бэйкер), уравновешенный 0,1% TFA. Патрон промывают 0,1% TFA и пиридилэтилированную бета-субъединицу элюируют 40% ацетонитрилом с 0,1% TFA. Элюированные фракции сушат и очищают ЖХВД, как описано выше для бета-субъединицы. Пиридилэтилированную бета-субъединицу, очищенную ранее путем ЖХВД, растворяют в 1%-ном растворе NH4HCO3, pH 8.

В раствор прибавляют трипсин и реакцию осуществляют в течение 1,5 ч при температуре 30oC. Триптические фракции очищают жидкостной хроматографией высокого давления (ЖХВД) с использованием ранее описанной методики, за исключением того, что градиент поднимают от 0% до 55% в течение 30 мин и УФ-детектор устанавливают на 214 нм.

Триптические фракции секвенируют таким же образом, как осуществляют секвенирование субъединиц (см. часть д).

г) Секвенирование альфа-субъединицы

Несколько испытаний на определение последовательности аминокислотных остатков в белках (секвенирование) осуществляют с использованием альфа-субъединицы, карбоксиметилированной альфа-субъединицы или целого высокоочищенного человеческого мочевого ФСГ, обычно загружая 5 нмоль (или немного менее) в белковый секвенсер (470 А, Эпплайд Биосистем) и используя стандартную программу O3PRTH, поставляемую Эпплайд Биосистем, или специальную программу, в которой циклы, которые расщепляют Pro или Gly, замещены специальным циклом O3CPPO. Первый из остатков, начиная с NH2-конца молекулы, идентифицируют и получают подтверждение результатов по определению аминокислотной последовательности, известных из литературы (J. Biol. Chem., 250, стр. 6735 (1975). Asn в положении 52 и в положении 78, относящихся к известной последовательности, начинающейся с Ala, представляют собой аминокислоты, где происходит гликозилирование. На конце NH2 всегда присутствует неоднородность, и она всегда одна и та же во всех секвенированных пробах. Полная молекула (то есть, начинающаяся с Ala) составляет 65% цепей, молекула, не имеющая первых двух аминокислот (то есть начинающаяся с Asp), присутствует в количестве 5% молекул, а не имеющая первых трех аминокислот (то есть начинающаяся с Val), присутствует в количестве 30% (см. табл. 1).

д) Секвенирование бета-субъединицы

Осуществляют несколько серий секвенирования с использованием бета-субъединицы, карбоксиметилированной бета-субъединицы, целого высокоочищенного человеческого мочевого ФСГ и триптических пептидов из пиридилэтилированной бета-субъединицы. Образцы загружают в секвенсер белков (470 А, Эпплайд Биосистем) с использованием стандартной программы O3RPTH, предложенной Эпплайд Биосистем. Результаты показывают, что данная субъединица имеет длину 111 аминокислот и следующую аминокислотную последовательность:

очищенный фолликулостимулирующий гормон (фсг),   фармацевтическая композиция, компонент фармацевтической   композиции, патент № 2105012

Asn в положениях 7 и 24, относящихся к вышеприведенной последовательности, начинающейся также с Asn, представляют собой остатки, по которым происходит гликозирование. На NH2- конце бета-субъединицы всегда присутствует неоднородность, и она всегда одна и та же во всех секвенированных образцах. Полная молекула (то есть начинающаяся с Asn), представлена в количестве 35%, молекула, не имеющая первой аминокислоты (то есть начинающаяся с Ser), присутствует в количестве 15%, молекула, не имеющая первых двух аминокислот (то есть, начинающаяся с Cys), присутствует в количестве 50% (см. табл. 2).

Пример 3. Фармацевтические препараты

Получение фармацевтических лекарственных форм, содержащих высокоочищенный мочевой ФСГ, полученный в соответствии с настоящим изобретением, не представляет трудности. Поскольку вещество сохраняет свою биологическую активность после лиофилизации, последняя содействует получению предпочтительной формы для инъецируемых препаратов.

Лиофилизированный препарат, содержащий вомФСГ, воссоздают с использованием физиологического раствора и/или других пригодных разбавителей, с получением раствора для инъекций.

Многие наполнители могут быть успешно использованы в композиции в качестве ее части, такие, как, например, маннит, лактоза, глицин, глюкоза, сахароза и их смеси. Могут быть использованы и другие традиционные носители, наполнители и тому подобное.

В экспериментах, проводимых в соответствии с настоящим изобретением, в качестве наполнителя для инъецируемых препаратов использовали лактозу.

При получении инъецируемых составов для инъекции доведение pH обязательно. Применяемые для этого кислые вещества включают уксусную кислоту и тому подобное, а основные вещества включают гидроокись натрия и тому подобное.

В пределах объема настоящего изобретения предлагается использование одного или более стабилизаторов, например альбумина и тому подобного.

Типичный пример фармацевтического производства для изготовления партии 20000 ампул, каждая из которых содержит 75 международных единиц ФСГ, представляет собой следующее.

Вычисленное количество (в единицах биологической активности) порошка лиофилизированного ФСГ растворяют в 700 мл холодной апирогенной воды для инъекции. Если необходимо, pH доводят до значения между 6,2 и 6,8 с использованием либо уксусной кислоты, либо гидроокиси натрия, в зависимости от случая, Затем раствор подвергают стерильной фильтрации через фильтр с размером пор 0,2 мкм.

200 г лактозы растворяют в 2 л апирогенной воды для инъекции, подвергают стерильной фильтрации, как описано выше, и прибавляют к раствору ФСГ.

Апирогенную воду для инъекции прибавляют до получения конечного объема, равного 15 л. Затем раствор разливают в ампулы (0,75 мл каждая) и лиофилизируют в стерильном лиофилизаторе. Получают ампулы, каждая из которых содержит 75 международных единиц ФСГ и 10 мг лактозы.

В предпочтительном варианте каждая ампула может содержать 150 международных единиц ФСГ и 10 мл лактозы.

В соответствии с другим примером фармацевтического препарата получают ампулы с содержанием в каждой, кроме наполнителя лактозы, 1 мг человеческого альбумина в качестве стабилизатора.

Хотя настоящее изобретение проиллюстрировано специфическими примерами, следует иметь в виду, что различные варианты могут быть выполнены в пределах объема и сущности настоящего изобретения.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Очищенный фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), представляющий собой очищенный фолликулостимулирующий гормон (фсг),   фармацевтическая композиция, компонент фармацевтической   композиции, патент № 2105012- субъединицу гонадотропина и очищенный фолликулостимулирующий гормон (фсг),   фармацевтическая композиция, компонент фармацевтической   композиции, патент № 2105012- субъединицу с аминокислотными последовательностями, приведенными в конце формулы

и характеризующийся следующими свойствами: активность не менее 6200 международных единиц ФСГ на 1 мг лиофилизированного порошка, свободен от лютеинизирующего гормона, Asn гликозилирован в положениях 7 и 24 очищенный фолликулостимулирующий гормон (фсг),   фармацевтическая композиция, компонент фармацевтической   композиции, патент № 2105012- субъединицы и в положениях 52 и 78 очищенный фолликулостимулирующий гормон (фсг),   фармацевтическая композиция, компонент фармацевтической   композиции, патент № 2105012- субъединицы.

2. Гормон по п. 1, отличающийся тем, что выделен из климактерической мочи человека.

3. Фармацевтическая композиция, содержащая активный компонент и целевую добавку, отличающаяся тем, что в качестве активного компонента содержит белок по п. 1, а в качестве целевой добавки фармацевтически приемлемый носитель для инъекционного или подкожного введения.

4. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что в качестве наполнителя содержит лактозу.

5. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что содержит на ампулу белок ФСГ в количестве около 75 МЕ или около 150 МЕ.

6. Компонент фармацевтической композиции, представляющей собой очищенный ФСГ по п. 1.

Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C07K14/59 гормон, стимулирующий фоликулы (ФСГ); хорионные гонадотропины, например ХСГ; гормон лютеинизации (ГЛ); гормон стимулирующий щитовидную железу (ГСТ)

Патенты РФ в классе C07K14/59:
конъюгаты дисоразолов, фармацевтическая композиция на их основе, названные конъюгаты для изготовления лекарственного средства, набор и способ их получения -  патент 2473562 (27.01.2013)
гонадотропный гормон, полученный из беспозвоночных, и его синтез -  патент 2349601 (20.03.2009)
способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в культуре клеток карциномы гортани hep-2 -  патент 2349600 (20.03.2009)
промежуточные соединения для синтеза антагониста рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (lhrh), способ их получения и способ получения антагониста lhrh -  патент 2307125 (27.09.2007)
фармацевтический компонент на основе паратиреоидного гормона человека и содержащая его фармацевтическая композиция для интраназального применения -  патент 2292219 (27.01.2007)
одноцепочечный белок, модулятор гормонов лютеинизирующего, фолликулостимулирующего, тиреостимулирующего и хорионического гонадотропина (варианты), молекула нуклеиновой кислоты (варианты), вектор (варианты), линия трансформированных клеток сно (варианты), способ продуцирования одноцепочечного белка (варианты) -  патент 2213099 (27.09.2003)
антагонист лг-рилизинг-фактора (lhrh), комплекс, способ химической кастрации и/или лечения гонадотропинзависимых расстройств -  патент 2130464 (20.05.1999)
производные декапептидов и содержащая их фармацевтическая композиция -  патент 2124023 (27.12.1998)
производные пептидов и композиция, вызывающая иммунный ответ на lhrh -  патент 2078770 (10.05.1997)

Класс C12N15/16 гормоны

Патенты РФ в классе C12N15/16:
способ получения субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека и нанокапсулированная форма рекомбинантного эритропоэтина человека с использованием субстанции, полученной указанным способом -  патент 2518329 (10.06.2014)
антитела против фактора роста эндотелия сосудов (vegf) -  патент 2514148 (27.04.2014)
способы скрининга с применением g-белок сопряженных рецепторов и родственных композиций -  патент 2506274 (10.02.2014)
варианты эритропоэтина -  патент 2430162 (27.09.2011)
композиции, реагенты, наборы и способы для диагностики, мониторинга и лечения ожирения и/или диабета -  патент 2420583 (10.06.2011)
гонадотропный гормон, полученный из беспозвоночных, и его синтез -  патент 2349601 (20.03.2009)
плазмидная днк pbsh2egf, кодирующая синтез эпидермального фактора роста человека, и способ его получения с помощью данной днк -  патент 2289623 (20.12.2006)
агонисты рецептора-3(r3) пептида-активатора гипофизарной аденилатциклазы(расар) и способы их фармакологического применения -  патент 2269354 (10.02.2006)
рецептор протеина из класса vip3, кодирующая его последовательность днк и способ выявления или выделения гомологов указанного рецептора протеина или кодирующей его последовательности днк -  патент 2222597 (27.01.2004)
последовательность днк, кодирующая препронейропептид y (препроnpy), последовательность рнк, способ обследования субъекта, сигнальный пептид, препроnpy, способ определения пептида, способ диагностирования предрасположенности к повышенному уровню общего холестерина или холестерина ldl -  патент 2219186 (20.12.2003)

Класс A61K38/24 фолликулостимулирующий гормон (FSH); хорионные гонадотропины, например HCG, лютеинизированный гормон (LH); тироидостимулирующий гормон (TSH)

Патенты РФ в классе A61K38/24:
способ профилактики внутриутробного инфицирования плода -  патент 2504364 (20.01.2014)
способ комплексного лечения нормогонадотропного бесплодия у мужчин -  патент 2480256 (27.04.2013)
конъюгаты дисоразолов, фармацевтическая композиция на их основе, названные конъюгаты для изготовления лекарственного средства, набор и способ их получения -  патент 2473562 (27.01.2013)
способ лечения доброкачественных гиперпластических процессов репродуктивной системы женщин -  патент 2471485 (10.01.2013)
способ проведения суперовуляции у коров-доноров эмбрионов -  патент 2469738 (20.12.2012)
способ лечения инфертильности при варикоцеле -  патент 2419453 (27.05.2011)
водные композиции чфсг -  патент 2407514 (27.12.2010)
способ экстракорпорального оплодотворения -  патент 2398537 (10.09.2010)
применение lh для лечения отсутствия либидо и достижения оргазма у женщин -  патент 2351358 (10.04.2009)
способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в культуре клеток карциномы гортани hep-2 -  патент 2349600 (20.03.2009)

Наверх