способ определения состояния биологического материала

Формула изобретения

1. Способ определения состояния биологического материала путем анализа оптическими методами эталонных клеток как здоровых, так и обладающих различными патологиями, и клеток тестируемого образца, включающий в себя облучение клетки световым потоком, детектирование и видеолизацию изменения потока в отдельных точках клетки, дифференциацию клетки на отдельные фрагменты, определение значимых параметров для каждого из фрагментов, построение характеристической матрицы распределения параметра в клетке, сопоставление матриц тестируемого и эталонных образцов и составление заключения о состоянии тестируемого биоматериала, отличающийся тем, что дифференциацию клетки на фрагменты осуществляют по линиям, соединяющим точки с близкими величинами изменений потока, затем для каждого фрагмента определяют среднюю величину этого параметра по формуле



где М_i средняя мера изменения потока в i-м фрагменте;

M_k изменение потока в единичной k-й точке i-го фрагмента;

n количество точек измерения в данном фрагменте,

после чего составляют набор морфологических и топологических характеристик для данной клетки, определяют их величины для каждого фрагмента и в качестве значимых параметров используют фактор специфичности фрагмента, определяемый по формуле



где Ф_к - значение значимого единичного n-го параметра в k-й единичной точке i-го фрагмента;

фактор специфичности n-го параметра для 1-го фрагмента,

а в качестве характеристической матрицы используют совокупность матриц векторного распределения факторов специфичности фрагментов для отобранных характеристик.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве определяемых характеристик используют не менее одного параметра из следующей группы: площадь и/или периметр фрагмента, средняя оптическая плотность, интегральная оптическая плотность, доля негранулярной компоненты в фрагменте, наименьшая оптическая плотность негранулярной компоненты, и/или размер участка с минимальной плотностью, и/или его доля во фрагменте, средняя оптическая плотность гранулярной компоненты фрагмента и/или ее площадь, наибольшая оптическая плотность гранулы, уровень дискриминации гранулы по оптической плотности, размер отдельных частей гранульной части, и/или их масса, и/или периметр, фактор формы гранульной части и/или ее высота, доля во фрагменте и/или удельная поверхность гранульной компоненты, число гранульных образований, расстояния между ними, контрастность фрагмента и/или ее относительный показатель, показатель микрогетерогенности, градиент распределения оптической плотности и/или ее дисперсия, энтропия, коэффициент избыточности, функция диссинации, оптическая плотность в отдельных точках фрагмента, функция автокорреляции, параметр распределения Фурье.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что биологический материал перед анализом при необходимости прокрашивают по известным методикам.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике заболеваний, приводящих к морфологическим изменениям в клетках организма, а также отбору клеток и клеточных систем, пострадавших от негативных внешних факторов, и может быть также использовано для исследовательских и диагностических целей в ветеринарии и прикладной биотехнологии.

В настоящее время важность правильной оценки состояния клеток и клеточных систем организма приобретает особое значение в связи с расширением спектра факторов, воздействующих на организм и приводящих к его повреждению (ионизирующее излучение, воздействие химических и болезнетворных агентов, онкологические и иные заболевания, приводящие к генетическим изменениям). Получение в кратчайшие сроки достоверной информации о состоянии клетки и внутриклеточных структур позволяют принимать своевременные меры, направленные на минимизацию негативных воздействий и лечение зарождающихся заболеваний.

Использование для анализа состояния клеток и их компонентов методов, основывающихся на анализе морфологических и/или физико-химических параметров [1-3] широкоизвестно, однако они, как правило, не позволяют получить высокую надежность результатов при анализе небольшого числа параметров и весьма сложны, длительны и дорогостоящи при их существенном увеличении.

Наиболее перспективными в этой области являются оптические методы анализа в связи с их высокой информативностью и возможностью автоматизированного обсчета полученных результатов.

В частности, известно для оценки состояния клеток анализа УФ-спектров как клетки в целом, так и ее элементов, определение значимых параметров, обработка данных с помощью ЭВМ и составление заключения о состоянии биоматериала [4-7].

Однако указанные способы не позволяют получить достаточно полную и всестороннюю характеристику биоматериала и используются в основном для решения частных задач.

Прототипом предлагаемого изобретения является способ оценки состояния клеток с целью ранней диагностики рака [8]. Способ заключается в том, что анализируемую клетку освещают световым потоком, регистрируют с помощью детектора параметры потока, проходящие через клетку в отдельных точках, видеолизируют полученные данные на экране, делят площадь клетки на несколько равных фрагментов, определяют средние значения параметров светового потока для каждого из фрагментов, на этой основе составляют характеристическую матрицу распределения этого параметра по поверхности клетки и сопоставляют эту матрицу с аналогичными характеристиками, снятыми для здоровых и эталонных больных раковыми заболеваниями клеток, диагностируя в итоге анализа наличие и степень развития заболевания.

Недостатком прототипа является пригодность для определения только ограниченного круга заболеваний, а также низкая точность при сочетанном воздействии повреждающих факторов, вызванная тем, что в основу сопоставления клеточного материала были положены параметры клетки, не связанные с внутриклеточными структурами.

Задачей, решаемой в рамках настоящего изобретения являлось создание метода, позволяющего связывать общее состояние клетки и организма в целом с состоянием и измеряемыми параметрами ее важнейших структурных элементов, что позволяет повысить информационность и точность анализа, в частности применять его результаты для более широкого круга патологий.

Указанная задача решается тем, что дифференциацию клетки на фрагменты осуществляют по линиям, связывающим точки с близкими значениями параметров, после чего определяют для каждого i-того фрагмента среднюю величину этого параметра (меру) по формуле , где M_i - средняя мера изменения параметра светового потока в i-том фрагменте, M_k - величина изменения этого параметра в единичной k-той точке фрагмента, n - число точек k, в которых проводилось измерение параметров потока; затем выбирают набор морфологических и топологических, в частности геометрических характеристик для данной клетки, определяют их значения для каждого фрагмента и в качестве значимого параметра используют факторы специфичности фрагментов , определяемые по формуле , где Ф_k - значение единичного n-того параметра в k-той единичной точке i-того фрагмента; - фактор специфичности n-того параметра для i-того фрагмента, а в качестве характеристической матрицы используют матричное пространство - совокупность матриц векторного распределения факторов специфичности для отобранных n-ных характеристик.

В качестве анализируемых параметров выбирают не менее одного параметра из группы, включающей в себя: площадь фрагмента - A, периметр фрагмента - П, среднюю оптическую плотность (ОП) - D, интегральную ОП - DA, долю негранулярной компоненты во фрагменте - q₃, наименьшую ОП негранулярной компоненты - D_мин., размер участка фрагмента с ОП близкой D_мин. - A_мин., доля D_мин. в фрагменте q₄= D_минA_мин/DA, средняя ОП гранулярной компоненты фрагмента - D_г, размер гранул - A_г, наибольшая ОП гранулы - D_макс., уровень дискриминации гранулы по ОП - D, размер i-тых частей фрагментов гранульной части - A_г, интегральная ОП гранульной компоненты - D_гА_г, периметр гранульной части - Z_r, фактор формы гранульной части - Z²_г/A_г , высота гранульной части - H_r = D_макс.-D_г, доли гранульной компоненты , удельная поверхность гранульной компоненты , число гранульных образований во фрагменте - n, расстояние между гранулами - M, контрастность фрагмента H = D_макс.-D_мин., относительный показатель контрастности - K = H/H_k100%, показатель микрогетерагенности - D_г= 1/A₂(D_i-1-D_i):(D_i+1+D_i), градиент распределения ОП _i = (A₁-A₂)/(D_d1-D_d2), энтропия - S, коэффициент избыточности - R = (1-S/S_макс.) 100%, функция диссинации , ОП в отдельных точках - D_х, функции автокорреляции - () = K_D/², где , дисперсия ОП - K_D(О)= ², параметр распределения Фурье - частота пространственной гармоники.

В ходе анализа используют как все вышеуказанные параметры одновременно, так и часть из них, оказавшиеся наиболее значимыми при сопоставлении здоровых и эталонных для конкретных заболеваний клеток. При необходимости перед анализом клетки прокрашивают по известным схемам.

Практический анализ клеток осуществляют следующим образом.

Биологический материал (мазок крови, срез ткани, бактериальная проба и т. п. ) при необходимости прокрашивают по стандартным методикам [9], фиксируют, например, последовательной обработкой 96% спиртом и канадским бальзамом, после чего помещают на предметное стекло микроскопа и проводят микрофотометрию препарата с помощью соответствующих приборов, например, сканирующего микроскопофотометра SMP-05, управляемого ЭВМ 12/20, получая на экране сканограмму клетки в единицах оптического пропускания. Затем с помощью специальных программ, содержащих вышеупомянутую последовательность действий по обработки информации осуществляют трансформацию изображения в соответствующую сетку на основе предварительно выбранных параметров (фиг. 1-3).

Отбор значимых параметров осуществляют в ходе анализа не менее 20 образцов (обычно 25-40) "эталонных" клеток биологического материала с точно установленным диагнозом поражения по сравнению с клетками здоровых доноров по всем вышеперечисленным параметрам последовательно осуществляя разбивку поверхности клетки на фрагменты линиями, соединяющими точки с близкой ОП, определяя меру для каждого фрагмента и факторы специфичности для каждого параметра на базе которых строят векторное пространство, специфичное для данной конкретной патологии. Для конкретного анализа клетки в дальнейшем относительно предполагаемого заболевания используют параметры, вклад которых в картину заболевания не менее 5%. При совпадении результатов с предположением составляют соответствующий диагноз, при несовпадении - делают анализ по всем параметрам, проводят сопоставления со всеми имеющимися "эталонами" и диагностируют заболевание или по крайней мере тип заболевания.

Диагноз считается подтвержденным при наличии в образце не менее 60% специфичных для данного заболевания отличий от здоровой клетки.

Пример 1. Диагностика хромосомных нарушений. Лимфоциты на 5 мл гепаринизированной (25 кл/мл) крови из локтевой вены больных получают центрифугированием на градиенте плотности Фикола-верографина по Бауме [10]. Суспензию лимфоцитов с концентрацией 0,510⁶ кл/мл культивируют при 37^o в течение 25-35 мин в среде 199 с фитогемагглютинином в дозе 0,5-1,5 мкг/мл и супернатантом 72-часовых культур моноцитов с концентрацией клеток 2-510⁵ кл/мл, полученных из периферической крови здоровых доноров с помощью центрифугирования на градиенте плотности Фикола-верографина и прилипания к стеклу. Через 25-35 минут клетки центрифугируют при 400g в течение 10 мин, надосадочную жидкость удаляют и ресуспензируют клетки в 100% эмбриональной телячьей сыворотке. Готовят мазок, фиксируют смесью Никифорова (этанол и эфир в соответствии 1:1) в течение 6-8 мин, затем высушивают на воздухе. Проводят рибонуклеазную обработку. Рибонуклеазу разводят в осмолярном растворе сахарозы в концентрации 200 МЕ/100 мл. Обработку ведут 50-60 мин при 37-38^oC, после чего мазок промывают 4-5 мин в водопроводной воде. Окраску проводят в растворе галлоцианин-хромовых квасцов по методике [9] в течение 2-3 ч при 37^o. Препарат промывают водой 4-5 мин. Затем проводят микрофотометрию препарата с помощью сканирующего микроскопа -фотометра SMP-05 (ОПТОН, ФРГ), управляемого ЭВМ, (РДР 12/20), получают сканограмму ядра лимфоцита в единицах оптического пропускания. Затем проводят обработку сканограммы, используя в качестве параметров: D_г, D_макс., A, D_гА_г, П, Н, _D(), _i , DZ, Z_г/g. В результате происходит последовательная компьютерная трансформация изображения клетки в соответствующую матрицу.

На фиг. 1 показано последовательное превращение исходного изображения после дискриминации в сетевую реконструкцию. На фиг. 1 показано сопоставление здоровой клетки "а", эталонной больной клетки "г" и анализируемых клеток "б" и "в". Произведенная обработка изобретений показала начальную стадию заболевания в случае пробы "б" и разгар заболевания в случае пробы "в".

В качестве пробы "б" была использована кровь ребенка 2-недельного возраста, находящегося в Педиатрической академии.

Из анамнеза было известно, что ребенок от патологически протекавшей беременности и преждевременных родов (34 недели). Вес при рождении 1800 г. Три предыдущие беременности матери кончались преждевременными родами и смертью ребенка на 1-28 сутки.

У ребенка было проведено цитогенетическое исследование кариотипа с целью выявления хромосомной патологии. Изменений в кариотипе не выявлено.

При исследовании по заявленному способу анализировались хроматин ядер лимфоцитов и сами лимфоциты. Время исследования 8 ч. Сопоставление показателей позволило установить наличие цитогенетически невыявляемого хромосомного заболевания. Через 4 месяца в результате клинического исследования выявлено 12 стигм дизэмбриогенеза, что подтвердило правильность диагноза по данной методике.

В качестве пробы "в" исследовалась кровь ребенка 10 лет с предварительным диагнозом "олигофрения в стадии имбецильности". При клиническом обследовании больного отмечено 10 стигм имбецильности. Известными методами (путем исследования прометофазных хромосом лимфоцитов) нарушений со стороны хромосом не выявлено.

Проведенный анализ показал наличие цитогенетически не выявляемых хромосомных болезней в стадии разгара.

Через месяц было проведено клиническое обследование ребенка, в ходе которого выявлено 12 стигм дизэмбриогенеза.

Наряду с более ранней диагностикой и расширением возможностей, по сравнению с традиционными методами, время анализа сокращается со 100-110 до 7-10 ч, т.е. примерно в 10 раз.

Пример 2. Диагностика лимфом.

Готовят мазок периферической крови, взятой из пальца руки, фиксируют смесью Никифорова (этанол и эфир в соотношении 1:1) в течение 15-20 мин, высушивают на воздухе. Проводят рибонуклеазную обработку по методике примера 1.

После окраски галлоциан-хромовыми квасцами препарат заключается в канадский бальзам и приводится микроденситометрическое исследование на системе анализа изображений.

В качестве анализируемых параметров использовали: A, , D_м, D_мин., D, H, A_г, DA, _i, K, S.

В качестве анализируемого использовали мазок крови больного Б., 63 лет, поступившего в клинику с жалобами на покраснение кожи, зуд, жжение, озноб. Предварительный диагноз: Т-клеточная лимфома кожи, эритродермическая стадия.

Анализ изображений на фиг. 2, фото А, по сравнению со здоровой (фото В) и пораженной лимфой (фото Б), подтвердил данный диагноз. В последствии результаты были подтверждены данными клинических и лабораторных исследований.

Пример 3. Диагностика радиационного поражения.

Неокрашенный мазок крови, взятый из пальца, фиксировали 96% спиртом, заключали в канадский бальзам и микродентифицировали эритроцитом с помощью системы анализа изображений при использовании в качестве параметров H_г, DZ, A, H, , H, _i, .

Сопоставление картины нормальных и патологических эритроцитов при действии радиации в дозе 38 Гр приведено на фиг. 3 (рядом приведена пространственная модель полученной матрицы).

Время анализа составляло около получаса. Точность диагноза конкретных больных с дозой облучения 1-20 Гр составляло 5%.

Традиционные методы анализа позволяли получить точность 20% при времени анализа около 6 сут.

Приведенные выше примеры иллюстрируют как широту возможностей применения данного метода, так и его большую эффективность по сравнению с традиционными методами диагностики.

Литература

1. Саркисов Д. С. Очерки по структурным основам гомеостаза. -М.: Медицина, 1977, с. 147-246.

2. Туракулов Я. Х. и др. Митохондрии. Биохимия и ультраструктура. -М.: Наука, 1973, с. 161-163.

3. Гайер Г. Электронная гистохимия. -М.: Мир, 1974, 274 с.

4. Стейнлер Р. и др. Мир микробов. -М.: Мир, 1979, т. 2, с. 206-330.

5. Патент США N 3327117, 1967.

6. Патент США N 3873970, 1975.

7. Патент США N 3947123, 1976.

8. Патент США N 150360, кл. G 06 K 9/00, 1977.

9. Пирс Э. Гистохимия. -М.: Медицина, 1982, с. 190-192, 746.

10. A.Bоyme, Scaud.J.Clin., Zabor. Invest, 1968, 21, p. 133-138.