способ определения активности фотосинтетического аппарата растений

Формула изобретения

Способ определения активности фотосинтетического аппарата различных сортов растений, включающий отбор проб, подготовку проб путем приведения фотосинтетического аппарата в активное состояние, выделение хлоропластов из растительных тканей, суспендирование их, измерение показателей, отражающих физиологическое состояние хлоропластов, и последующее определение по этим показателям активности фотосинтетического аппарата растений, отличающийся тем, что пробы отбирают без нарушения целостности растений, подготовку проб производят непосредственно после выделения растений из почвы путем помещения растений в темновую камеру в условия, обеспечивающие сохранение тургора, после выделения хлоропластов определяют содержание их в образцах по оптической плотности суспензии, а в качестве показателей, отражающих физиологическое состояние хлоропластов, измеряют интенсивность переменной и замедленной флуоресценций в суспензиях, предварительно приведенных к одинаковому числу хлоропластов в них.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к физиологии растений и может быть использовано в генетике растений и селекции для сравнительной оценки потенциальных возможностей селекционного материала.

Наиболее близким к заявляемому является способ определения активности фотосинтетического аппарата растений [1] заключающийся в том, что выделяют растения из почвы, срезают листья, подготавливают пробы помещением в воду и выдерживанием в темноте при температуре 8 10^oC в течение суток. Данная подготовка способствует освобождению хлоропластов от крахмальных зерен. Затем осуществляют изолирование хлоропластов. Для этого пробу листьев ополаскивают дистиллированной водой, обсушивают фильтровальной бумагой, взвешивают и измельчают на отрезки длиной 5 7 мм. Измельченный растительный материал (10 г) растирают в ступке, вмороженной в лед (-1, -5^oC) в течение 30 с с 20 мл среды изолирования, содержащей компоненты следующих концентрациях: сахароза 0,04 М, фосфатный или трис- буфер 0,07 М, хлорид натрия 0,01 М, pH 7,9 8,0. Растертый растительный материал отжимают через 4 слоя капроновой ткани (50 отверстий на 1 см). Полученный фильтрат центрифугируют с охлаждением (-1^oC) при 800 об/мин в течение 3 мин. Супернатант осторожно сливают, а рыхлый осадок хлоропластов мягко ресуспендируют капроновой кисточкой в 1- мл среды изолирования в течение 5 с. Затем измеряют показатели, отражающие физиологическое состояние хлоропластов с последующим определением по этим показателям активности фотосинтетического аппарата растений.

Недостатком данного способа является длительная подготовка растений к анализу, не позволяющая охарактеризовать состояние растительного организма в момент отбора проб.

Целью изобретения является повышение точности показателей, отражающих истинное состояние фотосинтетического аппарата растений.

Поставленная цель достигается тем, что в способе определения активности фотосинтетического аппарата различных сортов растений, включающем отбор проб, подготовку проб путем приведения фотосинтетического аппарата в активное состояние, выделение хлоропластов из растительных тканей, суспендирование их, измерение показателей, отражающих физиологическое состояние хлоропластов и последующее определение по этим показателям активности фотосинтетического аппарата растений, пробы отбирают без нарушения целостности растений, подготовку проб производят непосредственно после выделения растений из почвы путем помещения растений в темновую камеру в условия, обеспечивающие сохранение тургора, после выделения хлоропластов определяют содержание их в образцах по оптической плотности суспензии, а в качестве показателей, отражающих физиологическое состояние хлоропластов, измеряют интенсивность переменной и замедленной флуоресценций в суспензиях, предварительно приведенных к одинаковому числу хлоропластов в них.

Известных авторам из научно-технической и патентной литературы решений с данной совокупностью признаков не обнаружено. Результат, полученный в данном решении и обусловленный совокупностью этих признаков, не достигался в известных решениях.

Изобретение поясняется чертежом, на котором представлена калибровочная зависимость оптической плотности суспензии от числа хлоропластов в ней.

Заявляемый способ заключается в следующем.

Проводят отбор проб, которые составляют из наиболее типичных растений, выращиваемых в полевых условиях. Сохраняя целостность, растение помещают в темновую камеру в условия микроклимата, обеспечивающие сохранение тургора. Таким образом приводят фотосинтетический аппарат растений в активное состояние. Затем в затемненном помещении срезают листья, промывают их дистиллированной водой, обсушивают, взвешивают, измельчают на отрезки длиной 5 7 мм и растирают в охлажденной ступке с некоторым количеством среды изолирования для выделения хлоропластов из тканей, Крупные частицы отделяют отжимом, затем суспензию фракционируют с помощью центрифуги, полученный после этого рыхлый осадок доводят средой изолирования до некоторого объема. После этого суспензии хлоропластов, выделенных из листьев, используют для построения калибровочной кривой. Для чего суспензии разбавляют в несколько раз с измерением их оптических плотностей. В неразбавленных и в каждой из разбавленных суспензиях подсчитывают число хлоропластов и строят график зависимости оптической плотности суспензии от количества хлоропластов в ней. По которому в последующем определяют количество хлоропластов в каждой из исследуемых суспензий. Затем выбирают суспензию с меньшим количеством хлоропластов в ней. Пересчетом определяют, в каком объеме других суспензий содержится такое же количество хлоропластов, как в суспензии с минимальным их содержанием. Отбирают этот объем и доводят средой изолирования до первоначального. Разбавленные таким образом суспензии подвергают темновой адаптации и измеряют интенсивность переменной и замедленной флуоресценций.

Пример.

Способ осуществляли в два этапа. Первый подготовительный, необходим для последующего выравнивания суспензий по количеству хлоропластов, включал построение калибровочной зависимости оптической плотности суспензии от количества органелл в ней, второй этап оценка состояния фотосинтетического аппарата видов и сортов травянистых растений по интенсивности флуоресценции хлоропластов.

Отбор проб и выделение хлоропластов из растительных тканей для первого и второго этапов осуществляли одинаково. При отборе проб растения, типичные для каждого сорта, по три с каждой из девяти повторностей, выделили из почвы без повреждения корневой системы. В полевых условиях растений, сохраняя целостность, помещали в полиэтиленовый пакет, предварительно этикетированный, создавая таким образом микроклимат, препятствующий потере тургора, и помещали в темновую камеру, отдельную для каждого сорта или вида для приведения фотосинтетического аппарата растений в активное состояние с момента отбора проб. Время пребывания растения в данных условиях составляло от 0,2 до 6 ч. Выделение хлоропластов из тканей осуществляли так, как описано в предлагаемом способе, при массе навески 0,3 г растирали листья с 7 мл среды изолирования. Среда изолирования для хлоропластов пшеницы содержала компоненты в следующих концентрациях: 0,04 М сахарозы, 0,01 М хлорида натрия, 0,07 М калий-натрий фосфатного буфера с pH 8,0. Крупные частицы отделяли отжимом, а затем подвергали центрифугированю с помощью ПУМ-1 при 2500 об/мин в течение 5 мин. Полученный осадок доводили средой изолирования до 10 мл. Для осуществления первого этапа использования растения первой пробы в серии, которая длится в течение вегетации или в течение нескольких лет. Второй этап осуществляли так же, как первый. Оптическую плотность разбавленных в 5 и 10 раз суспензий измеряли при длине волны 546 нм в кювете 1,055 на спектрофотометре СФ4А. Число хлоропластов подсчитывали с помощью счетной камеры Горячева. А интенсивность переменной и замедленной флуоресценции измеряли на флуориметре, собранном на основе ФЭК-56, ФЭУ-56, микроамперметра, высоковольтного выпрямителя, в кювете 20,075.

В исследование были включены сорта пшеницы мягкой, отличающейся по устойчивости. Оценка активности фотосинтетического аппарата каждого из сортов по интенсивности флуоресценции хлоропластов показала, что растения отличаются по соотношению величины замедленной и переменной флуоресценции хлоропластов стеблевых листьев (3-го и 5-го). У устойчивых сортов величина переменной флуоресценции выше, а величина замедленной ниже, чем у неустойчивых сортов.

Таким образом, по показателям, отражающим физиологическое состояние хлоропластов (значениям интенсивностей переменной и замедленной флуоресценций) можно получить различия в активностях фотосинтетического аппарата у сортов, например, пшеницы различной устойчивости.