способ получения стандартной позитивной панели сывороток для контроля качества иммуноферментных тест-систем и иммуноблотов

Формула изобретения

1. Способ получения стандартной позитивной панели сывороток для контроля качества иммуноферментных тест-систем и иммуноблотов, включающий приготовление иммунных сывороток, содержащих специфические антитела ко всем основным белкам тестируемого антигена и имеющих разную концентрацию этих антител, отличающийся тем, что разную концентрацию специфических антител в сыворотках стандартной панели получают путем разведения до требуемой концентрации нативных иммунных сывороток неиммунной сывороткой доноров, причем наибольшее количество сывороток стандартной панели приготавливают с концентрациями антител, близкими к их минимальной концентрации в этих сыворотках, служащей границей между положительными и отрицательными исследуемыми сыворотками, а наименьшее количество сывороток стандартной панели с концентрациями антител, близкими к их концентрациям в нативных позитивных сыворотках.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в приготовленные сыворотки стандартной панели дополнительно вводят стабилизирующие добавки и высушивают методом лиофилизации до остаточной влажности не более 2,0 мас. без изменения их специфической активности.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии и может быть использовано в технологии изготовления стандартных панелей сывороток, содержащих антитела к определенному антигену, для контроля качества тест-наборов и в научно-исследовательских целях.

Известен способ приготовления контрольных положительных сывороток для проверки чувствительности коммерческих тест-систем, включающий подбор иммунных сывороток, содержащих специфические антитела к тестируемому антигену (Инструкция по применению тест-систем для выявления антител к ВИЧ [1]).

Недостатком данного способа является низкая чувствительность тест-систем и невысокая надежность результатов анализа. Это обусловлено следующими причинами:

необходимо, чтобы все организации (производители, контрольные и пользователи) имели идентичные контрольные сыворотки, но т.к. реально они имеют разные сыворотки для контроля, то одна и та же тест-система, аттестованная с помощью разных сывороток, будет характеризоваться различным показателем чувствительности у производителя и в контрольной организации;

контрольные сыворотки изменяют свои характеристики в процессе хранения непредсказуемым образом. Поэтому повторная аттестация тест-системы по тем же контрольным сывороткам после некоторого срока хранения может давать измененные показатели чувствительности;

реакция антигена с иммуноглобулинами в значительной степени определяется биохимическим составом сыворотки крови, в определенной степени зависящим от возраста, среды обитания человека, наличия других вирусов и т.д. Поэтому тест-система, аттестованная на сыворотках крови неопределенного происхождения, не имеет надежно установленного уровня чувствительности.

Но самое главное заключается в том, что по единичной контрольной точке невозможно дать оценку правильности анализа, которая, как известно, имеет вероятностную природу. Поэтому для оценки правильности выполнения анализов необходимо иметь массив данных, полученных при анализе набора сывороток с аттестованными характеристиками.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ приготовления стандартной панели позитивных к вирусу иммунодефицита человека сывороток крови для оценки чувствительности и специфичности диагностических иммуноферментных тест-систем (Вопросы вирусологии, 1990, 2, с.125-128 [2]). Способ включает приготовление иммунных сывороток, содержащих специфические антитела ко всем основным белкам тестируемого антигена и имеющих разную концентрацию этих антител. Полученная указанным способом стандартная панель ГИСК им. Л.А.Тарасевича (ОСО 42-28-145-88) включает 50 сывороток крови больных и носителей ВИЧ-1, выявленных на территории СССР.

Недостатком способа получения указанной панели сывороток является также низкая чувствительность и правильность контроля тест-систем и иммуноблотов с помощью данной позитивной панели сывороток.

К недостаткам панели сывороток ОСО 42-28-145-88 следует отнести тот факт, что она составлена из нативных сывороток, имеющих обычно высокие титры, и что сыворотки находятся в жидком состоянии.

Использование в панели нативных сывороток не позволяет в должной мере проконтролировать чувствительность тест-систем, т.к. высоким титрам нативных сывороток сопутствуют очень высокие значения оптических плотностей (ОП) в ИФА. Поэтому панель ГИФКа оказывается малоэффективной в области значений ОП, близких к критическим значениям (ОП_крит). В дополнение, ОСО 42-28-145-88 из-за малого количества сывороток с низким содержанием антител (1-2 сыворотки из 50) малопригодна для оценки правильности результатов анализов, например, при дискриминации ложноположительных сывороток, имеющих значение ОП, близкие или совпадающие с ОП_крит.

В основу настоящего изобретения поставлена задача создания такого способа изготовления панели позитивных сывороток, которая обеспечивала бы повышение степени контроля тест-систем и иммуноблотов и правильности оценки результатов анализа.

Поставленная задача решается таким способом, что стандартная панель приготавливается из иммунных сывороток путем разведения их до низких содержаний антител. При этом разбавителем служит донорская сыворотка, не содержащая антитела к тестируемому антигену. Для сохранения неизменными значений специфических показателей к сывороткам панели добавляют стабилизатор. Наибольшее количество сывороток приготавливают с концентрациями антител, близкими к критической их концентрации в сыворотках, являющейся границей между положительными и отрицательными сыворотками. Наименьшее количество сывороток в панели имеют концентрацию антител, близкую к их концентрации в нативных сыворотках. После приготовления сыворотки высушивают по специальному режиму методом лиофилизации до уровня остаточной влажности не более 1 мас.

Новыми по сравнению с прототипом являются следующие признаки предлагаемого изобретения:

нативные сыворотки разводят неиммунной сывороткой здоровых доноров с добавлением стабилизаторов. Это позволяет сохранить концентрацию биохимических компонентов сыворотки практически неизменной;

панель составлена, главным образом, из сывороток с низкой концентрацией антител, имеющих значения оптических плотностей в ИФА, близкие к значениям ОП_крит (cut off), которая служит условной границей между положительными и отрицательными сыворотками;

панель сформирована из лиофилизированных сывороток с добавками стабилизаторов.

Сравнение панели сывороток, приготовленной в соответствии с заявляемым способом, с панелью ОСО 42-28-145-88 того же назначения, приготовленной по способу-прототипу, показывает, что отличный от прототипа набор сывороток с низкой концентрацией антител в сухой стабилированной форме обеспечивает новое ранее не известное свойство: уменьшение потери специфической активности при хранении панелей сроком около 5 лет и возможности с помощью тест-систем и иммуноблотов надежно и правильно выявлять сыворотки с более низкой концентрацией антител, т.е. фиксировать развитие инфекции на более ранней стадии заболевания.

Пример. Для приготовления панели сывороток с низкой концентрацией антител были отобраны в процессе аттестации 8 нативных сывороток крови ВИЧ-инфицированных лиц. Нативные сыворотки разводили неиммунной сывороткой здорового донора с добавлением стабилизатора. В результате разведения были приготовлены 16 сывороток с различной концентрацией антител. Кратность разведения подбиралась таким образом, чтобы значения оптических плотностей при выполнении ИФ-анализа с помощью спектрофотометра лежали в диапазоне от значений ОП_крит для выбранной тест-системы "Рекомбинант ВИЧ" (НПО "Вектор", г. Новосибирск) до значений ОП близких или равных 1,5 оптических единицы (о.е.). При этом 8 сывороток имели значения 0,4 0,75 о.е. 6-сывороток 0,75 1,15 о.е. и две сыворотки имели значения ОП в диапазоне 1,15 1,5 о.е.

Все сыворотки были розлиты по 200 мкл во флаконы и лиофильно высушены на установке "TG-50" (ФРГ). Режим лиофилизации был подобран по результатам предварительного физико-химического анализа фазовых превращений в разводящей донорской сыворотке со стабилизатором при замораживании. Подготовленные сыворотки панели были заморожены со скоростью 0,2-0,5^oC/мин до температуры -60^oC и выдержанны при этой температуре в течение 16 ч. На этапе сублимации льда температура материала поддерживалась ниже температуры стеклования (-35^oC). Средняя скорость нагревания материала на этапе досушивания составляла 6^oC/мин, время выдерживания при 27^oC составило 8 ч.

Лиофильно высушенные сыворотки панели имели остаточное содержание воды около 1,0 мас. Флаконы с сыворотками были укупорены под вакуумом.

Все высушенные сыворотки панели были аттестованы после лиофилизации в тест-системах "Антиген", "Рекомбинант ВИЧ" и "Пептоскрин 2", а также в иммуноблоте "Du Pont". Установлено, что в процессе лиофилизации специфическая активность сывороток не изменилась.

Стабильность сывороток в различных условиях хранения в темноте во флаконах определялась по результатам теста термодеградации при температурах -20, +4, +20, +37^oC. По результатам теста установлено, что сыворотки панели должны сохранить неизменной специфическую активность в течение пяти лет.

Таким образом, экономическая эффективность применения предлагаемого способа изготовления стандартных панелей позитивных сывороток заключается в том, что настоящая панель имеет срок службы в течение пяти лет, в то время как срок службы прототипа не превышает шести месяцев при хранении панелей в одинаковых условиях при температуре 2 8^oC.

Во-вторых, панель с низкой концентрацией антител включает только 16 сывороток, что значительно удешевляет стоимость материала, заготовляемого для производства панелей.

В-третьих, если в контрольном испытании аттестуемая тест-система не выявит даже одну сыворотку предлагаемой панели, то она будет забракована, т.к. ее чувствительность будет ниже разрешенного 95% уровня. Если же тест-система не выявит даже две сыворотки панели прототипа, то она все равно будет признана годной к употреблению, т.к. ее чувствительность формально превосходит уровень 95% При этом важно отметить, что ошибка аттестации будет иметь и большой отрицательный социальный эффект, так как может оказаться основой неправильного результата медицинского заключения.

Промышленная применимость. Изобретение может быть использовано в биотехнологии, медицине и ветеринарии при оценке качества тест-систем и иммуноблотов для выявления антител.