способ получения иммуностимулятора

Формула изобретения

Способ получения иммуностимулятора, включающий замораживание сырья, измельчение, экстрагирование 3% -ным раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка, фильтрование, отделение надосадочной жидкости и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что надосадочную жидкость подвергают стерилизующей фильтрации и выделяют из нее, концентрируя в 5,5 раз иммуностимулятор методом ультрафильтрации через пористый материал с пределом разделения 1000 5000 D с последующими очисткой в подщелоченной до рН 9 10 воде, повторным концентрированием на том же пористом материале и стерилизацией, а в качестве сырья используют ганглии кальмара.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и медицинской промышленности, в частности к способам получения иммуностимуляторов из животного сырья. Препарат, полученный по предлагаемому способу, может быть использован для стимулирования иммунного ответа, например, у животных-продуцентов, сельскохозяйственных животных и человека, а также при производстве иммунных сывороток.

Уровень техники заключается в следующем. Известен способ получения иммуностимулятора, включающий гомогенизацию иммунного сырья. (Белокрылов Г.А. Бюлл. Эксперим. биол. и мед. 1978, N9, с. 327-329).

Недостатком данного иммуностимулятора является малоэффективность и недостаточная активность.

Наиболее близким аналогом является способ получения иммуностимулятора, включающий замораживание обработанных ацетоном лимфатических узлов животных, измельчение, экстрагирование 3% раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка, фильтрование и выделение целевого продукта. (Авторское свидетельство СССР N 1187824, кл. А 61 К 35/30, 1985г.).

Недостатком данного способа является трудоемкая технология с использованием ацетона, являющегося вредным веществом, пары которого присутствуют в атмосфере рабочей зоны и атмосферных выбросах.

Сущность изобретения заключается в следующем. Изобретение направлено на исключение из технологии стадии осаждения целевого продукта ацетоном и использования в качестве сырья ганглиев кальмара, являющихся отходами переработки продуктов моря.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в возможности упрощения процесса получения иммуностимулятора с высокой активностью и разработке экологически чистой технологии при переработке вторичного сырья.

Существенные признаки, характеризующие изобретение, заключаются в следующем.

Ограничительные признаки: замораживание сырья, измельчение, экстрагирование 3% раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка, фильтрование, отделение надосадочной жидкости и выделение целевого продукта.

Отличительные признаки: в качестве сырья используют ганглии кальмара, надосадочную жидкость подвергают стерилизующей фильтрации и выделяют из нее, концентрируя в 5,5 раза, иммуностимулятор методом ультрафильтрации через пористый материал с пределом разделения 1000 5000 Д с последующей очисткой в подщелоченной до pH 9,0 10,0 воде, повторным концентрированием на том же пористом материале и стерилизацией.

Причинно-следственная связь между совокупностью существенных признаков заявляемого изобретения и достигаемым результатом заключается в следующем.

Использование в качестве сырья ганглиев кальмара позволяет утилизировать ценное биологическое сырье, получая из него высокоактивный иммуномодулятор в большем объеме, чем из дорогостоящих, трудновыделяемых в ограниченном количестве лимфоузлов животных.

В результате стерилизующей фильтрации отцентрифугированный экстракт ганглиев кальмара освобождается от бактериального загрязнения и пирогенов.

Но после стерилизующей фильтрации экстракт содержит кроме фракций, обладающих иммуностимулирующей активностью, и низкомолекулярные примеси. Эти примеси удаляют путем ультрафильтрации через пористый материал с пределом разделения 1000 5000 Д в подщелоченной воде с pH 9,0 10,0, которая способствует более полному удалению низкомолекулярных примесей, а также выделению из стерильного экстракта иммуностимулятора.

В результате последующей стерилизации иммуностимулятора получают стерильный и апирогенный препарат.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Пример 1.

Берут 7 кг замороженных ганглиев кальмаров, которые измельчают на электромясорубке и экстрагируют в 42 л воды, подкисленной уксусной кислотой до pH 3,5. К раствору добавляют 42 г хлористого цинка. Экстракцию проводят в течение 28 ч, перемешивая непрерывно по 1 ч через каждые 8 ч.

Экстракционную массу центрифугируют на ультрацентрифуге СГО-100 со скоростью 20,02,0 л/ч.

Центрифугат фильтруют последовательно через мембранные фильтры с размерами пор 0,8; 0,45 и 0,22 мкм в стерильных условиях.

Очищенный стерильный фильтрат концентрируют в 5,5 раза на ультрафильтрационной установке с полыми волокнами ВПУ-5 (предел разделения 5000 Д).

Затем производят диафильтрацию концентрата на той же установке в 3-х кратном объеме воды, подщелоченной до pH 10. Очищенный концентрат снова концентрируют в 2 раза на тех же волокнах. Полученный полуфабрикат иммуностимулятора подвергают стерилизующей фильтрации через мембранные фильтры с размерами пор 0,22 мкм, разливают в стерильных условиях во флаконы или ампулы и подвергают лиофильной сушке.

В результате получают препарат стерильный, апирогенный для инъекций.

Выход препарата 0,07 кг.

Пример 2.

Берут 5 кг замороженных ганглиев кальмара, измельчают и экстрагируют в 30 л воды, подкисленной уксусной кислотой до pH 4,5. К раствору кислоты добавляют 30 г хлористого цинка. Экстракцию проводят в течение 48 ч, перемешивают непрерывно по 1 ч через каждые 8 ч.

Гомогенат центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. Центрифугат фильтруют на многорамном фильтре ПФ-39 последовательно через пластины Ф-300 и СФ-300. Фильтрацию проводят под давлением 0,10,05 мПа со скоростью 20,02,0 л/ч в стерильных условиях.

Очищенный стерильный фильтрат концентрируют в 5,5 раза на ультрафильтрационном модуле, снаряженном пористыми мембранами с пределом разделения 1000 Д.

Затем производят диафильтрацию концентрата на том же разделительном аппарате в 3-х кратном объеме воды, подщелоченной до pH 9,0. Очищенный концентрат вновь концентрируют в 2 раза на тех же мембранах. Полученный полуфабрикат иммуностимулятора подвергают стерилизующей фильтрации, стерильно разливают во флаконы или ампулы и лиофильно высушивают.

Выход вещества 0,055 кг.

Изучение химического состава препарата с помощью гель-фильтрации, ионнообменной хроматографии, электрофореза в тонком слое целлюлозы и аминокислотного анализа показало, что выделенное из ганглиев кальмаров вещество представляет собой комплекс полипептидов с молекулярной массой 1000-10000 дальтон с максимумом поглощения 2732 нм.

Иммунномодулирующие свойства препарата, полученного из ганглиев кальмара, изучены в соответствии с "Правилами доклинической оценки безопасности фармакологических свойств". Опыты выполнены на 140 мышах линии СВА, 80 мышах линии С 57 ВС, 20 мышах гибридах F₁, 80 белых нелинейных мышах, 12 крысах линии Вистар, 64 морских свинках.

Подробно изучены влияния препарата на гуморальный и клеточный иммунный ответ при разных дозах введения: одной терапевтической (0,005 мг/кг), 10 терапевтических, 1000 терапевтических.

Установлено, что иммуномодулятор из ганглиев кальмара не вызывает увеличения массы и клеточности лимфоидных органов, не повреждает жизнеспособности иммунокомпетентных клеток, восстанавливает уровень Т-лимфоцитов, их рецепторы, стимулирует бласттрансформацию лимфоцитов и фагоцитарную активность макрофагов, активизирует гуморальное звено иммунитета при воздействии на организм как инфекционного, так и неинфекционного антигенов, но в то же время угнетает образование реагиновых антител при ГНТ и тормозит ингибирование реакции трансплантации против хозяина.

Основные результаты проведенных исследований представлены в табл. 1-3, где даны материалы оценки иммунного ответа на терапевтическую дозу препарата, полученного из ганглиев кальмара.