производные n-фенилтиомочевины и способ их получения

Формула изобретения

1. Производные N-фенилтиомочевины формулы I



где R₁- пропил, изопропил или 2-метилпропил;

R₂ галоген с атомным номером 9-35;

R₃ алкил с 1-4 атомами углерода.

2. Соединение по п.1, где R₃ алкил с 1-3 атомами углерода.

3. Соединение по п.1, где R₁ н.пропил; R₂ хлор и R₃-метил.

4. Соединение по п.1, где R₁ 2-метипропил; R₂ хлор; R₃ метил.

5. Соединение по п.1, где R₁, R₂ и R₃ - соответственно каждый CH (CH₃)₂; -Cl; -CH₃, или -СН₂ СН₂СН₃; -Сl; -СН₂СН₃, или -СН₂СН₂СН₃; -F; -СН₃ или СН₂СН₂СН₃; -Br; СН₃.

6. Способ получения производных N-фенилтиомочевины формулы I



где R₁ пропил, изопропил или 2-метилпропил; R₂ галоген с атомным номером 9 35; R₃ алкил с числом атомов углерода 1-4, отличающийся тем, что соединение формулы II



где R₂, R₃ имеют указанные значения, подвергают взаимодействию с соединением формулы III

R₁NH₂,

где R₁ имеет указанное значение.

Описание изобретения к патенту

Изобретение касается производных N-фенилтиомочевины и их фармацевтического применения, а именно соединений формулы (I)



где R₁ пропил, изопропил или 2-метилпропил;

R₂ галоген с атомным номером от 9 до 35;

R₃ алкил с 1-4 атомами углерода.

R₁ предпочтительно представляет собой пропил или 2-метилпропил, а R₂ хлор. R₃ предпочтительно представляет собой метил, этил, изопропил или трет. -бутил, предпочтительно метил, этил или изопропил, особенно метил.

В подгруппе соединений формулы (I) R₁ представляет собой пропил или 2-метилпропил, а R₃ -алкил с 1-3 атомами углерода, в частности R₁ пропил; R₂ фтор или хлор, а R₃ метил или этил, в частном случае R₃- метил, в частности R₁ 2-метилпропил.

Некоторые соединения формулы (I) могут иметь центр асимметрии. Следовательно, имеется пара энаниомеров каждого такого соединения. Все возможные изомеры и рацематы такого рода относятся к данному изобретению. Предпочтительные соединения лишены какого-либо центра асимметрии.

Алкил с 1-4 атомами углерода предпочтительно представляет собой метил или этил, в особенности метил. Галоген предпочтительно представляет собой хлор.

В подгруппе соединений формулы (I) (соединения Ip) R₃ является метилом.

Еще в одной подгруппе соединений формулы (I) R₃ является алкилом с 1-3 атомами углерода.

Соединение формулы (I) можно получить способом, который включает проведение реакции соответствующего соединения формулы (II)



где R₂ и R₃ определены выше

с соответствующим соединением формулы (III), а именно с соединением формулы R₁NH₂, где радикал R₁ определен выше.

Указанный способ получения соединений формулы (I) можно осуществить как обычно.

Этот способ заключается в проведении реакции изотиоцианата с амином. Целесообразно, чтобы температура реакции составляла 10-40^oC, предпочтительно 20-30^oC. Обычно применяют безводный инертный органический растворитель, такой как галогенированный низший алкан, например метиленхлорид, или алкил C_1-3-алканоат C_2-3, например этилацетат.

Соединение формулы (I) можно выделить (при желании в чистом виде) из реакционной смеси обычными приемами.

Соединение с центром асимметрии можно, например, получить в оптически чистом виде с использованием оптически чистого исходного вещества.

Соединение, используемое в качестве исходного вещества, хотя и не описано здесь, но является известным или может быть получено известными методами из известных исходных соединений, например, так, как это описано в примерах.

Изобретение проиллюстрировано нижеследующими примерами. Все температуры указаны в ^oC. МР означает температуру плавления.

Пример 1.

N-(5-хлоро-2-метилфенил)-N"-пропилтиомочевина

R₁ н.пропил; R₂ хлор; R₃ метил)

Соединение формулы (III), а именно н.пропиламин, в количестве 163 г вводили по каплям в течение 40 мин в раствор 390 г 5-хлоро-2-метилфенилизотиоцианата (соединение формулы II) в 700 мл этилацетата. Этот раствор перемешивали при 15^oC в газовой среде азота при таком расходе, чтобы поддерживать температуру 25-30^oC. По завершении введения реагента реакционную смесь перемешивали при 25-30^oC в течение 5 мин и добавляли к ней 2,1 л н.гептана, после чего смесь охлаждали до 0^oC в течение 1 ч, а затем твердое вещество собирали вакуумным фильтрованием, промывали двумя порциями (по 250 мл) холодного (5^oC) н.гептана и высушивали при 25 мм рт.ст. около 18 ч до постоянной массы. В результате было получено соединение, указанное в заглавии, а именно твердое вещество белого цвета с температурой плавления 97-98^oC.

Пример 2.

N-(5-хлоро-2-метилфенил)-N"-2-метилпропилтиомочевина

(R₁ 2-метилпропил, R₂ хлор, R₃ метил)

Раствор 25,0 г 5-хлоро-2-метилфенилизотиоцината (соединение формулы II) в 25 мл метиленхлорида вводили по каплям в раствор 10,0 г изобутиламина (соединение формулы III) в 150 мл метиленхлорида, перемешиваемый при 20-25^oC, после чего реакционную смесь перемешивали при 20-25^oC в течение 2 ч. Далее отгоняли метиленхлорид, причем в процессе отгонки постепенно вводили метил-трет. бутиловый эфир. Образовавшемуся раствору метил-трет.бутилового эфира давали остыть до 20-25^oC. Получившееся твердое вещество собирали фильтрованием, промывали метил-трет.бутиловым эфиром и высушивали в вакууме до постоянной массы. В результате было получено соединение, указанное в заглавии и имеющее температуру плавления 114-116^oC.

Аналогично примерам 1, 2 были также получены соединения формулы (I) (см. табл.1).

Соединения формулы (I) обладают фармакологической активностью, представляющей интерес. Они показаны для применения в качестве фармацевтических препаратов.

В частности, они повышают уровни липопротеина высокой плотности (HDL, HDL-холестерин) и аполипопротеина А-I (Аро А-I) в сыворотке крови. Большинство предложенных соединений имеет дополнительное положительное качество, выражающееся в снижении общего уровня триглицерида в сыворотке крови.

Наличие указанной активности можно определить по какой-либо общепринятой методике испытаний, например из тех, что описаны ниже.

а) Испытание А

Испытание на HDL-холестерин в живом организме (in vivo).

Самцов крыс линии Sprague-Dawley массой по 200-225 г рассаживали парами по клеткам и на протяжении 7-8 сут. кормили специальной смесью Purina Rodent Chav 5001-S с добавкой 0,25% холиновой кислоты и 0,75% холестерина, причем еду и воду давали вдоволь. Затем каждое испытуемое вещество в количестве 0,005-0,20% от массы рациона назначали на срок от 8 до 21 сут. группе из шести крыс, содержавшихся на рационе с упомянутой добавкой. Массу тела и количество поедаемого животными корма регистрировали перед назначением рациона, перед назначением испытуемого вещества, а также в момент завершения установленного режима кормления.

В момент завершения установленного режима кормления крыс анестезировали, умерщвляли обескровливанием, после чего собирали кровь, которую во время свертывания выдерживали на льду, и отделяли сыворотку. Равные дозы сыворотки были отрегулированы до плотности 1,06 г/мл раствором хлорида натрия и охлаждены для хранения с вечера до утра. Остальные равные дозы сыворотки охлаждали и замораживали для длительного хранения.

HDL отделяли методами микроультрацентрифугирования (MUC) или интенсивной протеиновой жидкостной хроматографии (FPLC). Метод MUC состоит в следующем. При частоте вращения 42000 мин^-1 центрифугировали 175 мл кровяной сыворотки, отрегулированной до плотности 1,06 г/мл, в роторной центрифуге Beckman 42,2 Ti при 20^oC в течение 2,5 ч. Жидкость в количестве 95 мкл отбирали поверхностным фракционированием, а 80 мкл жидкости оставалось в донной части. Фракционирование методом FPLC осуществляли с использованием препарата "Сепароза 6" (Separose 6), представляющего собой зернистую агарозу с высокой степенью образования поперечных связей, имеющую диаметр сухих зерен порядка 20-40 мкм, по методике хроматографии с прониканием сквозь гель, а именно по методике Кифта и сотр. см. Kieft et al.-J.Lipid Res. 1991, V 32, p 859-866, модифицированной приемами, которые описали Франс и сотр. см. France et al. -Laboratory Robotics Automation 1990, V. 2, p 155-173. Используемый в колонке буферный раствор представлял собой солевой раствор, буферизованный посредством Tris, а именно посредством 0,05М Tris (2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиола), с добавкой хлорида натрия в дистиллированной деионизированной воде (dd H₂O), содержащей 0,01% азида натрия. Инъецировали по 200 мкл сыворотки, после чего собирали сорок 0,5 мл фракций.

Содержание холестерина определяли, объединив данные фракции, полученные на роторной центрифуге 42,2 Ti, и фракции, полученные методом FPLC, с использованием стандартного набора фирмы "Сигма диагностикс" (Sigma Diagnostics), предназначенного для энзиматического определения холестерина по методике N 352, модифицированной для применения с микротитровальными тарелочками, имеющими по 96 лунок. Преобразованный реагент (после добавления воды) содержал 300 ед/л оксидазы холестерина, 100 ед/л эстеразы холестерина, 1000 ед/л пироксидазы (из хрена), 0,3 М/л 4-аминоантипирина и 30,0 М/л пара-гидроксибензолсульфоната в буферном растворе с pH 6,5. Согласно этому методу для гидролиза сложных эфиров холестерина до свободного холестерина применяют эстеразу холестерина. Свободный холестерин подвергается окислению до получения перекиси водорода, которая служит для образования хинонилинового красителя. Так как данная реакция протекает количественно, то колориметрически измеренная концентрация красителя прямо пропорциональна содержанию холестерина в пробе. Калибровочную, стандартную и испытуемую пробы можно разбавить солевым раствором в том случае, когда показания концентрации холестерина выходят за пределы интервала линейной зависимости. В лунках микротитровальной тарелочки с 96 лунками смешивали по 20 мкл калибровочной, стандартной или испытуемой пробы соответственно с 200 мл равновеликими дозами реагента. Каждую смесь инкубировали при 20-25^oC в течение 25 мин, после чего определяли поглощение при 490, 492 или 500 нм при помощи колориметрического считывателя поглощения для содержимого микротитровальной тарелочки.

"Верхний" холестерин, а именно LDL-холестерин, определяли вычитанием. Количественный показатель разделения микроультрацентрифугированием устанавливали методом электрофореза универсального геля агарозы фирмы "Корнинг" (Corning) с использованием красного красителя Fat-Red 7В.

Содержание фактора Аро А-I в FPLC-фракции определяли невосстановительным методом SDS-PAGE, который предложили Франс и сотр. см. France et al.-J. Lipid Res. 1989, V, 30 p 1997-2004. HDL-холестерин количественно определяли по содержанию холестерина во фракциях, содержащих фактор Аро А-I при отсутствии иммунореактивного протеина Аро В.

Общее содержание триглицеридов определяли в сыворотке крови с использованием специфического по отношению к триглицеридам набора реагентов Triglicerides-GB фирмы "Берингер Мангейм Диагностикс" (Boehringer Mannheim Diagnostics) N 877557 по каталогу, приспособленного для случая проведения испытаний посредством микротитровальных тарелочек следующим образом. Реагенты готовили методом, описанным выше. В каждую лунку микротитровальной тарелочки с 96 лунками вводили рабочий раствор 1 в количестве 100 мкл, а также 20 мкл разбавленной сыворотки крови при соотношении сыворотки крови и солевого раствора (последний представляет собой 0,15 М раствор хлорида натрия в dd H₂O), равном 1:1, с последующим перемешиванием и инкубированием содержимого лунок при 20-25^oC в течение по меньшей мере 5 мин. Далее в каждую лунку вводили по 100 мкл рабочего раствора 2, после чего содержимое лунок перемешивали и инкубировали при 20-25^oC по меньшей мере в течение 5 мин с последующим считыванием значений поглощения при 490, 492 или 500 нм. Общее содержание триглицерида (мг/дл) в сыворотке крови вычисляли, сравнивая поглощение испытуемой пробы с поглощением известных проб.

Для определения содержания HDL-холестерина и общего содержания триглицерида в пробах сыворотки крови можно воспользоваться также и другими обычными методами.

b) Испытание В: испытание на Аро А-I

Уровень Аро А-I в сыворотке крови подопытных животных (тех же, что и в испытании А) определяли посредством испытания на фактор Аро А-I крыс по методике, предусматривающей использование энзимно-связанного иммуносорбента (Engyme-Linked Inmunosorbent Assay, ELISA) следующим образом.

1. Получение и очистка антитела "анти-Аро А-I крысы" кролика

Фактор Аро А-I крысы выделяли в чистом виде из сыворотки крови подобранных группами крыс последовательным центрифугированием и выделением липопротеинов высокой плотности (HDL) крысы. При последующем делипидировании Аро А-I отделяли от прочих HDL-протеинов методом гелевой фильтрационной хроматографии. У трех кроликов, выведенных в хозяйстве Росопо Rabbit Farms г. Канденсис, шт. Пенсильвания, США, содержание антисывороточных антител было повышено серией подкожных инъекций очищенного фактора Аро А-I крысы согласно обычным методикам иммунизирования. Спустя год повторных скрещиваний антисывороточные тела были подобраны группами (poobd), разделены на равные дозы и заморожены при -20^oC. Далее неочищенные антисывороточные тела размораживали и переносили в активированную цианбромидом колонку с "Сефарозой" (Sepharose) CI-4B (зернистая агароза с величиной диаметра сухих зерен 60-140 мкм), с которой ковалентными связями был связан очищенный HDL. Колонку промывали солевым раствором. Очищенное антитело вымывали IM раствором глицина с pH 3. Глицин удаляли диализом с использованием солевого раствора, буферизованного посредством Tris, чтобы получить концентрированный раствор очищенного кроличьего антитела "анти-Аро А-I крысы".

2. Буферные растворы, реактивы и стандартные пробы

буферный раствор (для сорбирования) на основе карбоната натрия: 2,25 г карбоната натрия, 4,40 г бикарбоната натрия и 0,15 г азида натрия растворяли в 1.4 л dd H₂O, после чего посредством гидроксида натрия регулировали pH до 9,6 и разбавляли буферный раствор содой (dd H₂O) до общего объема 1,5 л;

0,5 М Tris (pH 8): раствор 60,55 г Tris-HCI (2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол-гидрохлорид) в 1,0 л dd H₂O регулировали до pH 8 посредством 1,0 н. раствора гидроксида натрия,

вторичный буферный раствор для антитела (secondary antibody buffer): 200 мл 0,5 M Tris (pH8) добавляли к раствору 40 г альбумина бычьей сыворотки (BSA, Cohn Fraction V) в 1,8 л dd H₂O, после чего туда же добавляли 0,2 г азида натрия, а затем 18,0 г хлорида натрия;

буферный раствор для субстрата (substrate buffer) 0,1 г азида натрия при перемешивании вводили в раствор 105,1 г диэтаноламина в 500 мл dd H₂O, после чего туда же добавляли 10 мл 0,5 М раствора гексагидрата хлорида магния, а затем регулировали pH до 9,8 12 н.соляной кислотой и разбавляли раствор с использованием dd H₂O до общего объема 1 л,

промывочный буферный раствор 30 х ELISA: готовили раствор, содержащий сочетание 525,96 г хлорида натрия, 76,68 г Tris, 6 г азида натрия и 30 мл препарата "Твин 20", (Tween 20), представляющего собой монолаурат сорбитана полиоксиэтилена 20, после чего регулировали pH до 7,3 12 н.соляной кислотой, а затем раствор разбавляли до общего объема 2 л с использованием dd H₂O;

промывочный буферный раствор 1 х ELISA: 1 объем промывочного буферного раствора 30 х ELISA разбавляли 29 объемами dd H₂O;

пробо-разбавительный буферный раствор (sample diluent buffer): тщательно перемешивали 886,34 мл вторичного буферного раствора для антитела и 113,66 мл препарата "Твин 20" до получения раствора препарата "Твин 20" с концентрацией 11,366% (об. доли),

буферные растворы для разбавления стандартных проб: (А) тщательно перемешивали 780 мл вторичного буферного раствора для антитела и 220 мл препарата "Твин 20" до получения раствора препарата "Твин 20" с концентрацией 22% (об. доли), (В) тщательно перемешивали 890 мл вторичного буферного раствора для антитела и 110 мл препарата "Твин 20" до получения раствора препарата "Твин 20" с концентрацией 11% (об. доли),

сбор А сыворотки крыс: при проведении каждого испытания именно этот источник кровяной сыворотки крысы использовали для построения стандартной кривой, сыворотку калибровали по очищенному фактору Аро А-I; в 1 дл такой кровяной сыворотки содержится 452,7 мг фактора Аро А-I;

сбор В сыворотки крыс: сыворотку применяли в качестве нижнего внутреннего стандарта при проведении каждого испытания с целью мониторинга девиации испытаний, 1 дл данной кровяной сыворотки содержит 40 мг фактора Аро А-I;

сбор С сыворотки крыс: сыворотку получали от крыс, подвергнутых воздействию справочного соединения, а именно гемфиброзила, и использовали ее в качестве верхнего внутреннего стандарта при мониторинге девиации испытаний, 1 дл данной кровяной сыворотки содержит 70 мг фактора Аро А-I.

3. Последовательность операций

Очищенный фактор Аро А-I крысы, взятый из замороженной порции, содержащий 942 мкг в 1 мл, разбавляли натрий-карбонатным буферным раствором для сорбирования до конечной концентрации 3,7 мкг/мл. В каждую лунку микротитровальных тарелочек из полистирола Nunc с 96 лунками вводили по 100 мкл указанного раствора. Далее выдерживали при 4^oC в течение 48 ч для сорбирования фактора Аро А-I на тарелочках. Затем тарелочки промывали промывочным буферным раствором 1 х ELISA, после чего неспецифические места на тарелочке блокировали инкубированием вторичного буферного раствора для антитела (по 200 мкл в лунке) на протяжении ночи также на холоду. В таком состоянии тарелочки хранились до востребования (до трех недель).

В день проведения испытания специальные тарелочки ELISA (2 тарелочки с 36 пробами сыворотки крысы на каждой) промывали 4 раза промывочным буферным раствором 1 х ELISA. В каждой лунке до введения испытуемой пробы оставляли по 100 мкл промывочного раствора 1 х ELISA. По 10 мкл каждой анализируемой пробы кровяной сыворотки крысы смешивали с 290 мкл пробо-разбавительного буферного раствора до конечного разбавления 1:30 и до конечной концентрации препарата "Твин 20", равной 11% Аналогичным образом обрабатывали шестикратные пробы сборов В и С внутреннего стандарта сыворотки крыс.

Сбор А сыворотки крысы в количестве 2,0 мл смешивали с равным объемом стандартного пробо-разбавительного буферного раствора А, чтобы обеспечить разбавление 1: 2 и концентрацию препарата "Твин 20", равную 11% Далее эту пробу подвергали серии разбавлений разбавляющим раствором В для стандартных проб, чтобы обеспечить разбавление 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128.

Разбавленные стандартные пробы и испытуемые пробы, находящиеся в лунках микротитровальных тарелочек ( не типа ELISA), помещали в обогреваемый инкубатор с температурой 52^oC на 2 ч. После охлаждения до 20-25^oC с испытуемых тарелочек ELISA удаляли промывочный буферный раствор. Далее на испытательные тарелочки ELISA переносили дозами по 75 мкл стандартные и испытуемые пробы. Затем в каждую лунку вводили по 75 мкл раствора очищенного антитела "анти-Аро А-I крысы" кролика, причем этот раствор был разбавлен в отношении 1:75 вторичным буферным раствором антитела. После этого каждую тарелочку слегка встряхивали, чтобы облегчить смешивание антитела с пробой, а далее герметизировали и подвергали инкубированию при 20-25^oC в течение 18 ч. По окончании инкубирования каждую тарелочку четырежды промывали промывочным буферным раствором 1 х ELISA. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл связанного щелочной фосфатазой антитела "анти-lgG кролика" козы, разбавленного в отношении 1: 1000 вторичным буферным раствором для антитела. Далее указанным компонентам давали возможность вступить во взаимодействие при 20-25^oC в течение 3 ч. Каждую тарелочку снова промывали, осушали отсасыванием, после чего в каждую лунку вводили буферный раствор для субстрата с концентрацией динатрий-пара-нитрофенилфосфата 1 мг/мл. Последнее соединение представляет собой хромогенный субстрат с интенсивностью самоокрашивания, обратно пропорциональной содержанию фактора Аро А-I в пробе. Далее проводили мониторинг каждой тарелочки на спектрофотометре ELISA в течение 1-3 ч. Когда в лунках, не содержащих фактора Аро А-I (максимально интенсивное окрашивание) оптическая плотность при 405 нм достигала 1,0, осуществлялось считывание каждой тарелочки считывателем ELISA.

Затем строили стандартный график зависимости оптической плотности от логарифма концентрации. Испытуемые пробы сопоставляли с этим графиком, после чего выражали концентрацию фактора Аро А-I в мг/дл.

Упомянутые испытания А и В показывают, что предложенные соединения активны в суточных дозировках (на 1 кг живой массы тела) в интервале 10-200 мг.

Следовательно, рассматриваемые соединения показаны для применения с целью повышения уровня липопротеина высокой плотности (HDL, HDL-холестерин и аполипопротеин А-I) в кровяной сыворотке, причем многие из них показаны также для снижения общего уровня содержания триглицерида в кровяной сыворотке, а значит показаны для лечения атеросклероза.

Точная дозировка при назначениях, разумеется, зависит от ряда обстоятельств, включая состояние организма, природу и серьезность заболевания, подлежащего лечению, форму назначения лекарства и конкретно взятое активное вещество. Однако, как правило, удовлетворительные результаты удается получить при суточных дозировках 400-2000 мг, обычно назначаемых порциями по 2-4 приема в сутки.

Рассматриваемые соединения можно назначать любым обычным образом, в частности путем приема внутрь, предпочтительно через полость рта, например в виде таблеток или капсул, или же введением извне, например в виде инъекций растворов или суспензий.

Предпочтительными являются соединения примеров 1, 2 и 3, более предпочтительные соединения примеров 1 и 2, наиболее предпочтительно соединение примера 2.

Например, была установлена следующая активность рассматриваемых соединений.

Таким образом, приведенные данные показывают (см.табл.2), что для указанного применения соединения примеров 1 и 2 можно назначать в дозировках, меньших, чем обычно используемые в случае гемфиброзила при одинаковой форме назначения, а именно в дозировках около 400-1000 мг/сут для приема через полость рта.

Фармацевтические составы, содержащие соединение формулы (I) в свободном виде или же в виде фармацевтически приемлемой соли, можно приготовить как обычно, комбинируя активное соединение с по меньшей мере одним подходящим фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Например, можно применять штучные дозировки, содержащие 200-500 мг активного соединения.

Таким образом, изобретение также касается фармацевтического состава, содержащего соединение формулы (I) в сочетании с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Изобретение также охватывает соединение формулы (I), предназначенное для использования в качестве лекарства, в частности для применения для профилактики или текущего лечения атеросклероза.

Изобретение также касается способа получения лекарственного средства, который состоит в смешивании соединения формулы (I) с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.

Кроме того, изобретение охватывает использование соединения формулы (I) для производства лекарства против атеросклероза.