способ получения гидролизата для вирусологических сред

Формула изобретения

1. Способ получения гидролизата для вирусологических сред, включающий тепловую обработку в закрытом объеме острым паром находящегося в воде мясокостного сырья после обваловки туш преимущественно крупного рогатого скота при давлении в закрытом объеме 1,5 5,0 атм и отделение полученного бульона, его фильтрацию, сепарирование, сушку, разведение полученного порошка в деионизированной воде при соотношении массы последнего к массе воды не менее 1 10, тепловую обработку полученного раствора при температуре не менее 70^oС, последующее охлаждение раствора, добавление экстракта поджелудочной железы и консерванта, гидролиз при температуре 37 39^oС в течение не менее 48 ч, повторную тепловую обработку и фильтрацию полученного гидролизата, отличающийся тем, что тепловую обработку исходного сырья острым паром осуществляют в течение не менее 2,5 ч при температуре пара, соответствующей упомянутой величине давления, после чего герметизируют закрытый объем обработки и выдерживают сырье в полученном бульоне не менее 4 ч до конечной температуры бульона не менее 100^oС, при этом в качестве экстракта поджелудочной железы используют толуоловый экстракт, или экстракт этилового спирта, или толуол, или этиловый спирт.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед тепловой обработкой мясокостное сырье измельчают.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что соотношение массы мясокостного сырья к массе воды в закрытом объеме обработки перед тепловой обработкой составляет не менее 3 1.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что повторную тепловую обработку гидролизата осуществляют при температуре не менее 100^oС.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после повторной тепловой обработки гидролизат разбавляют деионизированной водой до первоначального объема.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве консерванта используют хлороформ.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что осуществляют сушку гидролизата до порошкообразного состояния.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способам приготовления основ питательных сред, используемых, например, в ветеринарии и других областях.

Известен способ получения основы питательной среды для культур тканей из аминокислот мышечной ткани [1]

Поскольку белки мяса содержат в своем составе не более 18 наименований аминокислот, то и в полученном составе их не больше, что в большинстве случаев недостаточно. Кроме того, мясо как сырье должно удовлетворять самым высоким требованиям, что обуславливает высокую себестоимость.

Так же известен способ получения гидролизата из аминокислотной основы, получаемой из молочных продуктов [2] При этом питательная среда, полученная в результате многочасового гидролиза молока в жидком виде или в виде порошка содержит 16 18 аминокислот, а содержание сухого вещества не превышает 5 - 7% что в большинстве случаев не является достаточно ценным.

Наиболее близким к заявленному является способ, включающий тепловую обработку в закрытом объеме острым паром находящегося в воде мясокостного сырья после обвалки туш, преимущественно крупного рогатого скота при давлении в данном объеме 1,5 5 атм. и отделение полученного бульона, высушивание его, растворение в деионизированной воде в соотношении не менее 1 10, тепловую обработку полученного раствора при температуре не менее 70 градусов Цельсия, последующее охлаждение раствора, добавление к полученному раствору экстракта поджелудочной железы и консерванта, последующий гидролиз при температуре 37 39 градусов Цельсия в течение не менее 8 часов, повторную тепловую обработку и фильтрацию полученного гидлизата [3]

Известно, что после обвалки на костях остается 5 8% хрящевой ткани и до 20% к весу кости мышечной ткани. В хрящевой ткани содержится до 20% белковых и до 2,2% минеральных веществ, а коллаген составляет до 34% к массе сухой обезжиренной кости. Под действием температуры происходит сваривание коллагена, что сопровождается разрывом водородных связей, удерживающих полипептидные цепи в трехмерной структуре коллагена. Эти цепи в результате изгибаются и скручиваются, структуры коллагена разрыхляется. При дальнейшем нагреве происходит пептизация коллагена с образованием глютина и его гидролиз. Конечным продуктом являются свободные аминокислоты.

В бульоне из мясокостного сырья содержится (в к исходному сырью) абсолютно сухого вещества до 14, белка до 10, фосфора до 0,2, кальция - до 0,06, хлористого натрия до 0,09.

В данном случае продукт используется в жидком и сухом виде, перед сушкой осуществляется фильтрация и его сепарирование.

В составе этого продукта содержится 19 аминокислот (в отношении к белку):

1. Цистин и 2. Цистатионин 12,84+0,39 3. Лизин 7,53+0,54 4. Аргинин 10,85+1,15 5. Глицин и 6. Серин 24,0+0,84 7. Аспарагиновая кислота и 8. Оксипролин 1,66+0,15 9. Треонин и 10. Глутаминовая кислота 13,24+0,38 11. Аланин 5,7+0,28 12. Пролин 3,07+0,26 13. Тирозин 3,44+0,66 14. Валин и 15. Метионин 3,77+0,33 16. Фенилаланин 3,87+0,25 17. Лейцин 4,35+0,33 18. Орнитин 5,72+0,9 19. Трипотофан 2,8+0,1.

В известном способе существенным является соотношение белкового продукта и воды.

Раствор кипятили около 30 минут, охлаждали до 40 градусов Цельсия, добавляли ферментативный препарат поджелудочной железы и хлороформ. Гидролиз проводили при температуре 37 39 градусов не менее 2-х суток, после чего гидролизат повторно кипятили 50 минут, добавляли деионизированную воду до первоначального объема, охлаждали, фильтровали и стерилизовали в автоклаве. Получаемая в результате питательная среда хоть и имеет сбильные свойства, однако имеет недостаточную эффективность и спектр применения.

Целью заявляемого способа является получение из указанного сырья продукта более высокой питательной ценности и стандартного состава.

Данная цель достигается тем, что тепловую обработку острым паром осуществляют в течение не менее 2,5 часов при температуре конденсации пара, соответствующей упомянутой величине давления, после чего герметизируют закрытый объем обработки и выдерживают сырье в полученном бульоне не менее 4 часов до конечной температуры бульона не менее 100 градусов Цельсия, при этом, в качестве экстракта поджелудочной железы, используют толуоловый экстракт или экстракт толуолового спирта или толуол или этиловый спирт.

При этом перед тепловой обработкой мясокостное сырье измельчают, а соотношение массы сырья к массе воды составляет не менее 3 1, а повторную тепловую обработку гидролизата осуществляют при температуре не менее 100 градусов Цельсия, после повторной тепловой обработки гидролизат разбавляют деионизированной водой до первоначального объема. Наряду с этим, в качестве консерванта используют хлороформ, а конечный продукт сушат до порошкообразного состояния.

Поиск, проведенный по патентной и технологической литературе показал, что заявленная совокупность неизвестна, т.е. она соответствует условию патентоспособности "новизна".

Поскольку имеется потребность в получении продукта таким способом, то заявленное соответствует условию "промышленная применимость".

А так как продукт получается с более высокими свойствами и получение продукта с такими именно свойствами и качеством неочевидно для среднего специалиста, то заявленное соответствует условию "изобретательский уровень".

Способ осуществляется следующим образом. Мясокостное сырье после обвалки туш, преимущественно КРС, загружают в емкость, например емкость для вытопки жира из кости, и заливают его водой. При этом соотношение сырья к воде выбирают не менее 3 1. Следует отметить, что при необходимости сырье перед загрузкой измельчают, после чего емкость закрывают, настраивают предохранительный клапан на давление в диапазоне от 1,5 до 5 атм. и в емкость подают острый пар под давлением, температура конденсации в емкости обработки которого соответствует упомянутой величине давления, т.е. существенно превышает 100 градусов Цельсия и определяется по известной зависимости температуры от давления фазового перехода воды из жидкого состояния в газообразное.

Указанную обработку осуществляют в течение менее 2,5 часов, при этом выделившийся из кости жир, собирающийся на поверхности жидкости, можно периодически удалять. После окончания времени тепловой обработки прекращают подачу пара и герметизируют объем обработки, например перекрывают все входные и выходные патрубки, а предохранительный патрубок достаточно герметизирует патрубок отвода пара.

После герметизации сырье выдерживают в полученном бульоне не менее 4 часов до конечной температуры бульона не менее 100 градусов Цельсия, это достигается качеством теплоизоляции емкости для обработки. После чего полученный бульон удаляют, при необходимости отделяя его от слоя жира, фильтруют, сепарируют и сушат, например, до порошкообразного состояния.

Полученный белковый продукт, промежуточное сырье для гидролизата содержит (в на абсолютно сухое вещество) не менее 94,5 белка, 0,3 фосфора, 0,6 кальция, 0,9 хлористого натрия, 0,5 зольных веществ, 0,6 жироподобных веществ, что по некоторым позициям в 2 10 раз превышает показатели известного белкового продукта (по прототипу) и содержит 27 аминокислот, что существенно превышает известный аминокислотный состав. Полученный белковый продукт имеет следующий аминокислотный состав (мг/100 мг):

1,2 цистин и цистатионин 0,454; 3 лизин 2,086; 4 аргинин 4,538; 5 - глицин 5,996; 6 серин 2,337; 7 аспарагин 3,678; 8 аспарагиновая кислота 9 глутамин 4,135; 10 глутаминовая кислота 11 гидроксипролин 6,695; 12 - треонин 1,219; 13 аланин 4,869; 14 пролин 9,667; 15 тирозин 1,096; 16 - валин 0,546; 17 метионин 0,689; 18 фенилаланин 1,522; 19 лейцин 2,470; 20 орнитин 0,287; 21 изолейцин 0,509; 22 гистидин 0,802; 23 этаноламин 0,209; 24 тирптофан 0,095; 25 -А-аминомасляная кислота 0,320; 26 -B-аминомасляная кислота 0,155; 27 -Гамма-аминомасляная кислота 0,6148.

Таким образом, начиная с 21 позиции аминокислотного состава белкового продукта перечислены аминокислоты, ранее не встречающиеся в известных белковых продуктах, полученных методами тепловой обработки мясокостного сырья и являющимися основами для гидролизата.

Следует отметить, что наиболее эффективно в этом случае сырье КРС, поскольку свиное вырье дает значительное количество жира, который трудно отделить от полученного бульона. Аналогичный недостаток, хотя и в меньшей степени присущ и сырью, полученному после обвалки бараньих туш, хотя следует отметить, что во всех случаях полученный из свиных и бараньих туш промежуточный белковый продукт несравненно более эффективный, чем известный промежуточный белковый продукт.

Более длительное тепловое воздействие пари температуре до 130 градусов Цельсия и последующая выдержка сырья в бульоне позволяет более эффективно провести процесс пептизации коллагена кости и гидролиз коллагена, что и обуславливает более широкий спектр аминокислот в получаемом бульоне и большую насыщенность бульона химическими соединениями.

После получения белкового продукта в виде бульона его сепарируют и фильтруют и долее сушат до порошкообразного состояния. После чего разводят в воде при соотношении не менее 1 10 при температуре около 70 градусов Цельсия и выше до полного растворения. Далее охлаждают полученный раствор и добавляют толуоловый экстракт поджелудочной железы и в качестве консерванта хлороформ и при температуре 37 39 градусов Цельсия осуществляют гидролиз в течение более 2-х суток. Далее гидролизат кипятят, разводят деионизированной водой до первоначального объема, охлаждают, фильтруют и стерилизуют. Полученную основу можно использовать в жидком или порошкообразном виде.

Пример конкретной реализации способа. Мясокостное сырье после обвалки туш из цеха разделки поступает на измельчение, где сырые кости, сухожилия, хрящи и т.д. перемалывают на фракции длиной не более 5 см, после чего измельченное сырье загружают в емкости для вытопки костного жира, в которых наиболее просто реализовать процесс тепловой обработки. Настраивают предохранительный клапан на 2 атм. начинают подачу острого пара в емкость. Температура в емкости при этом поднимается до 120 градусов Цельсия, излишнее давление в емкости сбрасывается через предохранительный клапан. Под воздействием температуры среды костный жир выделяется из кости и собирается в верхней части емкости 7. По истечении 1 2 часов можно посредством расположенного в верхней части патрубка слить образовавшийся слой жира, но можно удалить жир в конце обработки. Тепловое воздействие на сырье приводит к образованию полипептидных цепей-глютина, который растворяется в воде, а при температуре около 100 градусов Цельсия происходит гидролиз коллагена, продуктом которого являются свободные аминокислоты, находящиеся в бульоне 7. Выход бульона при этом составляет 40% к массе сырья.

После воздействия острым паром через 2,5 часа перекрывают все патрубки, чем герметизируют емкость и осуществляют выдержку сырья в бульоне в течение 4 часов. В процессе этой выдержки так же происходит насыщение бульона свободными аминокислотами, т.е. из кости практически полностью утилизируются коллагеновые волокна и обуславливается более широкий набор аминокислот в полученном бульоне, который потом фильтруют и сушат.

При использовании давления в 1,5 атм. концентрация сухих веществ достигается в бульоне 7 8% в то время, как использование давления в 5 атм. позволяет получить до 20% сухих веществ в бульоне.

Исследования по влиянию времени теплового воздействия на концентрацию сухих веществ в бульоне показали, что 7% являются минимальной величиной, меньше которой не будет образовываться достаточного количества незамененных аминокислот в необходимом количестве. А исследование времени выдержки сырья после обработки острым паром показали, что процесс гидролиза продукта пептизации коллагеновых волокон кости на приемлемом (до 80%) уровне завершается за 4 часа, что полностью удовлетворяет степени готовности получаемого белкового продукта при конечной температуре бульона не ниже 100 градусов Цельсия.

Следует отметить, что только совокупность всех этапов теплового воздействия на мясокостное сырье позволяет не только в очень высокой степени провести деструкцию коллагеновых волокон кости, но и завершить процесс гидролиза коллагена. Простым же тепловым воздействием нельзя достичь такой степени деструкции, аналогично, как и при других воздействиях с последующей выдержкой мясокостного сырья в бульоне невозможно получить такую степень гидролиза и, следовательно, указанный спектр аминокислот в составе нового белкового продукта, который был ранее неизвестен.

Состав полученного белкового продукта, состоящего по меньшей мере не 95% (в сухом виде) из белка, обуславливает его широкое применение в качестве основы для производства питательного гидролизата и является более эффективной белковой основой, чем мясная вода, ферментативные гидролизаты мяса (мясные перевары Хоттингера), казеина и т.д.

Далее полученный продукт растворяли в объеме деионизированной воды при концентрации указанного порошка, например 10 12% раствор кипятили в течение 30 минут, после этого в продукт при температуре 40 градусов Цельсия добавляли 20% ферментативного толуолового препарата толуоловый экстракт поджелудочной железы и 0,5% хлороформа. При этом, ферментативный толуоловый препарат изготавливают из нативной поджелудочной железы КРС (крупного рогатого скота), которую очищают от жира, пленок, кровеносных сосудов, тщательно промывают дистиллированной водой и стерильным физиологическим раствором. Промытую поджелудочную железу отжимают от воды, тщательно измельчают, добавляют полуторное количество к ее весу количество дистиллированной воды и 17% к общему весу химически чистого толуола. Взвесь помещают в стеклянную бутыль, закрывают резиновой пробкой и энергично встряхивают в течение 30 минут до получения однородной массы белого цвета. Затем взвесь железы оставляют на 1 - 2 дня при температуре 1 4 градусов Цельсия, после чего препарат становится готовым к применению. Непосредственно перед гидролизом ферментативной толуоловый препарат фильтруют через два слоя марли, осторожно отжимая руками.

Гидролиз проводят при температуре 37 градусов Цельсия в течение не менее 48 часов при механическом перемешивании. После этого гидролизат кипятят, добавляют дистиллированную воду до первоначального объема, охлаждают и стерилизуют в автоклаве при 110 градусах Цельсия в течение не менее 20 минут. После чего гидролизат можно использовать непосредственно, но можно и высушить для последующей консервации. При необходимости сухой гидролизат используют для получения раствора.

Далее, после получения гидролизата для приготовления питательной среды для культур клеток готовят 0,5% раствор гидролизата на среде Хенкса, добавляют к нему согласно официальных прописей витамины, бычью сыворотку, антибиотики.

На питательной среде из данного гидролизата испытывали рост перевариваемых и первично трипсинизированных культур клеток 18, почки обезьяны, почки морской свинки, фибробластов эмбриона человека, эмбриона мыши и т.д.

Контролем служили среды 199 и гидролизат лактоальбумина. Биологическая ценность культур оценивалась по данным роста клеток, времени образования монослоя, жизнеспособности выращенных культур и характеру роста клеток.

В результате культивирования первичных линий клеток на среде с данными гидролизатом выявлено, что монослой формируется до 4-х суток, прирост клеток был в среднем в 7 9 раз. При засеве первично трипсинизированных посевная доза 200 500 тыс.клеток в 1 мл среды. Начиная с первого дня роста до образования монослоя наблюдается постоянный рост числа клеток в среднем в 4 - 5 раз, в первый день их приклеивается 25 40%

Для первично трипсинизированных культур клеток почки морской свинки и почки белой мыши индекс пролиферации составил 0,6 0,8 и 1,5 1,6 соответственно, что соответствует аналогичным показателям среды 199 и с гидролизатом лактоальбумина.

Поскольку по сравнению с мясом порошкообразный белковый продукт имеет несравненно более стандартный состав, отличающийся в 4 раза большим содержанием белка, пептонов, аминокислот, то и бактериологические среды на основе порошка данного белкового продукта в 5 раз экономичнее других сред. Полученный в процессе реализации способа белковый продукт почти в полтора раза эффективнее ранее известного продукта из мясокостного сырья. Сравнение же полученных из этого продукта питательных сред для культур тканей с питательными средами из белковосодержащего сырья крови, рыбы, молочных продуктов и т.д. а также их смесей показывает несравненную эффективность новой питательной среды во всех случаях применения.

Практика показала, что высокостандартный состав получаемого белкового продукта из мясокостного сырья является эффективной основой для получения микробиологических питательных сред, являясь исключительно выгодным заменителем мяса и других белковых продуктов, причем, в ряде случаев, полученный белковый продукт является единственно возможной основой для ряда вирусологических сред, при этом кратность замены данного продукта известными другими достигает 10 15. Стоимостная эффективность получаемой питательной среды по меньшей мере в 2 30 раз больше, чем при получении питательной среды из указанных выше стандартных белковых продуктов или их смесей. Доступность мясокостного сырья и возможность использования для получения белкового продукта в жидкой его фазе стандартного оборудования для вытопки костного жира, а в порошкообразной фазе как самого промежуточного белкового продукта стандартных вакуумных распылительных сушилок позволяет в кратчайшие сроки наладить получение описанным выше способом новой питательной среды с самым широким спектром действия.

Источники информации

1. Бабич М. А. Питательные среды. Лабораторные методы исследования, М. Высшая школа, 1954.

2. Козаков А.М. Приготовление питательных сред из мясокостной муки, ж. Вопросы питания, 1938, 8, 112.

3. Карышева А.Ф. Сухой белковый концентрат и использование его при приготовлении питательных сред для микроорганизмов, дисс. на соискание д.в.н. Минск, 1972.