штамм дрожжей exophiala nigrum для производства стимулятора роста растений

Формула изобретения

Штамм дрожжей Exophiala nigrum ВКПМ У-521 для производства стимулятора роста растений.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к сельскому хозяйству, использованию биотехнологических методов и касается нового штамма дрожжей, который вырабатывает биологически активное вещество, стимулирующее ростовые процессы растений.

Есть все основания считать, что микробный синтез может быть важным дополнительным источником получения регуляторов роста растений (Муровецев, 1984).

Известен штамм Neurospora grassa выделяющий индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) в культуральную среду, недостатком этого штамма является сравнительно низкая эффективность синтеза ИУК, ограниченная технологическими особенностями подготовка и использования штамма (Tomita, 1987).

Известно выделение фитогоpмонов фитопатогенным грибом рода Botrytis, однако в данном случае использования штамма затруднено в связи с фитопатогенными свойствами штамма (Филимонова, 1989).

Цель изобретения получение нового штамма, продуцирующего биологически активные вещества стимулирующие ростовые процессы растений.

Культура "черных дрожжей", идентифицированных как Exophiala nigrum выделена из проб воды, отобранных в прибрежной зоне Южного Байкала. Мутантный штамм А-9 был получен при обработке клеток дрожжей Exophiala nigrum дикого типа R 11 в суспензии супермутагена НММ (нитрозометилмочевины) концентрацией 1000 мг/мл в течении 3 ч. Отобранный мутант отличался от исходного коричневой окраской колоний при выращивании их на агаровой среде и образования неспецифичных так называемых "морщинистых" колоний.

Штамм А-9 хранится в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов института "ВНИИ генетика" под номером ВКПМ У-521.

Штамм А-9 дрожжей Exophiala nigrum обладает следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками.

Морфолого-культуральные признаки.

В жидких средах штамм имеет овальные клетки размером 8,44,2-5,02,2 мкм. Размножается верхушечным или боковым почкованием У тридцатисуточной культуры появляется мицелий воздушный, септированный, разветвленный, в основном истинный.

В жидкой среде на третьи сутки пленки и кольца нет, наблюдается небольшой осадок. Хорошо растет на сусле-агаре, консистенция слабослизистая, штрих ровный, с коричневой матовой поверхностью, выпуклым профилем. Гигантские колонии на твердой питательной среде УЕРД коричневого цвета, диаметр 12 15 мм.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Выделяет в среду вещество, предшественник меланина индольной природы. Не образует эфиров и крахмалоподобных соединений, не гидролизирует жиры. Не наблюдается кислотообразования на меловом агаре. Хорошо ассимилирует разнообразные источники азота: нитрат калия, серно-кислый аммоний, пептон, аспарагин. Обладает умеренной уреазной активностью. Сахара не сбраживает. Хорошо ассимилирует сахарозу, мальтозу, глюкозу, умеренно лактозу, галактозу рафинозу. Слабо усваивает глицерин, маннит. Хорошо растет на среде со спиртом.

Оптимальная температура 20 25^oC при 32 37^oC рост очень слабый. Штамм А-9 не обладает протеолитической и амилазной активностью, способен расти на среде без витаминов. Чувствителен к 100 мкг/мл циклогексимида, обнаруживает хорошую каталазную активность.

Состав твердых сред для культивирования штамма А-9 (г/л) воды)

Состав 1 (среда УЕРД)

Пептон 10

Автолизат 5

Глюкоза 20

Агар-агар 20

Вода Остальное

Состав 2 (Минимальная среда)

(NH₄₂SO₄ 3

KH₂PO₄ 3

MgSO₄ 0,5

Глюкоза 20

Агар-агар 20

Вода Остальное

Состав 3

Кристалин 7

Сахар 20

Агар-агар 20

Вода Остальное

Примечание: При использовании данных сред в качестве жидких исключается внесение агар-агара.

Пример 1. Предлагаемый штамм "черных дрожжей" наращивают следующим образом.

Ферментер или 20-10-литровую бутыль заполняют на 1/3 объема жидкой питательной средой. (Состав 3, с исключением агар-агара, вместо кристалина можно использовать растворин или любое другое комплексное минеральное удобрение, содержащее азот, фосфор и калий в соотношении 90:60:30), предварительно простерилизованной, охлажденной до комнатной температуры. Для инокуляции в среду используются агаровые пластины с 3-5 суточными газонами клеток штамма А-9, выращенных на твердой питательной среде УЕРД. С помощью компрессора обеспечивается продувка воздухом. Температура культивирования 16-23^oC. Через 60-70 ч культивирования в ферментер добавляется стерильная среда, оставляя незаполненным примерно 1/8 1/7 его объема, через 62 ч титр клеток достигает 110⁸ 510⁸ кл/мл, деление клеток прекращается, количество стимулятора достигает максимума.

В случае производственной необходимости для наращивания смеси можно использовать варианты ферментеров для глубинного культивирования клеточных культур микроорганизмов.

Штамм А-9 дрожжей Exophiala nigrum хранится в пробирках на "закошенной" твердой питательной среде УЕРД в холодильнике при 5 8^oC в течении 6 8 мес. Выращенные в стерильной жидкой минимальной среде клетки культуры также могут сохранять жизнеспособность при комнатной температуре до 3 6 мес.

Пример 2. Штамм выращивался на чашках Петри с твердой минимальной средой в течении 7 10 сут. Стимулятор роста растений, продуцируемый штаммом А-9 дифундирует в агар. Для выделения веществ продуцируемых штаммом пять агаровых пластинок после удаления биомассы клеток измельчают и помещают в герметично закрытый сосуд, содержащий 200 мл, серного эфира для экстракции. Через двое сут. отделяют фильтрат, на лист хроматографической бумаги "Ленинградская медленная" размером 2230 см наносят пять пятен выделенного описанным выше способом экстракта по 0,2 мл. Одновременно на тот же лист наносят метчик ИУК из расчета 25 мкг в пятно. Бумагу сшивают в виде цилиндра и ставят на дно хроматографического сосуда, разделение экстрактов проводят на восходящих хроматограммах на высоту 20 см в стандартных условиях в темноте.

Используют щелочный растворитель:

изопропиловый спирт (-28% -ный) аммиак вода (101 1). Исследования хроматограмм с образцами экстрактов, содержащих продукты штамма А-9 и метчика ИУК проводят с применение реактивов Прохазки и Сальковского. Продукт штамма А-9 на хроматограмме имеет типичный для индолов цвет, интенсивность. Значение Pr соответствовало 0,35 как для метчика ИУК так и для продукта выделяемого штаммом.

Пример 3. Для идентификации вещества использовали спектрофотометрический метод, электронные спектры снимались на приборе "Specord M-40".

Как можно видеть на рис. 1, электронные спектры вещества выделяемого штаммом А-9 характеризуются тонкой структурой, наличием пика с максимумом при 284 нм и перегиба в области 300 нм.

Пример 4. На закрытой целлофановой пленкой поверхности среды УЕРД выращивают штамм Eхophiala nigrum А-9. Через 5 и 10 сут. целлофановую пленку с биомассой клеток удаляют. На освободившуюся поверхность с дифундировавшими в агар продуктами помещают семена огурцов сорт "Конкурент". В контрольном варианте семена огурцов помещают на стерильные чашки со средой УЕРД. В опыте и контроле использованы не колиброванные, непроросшие семена. Через 3 сут. учитывали следующие показатели: количество боковых корешков, длину основного корня и длину наибольшего бокового корешка. Все эксперименты проводили в 6 повторностях.

Результаты учета представлены в таблице 1. Как можно видеть диффундирующее в среду вещество после роста штамма А-9 приводит к стимуляции прорастания семян огурцов.

Количество боковых корешков у проростков огурцов при их выращивании на среде после роста штамма А-9 увеличивается в пять раз, если в контроле было 0,5 шт. то в опыте достигало 2,5 шт.

Пример 5. В 50 мл стерильной жидкой минимальной среды с глюкозой вносят клетки штамма А-9 до получения титра 110⁶ кл/мл. Суспензию культивируют на качалке 10 сут. Отделяют центрифугат центрифугированием. Полученную культуральную жидкость используют в качестве исходного материала для постановки опытов.

Исследовали действия культуральной жидкости после роста клеток штамма А-9 на прорастания семян огурцов сорт "Конкурент".

В опытных вариантах исследовали неразбавленную культуральную жидкость, разбавленную в 2 раза, 10 раз и 100 раз.

В контроле исследователи стерильную минимальную жидкую среду и растворы ИУК (индолилуксусная кислота) в концентрациях 0,1; 0,05; 0,1 мг/мл.

В опытных и контрольных вариантах по 20 семян огурцов помещают в чашки Петри, содержащие по 5 мл испытуемых образцов. Через трое сут. учитывают показатели: количество боковых корешков, длина наибольшего из корешков, длина основного корешка. Все эксперименты проводили в 6 повторностей.

Как можно видеть из таблицы 2, выделяемое штаммом А-9 вещество обладает стимулирующим действием на прорастание семян огурцов.

Пример 6. Стимулятор роста растений предлагается использовать в виде клеточно-ферментативной суспензии непосредственно после наращивания (Таблица 3). Инокуляция растений и почвы клеточно-ферментативной суспензией позволяет формировать почвенные биоценозы, положительно влияющие на плодородие почвы.