способ определения содержания фитотоксических веществ

Формула изобретения

Способ определения содержания фитотоксических веществ, включающий облучение возбуждающим светом клеток водоросли хлореллы в присутствии анализируемого токсичного вещества и измерение интенсивности фотоиндуцированной замедленной флуоресценции водоросли в миллисекундном интервале затухания под действием токсичного вещества, отличающийся тем, что интенсивность замедленной флуоресценции измеряют в индукционных максимумах после включения возбуждающего света сначала при значении интенсивности последнего 50 100 Вт/м², затем при значении интенсивности возбуждающего света 5 10 Вт/м², а в качестве показателя фитотоксичности используют отношение измеренных величин, пронормированных к аналогичным величинам, измеренным на контрольных образцах, при этом содержание токсичного вещества рассчитывают по значению показателя фитотоксичности, используя предварительно построенную калибровочную зависимость показателя токсичности от логарифма концентрации вещества.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биофизическим методам выявления и количественного анализа фитотоксических соединений в водных и иных растворах и может быть использовано в службах охраны природы для оперативного контроля за токсичностью природных и сточных вод, а также в аналитических и контрольно-токсикологических лабораториях для обнаружения и последующего определения содержания химических веществ, обладающих фитотоксической активностью в различных средах.

Наиболее близким к изобретению является способ определения фитотоксичности препаратов, основанный на регистрации изменения интенсивности миллисекундного фотоиндуцируемого послесвечения (замедленной флуоресценции) хлоропластов или клеток хлореллы под действием химических соединений.

Однако данный способ не обеспечивает высокую точность измерения содержания этих веществ в анализируемых пробах, поскольку интенсивность регистрируемой замедленной флуоресценции (ЗФ) будет зависеть не только от величины токсического действия пробы, но и от мутности и цветности анализируемого раствора.

Техническим результатом изобретения является увеличение точности и чувствительности метода измерения степени фитотоксичности химических соединений и определение их содержания в анализируемых водных растворах.

Это достигается тем, что фитотоксичность веществ выявляют, регистрируя амплитуду индукционного максимума 3Ф водоросли хлореллы в миллисекундном интервале затухания при возбуждении светом сначала высокой ЗФ_в, в затем низкой ЗФ_н интенсивности.

Известно, что квантовый выход и, следовательно, интенсивность ЗФ на высоком свету, при котором доминирует быстрая компонента затухания, снижается после добавления фитотоксических веществ. И наоборот, на низком свету, когда свечение представлено медленной компонентой, токсический эффект проявляется в виде увеличения интенсивности ЗФ.

На фиг.1 представлены зависимости интенсивного замедленной флуоресценции суспензии хлореллы, возбуждаемой высокой (1-55 Вт/м²) и низкой (2-6 Вт/м²) интенсивностью света, отношения их интенсивностей (3), коэффициента токсичности (4) от концентрации прометрина в среде.

В предлагаемом способе повышение точности измерения токсичности достигается за счет использования в качестве ее показателя отношения интенсивностью ЗФ и индукционных максимумах на высоком (50-100 Вт/м²) и низком (5-8 Вт/м²) возбуждающем свету. Данный параметр не зависит от мутности и цветности анализируемых проб, поскольку ослабление интенсивности ЗФ примесью будет пропорциональным для обоих световых условий возбуждения свечения.

Увеличение чувствительности метода достигается благодаря тому, что повышение интенсивности ЗФ на низком свету (медленной компоненты) наблюдается при значительно меньших концентрациях токсиканта, чем его снижение на высоком. В результате с помощью показателя ЗФ_в/ЗФ_н удается обнаружить более низкую степень фитотоксичности и, следовательно, меньшие концентрации обладающих ею веществ, чем при регистрации одной быстрой компоненты свечения.

Поскольку абсолютные значения данного показателя значительно варьируют в зависимости от условий выращивания и последующего содержания культуры водоросли, то для сравнения результатов разных серий экспериментов вводится процедура нормирования данных. Она состоит в вычислении относительного коэффициента токсичности

(1)

где (ЗФ_в/ЗФ_н)_{контроль} показатель, зарегистрированный для пробы водоросли, в которую не вводились токсические вещества, а (ЗФ_в/ЗФ_нопыт показатели проб той же суспензии тест-объекта, в которые добавлены образцы, проверяемые на фитотоксичность. С увеличением последней данный коэффициент изменяется от нуля до величин, близких к единице, независимо от типа токсиканта и исходного состояния биотеста.

Пример 1. В несколько кювет из материала с низким уровнем послесвечения вносят по 2 мл суспензии хлореллы с оптической плотностью 0,3-0,4 при длине волны 670 нм и толщине слоя 1 см. В первую из них добавляют 2 мл дистиллированной воды, а в другие такое же количество стандартных растворов гербицида прометрина, обладающего высокой фитотоксичностью в отношении фотосинтетических процессов.

Последовательно устанавливая кюветы в прибор для регистрации интенсивности миллисекундной замедленной флуоресценции и включая возбуждающий свет сначала интенсивностью 50 Вт/м², затем через несколько секунд интенсивностью 5 Вт/м², измеряются максимальные величины соответственно ЗФ_в и ЗФ_н. После вычисления их отношения для каждой кюветы рассчитываются коэффициенты токсичности К_т.

Результаты, представленные на фиг.1 показывают, что с повышением концентрации гербицида в результате нарастания токсического эффекта уменьшается отношение ЗФ_в/ЗФ_н и увеличивается коэффициент К_т. При этом в отличие от абсолютных величин ЗФ_в и ЗФ_н зависимость между относительными показателями токсичности и логарифмом концентрации гербицидов, как правило, носит линейный характер.

Используя концентрационную зависимость К_т как калибровочный график, можно определить содержание прометрина в исследуемых пробах. Для этого нужно отложить на оси ординат графика значение коэффициента токсичности изучаемого раствора и провести линию, параллельную оси абсцисс до пересечения с калибровочной кривой. Опустив перпендикуляр из этой точки на ось абсцисс, находят концентрации гербицида в анализируемой пробе по формуле

, (2)

где С_б ближайшая, большая по величине концентрации гербицида, чем С_пр; l_пр длина отрезка от С_б до точки пересечения перпендикулярна с осью абсцисс; l_o линейная длина концентрационного шага на ось абсцисс; Н его величина.

Для фиг. 1 l_пр составляет 6,3 мм, что при l_o=15 мм соответствует концентрации прометрина в пробе: C_пр=1,8510^-8 моль/л.

Пример 2. Кюветы, взятые по примеру 1, со стандартными растворами формальдегида и исследуемой пробой облучают сначала светом 100 Вт/м² ФАР, а затем 8 Вт/м² ФАР, регистрируя соответственно амплитуды ЗФ_в и ЗФ_н. Вычислив отношение ЗФ_в/ЗФ_н и коэффициент токсичности, строят калибровочный график (фиг. 2). На фиг.2 представлены зависимости интенсивности ЗФ суспензии хлореллы возбуждаемой высокой (1-100 Вт/м²) и низкой (2-8 Вт/м²) интенсивностью света, отношения их интенсивностей (3), коэффициента токсичности (4) от концентрации формальдегида в среде.

Поскольку величина l_пр для анализируемой пробы составляет 7,5 мм, то концентрация формальдегида в ней согласно формуле (2) равна 3,710^-4 моль/л.

Расчет содержания формальдегида и других фитотоксических веществ может быть произведен не только графически, но и аналитическим способом. Для этого используется формула, которая выведена на основе факта существования широкого линейного участка на кривой зависимости флуоресцентных показателей токсичности от логарифма концентрации фитотоксиканта:

,

где С_пр, С₁ и С₂ концентрации токсиканта в пробе и в двух стандартных растворах соответственно (С₂>C₁; Кт пр, Кт₁ и Кт₂ коэффициенты токсичности этих растворов.

Пример 3. В кюветы с 2 мл биотеста вносятся по 2 мл сточной воды целлюлозно-бумажного комбината (ЦБК) и завода комбайнов в нескольких разведениях. Измеряется ЗФ_в и ЗФ_н при 80 и 7 Вт/м² соответственно и вычисляется коэффициент К_т. Как видно из таблицы, сточные воды ЦБК, содержащие большое количество органических примесей, обладают высокой фитотоксичностью, которая становится небольшой лишь при значительном разведении. И наоборот, фитотоксичность промстоков завода комбайнов, в которых преобладают минеральные вещества, невелика, даже без предварительного разведения их чистой водой.

Таким образом, используя показатель кратности разбавления наряду с коэффициентом К_т, можно провести сравнительную оценку фитотоксичности промышленных сточных вод различных предприятий и организовать текущий экспресс-контроль за их стоками.

Следует указать, что для получения максимальной точности определения фитотоксичности необходимо строго сохранять выбранный режим регистрации ЗФ_в и ЗФ_н при анализе контрольных (стандартных) и опытных образцов. С этой же целью все пробы биотеста для каждого сеанса измерения должны быть взяты из одной суспензии водоросли. И, наконец, при работе с неводными растворами фитотоксических веществ (например, спиртовыми, ацетоновыми, гексановыми и другими экстрактами) для компенсации действия на биотест самого растворителя последний вносится в контрольную кювету в тех же объемах, что и в кюветы с токсикантом.