донор для получения специфических сывороток и сывороточных препаратов для иммунопрофилактики и иммунотерапии чумы плотоядных

Формула изобретения

Применение свиней в качестве донора для получения специфических сывороток и сывороточных препаратов для иммунопрофилактики и иммунотерапии чумы плотоядных.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области вирусологии, а именно к применению свиней для получения специфических сывороток и сывороточных препаратов для иммунопрофилактики и иммунотерапии чумы плотоядных, и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях и предприятиях биологической промышленности для производства препаратов.

В настоящее время для лечения и профилактики чумы плотоядных используют в качестве доноров лошадей, волов и собак (ВНИИ особо чистых биопрепаратов, С. -Петербург, Россия, Rhone Merieux, 1994; Покровский завод биопрепаратов, Тобольская биофабрика, МПП БНТ (ТУ 10-09-125-91).

Наличие в сыворотке крови, например, собак, антител, нейтрализующих вирус чумы плотоядных, в титрах 1:20-1:30 является достаточным условием как для профилактики чумы плотоядных, так и для ее лечения (Baker et al. 1959; Gillebpie et al. 1958; Greene, 1984a).

Известно, что вирус чумы плотоядных способен репродуцироваться в организме домашних свиней, которые переболевают трахеобронхитом (Appel et al. 1974; Greene, 1984b). На этом факте основан способ получения специфичных к вирусу чумы плотоядных свиных сывороток, предназначенных для диагностики чумы собак (Zaghawa et al. 1990).

Сведения об использовании свиней для приготовления лечебных и профилактических сывороток и сывороточных препаратов против чумы плотоядных в доступной литературе отсутствуют.

Целью изобретения является получение высокоактивных сывороток и сывороточных препаратов для профилактики и лечения чумы плотоядных и снижение себестоимости их производства путем использования свиней в качестве доноров.

Сущность изобретения состоит в том, что для приготовления сывороток и сывороточных препаратов против чумы плотоядных в качестве доноров сывороток используются свиньи, инокулированные вирусом чумы плотоядных.

Титр вируснейтрализующих антител в сыворотках составляет 1:1280-1:2560, что сходно со значениями, достигающимися при гипериммунизации собак вирусом чумы плотоядных.

В работе используют: вакцинный вирус чумы плотоядных, штамм ЭПМ, титр 3,5-4,0 lg ЦПД₅₀/мл; вакцинный вирус чумы плотоядных, штамм 668-КФ, титр 2,7-3,5 lg ЦПД₅₀/мл; вирулентный вирус чумы плотоядных штамм Шнайдер-Хилл; свиней старше 2-месячного возраста; собак старше 15-недельного возраста; культуру клеток Vero; культуру клеток куриных фибробластов (КФ); больных чумой собак.

Пример 1. Для концентрирования используют культуру клеток КФ, зараженную вирусом чумы плотоядных штамм 668-КФ. Концентрирование проводят вируссодержащей культуральной жидкости. Титр вируса в культуральной жидкости составляет 2,7 lg ЦПД₅₀/мл. Добавляют в культуральную жидкость 7% (вес/вес) полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6 кДА, инкубируют в течение 18 часов при 2^oС и осаждают преципитат центрифугированием. Титр вируса в концентрированном препарате составляет 4,51lg ЦПД₅₀/мм. Каждой свинье с массой тела 30 40 кг вводят внутримышечно по 2 мл концентрированного вируса. Свиней инокулируют двукратно с интервалом в 2 недели. Сыворотку отбирают через 10 дней после второго введения вируса. Титр сывороточных антител определяют в реакции нейтрализации в культуре клеток куриных фибробластов с 1000 ЦПД₅₀ вируса.

Пример 2. Свиней инокулируют внутримышечно четырехкратно с интервалом в 4 недели введением концентрированного препарата вируса чумы плотоядных. Концентрируют культуру клеток КФ, зараженную вирусом чумы плотоядных, штамм 668-КФ. Титр вируса в культуральной жидкости составляет 3,5 lg ЦПД₅₀/мл. Концентрирование проводят путем добавления в культуральную жидкость 7% (вес/вес) полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6 кДА, инкубируют в течение 18 часов при 2^oС и осаждают преципитат центрифугированием. Титр вируса в концентрированном препарате составляет 5,3 lg ЦПД₅₀/мл. Каждой свинье с массой тела 20 25 кг вводят внутримышечно по 5 мл концентрированного вируса. Сыворотку отбирают через 10 дней после последнего введения вируса. Титр сывороточных антител определяют в реакции нейтрализации в культуре клеток куриных фибробластов с 1000 ЦПД₅₀ вируса.

Пример 3. Свиней инокулируют внутримышечно двукратно с интервалом в 4 недели введением концентрированного препарата вируса чумы плотоядных. Для концентрирования используют культуру клеток Vero, зараженную вирусом чумы плотоядных, штамм ЭПМ, адаптированным к репродукции в клетках Vero. Концентрируют вируссодержащую культуральную жидкость. Титр вируса в культуральной жидкости составляет 4,0 lg ЦПД_50>/мл. Концентрирование проводят путем добавления в культуральную жидкость 7% (вес/вес) полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6 кДа, затем инкубируют 18 часов при 2^oC и осаждают преципитат центрифугированием. Титр вируса в концентрированном препарате составляет 5,5 lg ЦПД₅₀/мл. Каждой свинье с массой тела 50-60 кг вводят внутримышечно по 1 мл концентрированного вируса. Сыворотку отбирают через 30 дней после второго введения вируса. Титр сывороточных антител определяют в реакции нейтрализации в культуре клеток Vero с 1000 ЦПД₅₀ вируса.

Пример 4. Свиней инокулируют внутримышечно трехкратно с интервалом в 1 месяц введением 20 мл культурального вируса чумы плотоядных, штамм ЭПМ с титром 3,5 lg ЦПД₅₀/мл, выращенного в культуре клеток Vero. Сыворотку отбирают через 20 дней после третьего введения вируса. Титр сывороточных антител определяют в реакции нейтрализации в культуре клеток Vero с 1000 ЦПД₅₀ вируса.

Пример 5. Для контроля уровней антительного ответа готовят сыворотки гипериммунизированных собак. Для этого собак с массой тела 5 8 кг инокулируют внутримышечно двукратно с интервалом 3 недели вирусвакциной из штамма ЭПМ (по одной дозе коммерческой вакцины) и дважды органным материалом вирулентного штамма Шнайдер-Хилл (1 мл 10%-ной суспензии в физиологическом растворе селезенки павшей от чумы плотоядных тхорзофретки) с интервалом 1 месяц. Сыворотку отбирают через 10 дней после третьего введения вируса. Титр сывороточных антител определяют в реакции нейтрализации в культуре клеток куриных фибробластов с 1000 ЦПД₅₀ вируса.

Результаты сравнительного определения активности свиных и собачих сывороток, а также коммерческих препаратов сывороток против чумы плотоядных приведены в таблице 1.

Из величин титров, представленных в таблице, следует, что по данным реакции нейтрализации инфекционности вируса чумы плотоядных в сыворотках свиней титры вируснейтрализующих антител близки к титрам антител в сыворотках гипериммунизированных в эксперименте собак и коммерческих препаратов лечебных сывороток против чумы плотоядных, приготовленных с использованием собак в качестве доноров. Титры антител в свиных сыворотках превышают титры антител в коммерческих препаратах, приготовленных с использованием лошадей в качестве доноров, не менее, чем в 80 раз.

Кроме того, стоимость содержания свиней-доноров в 3 раза меньше, чем других крупных животных-доноров, и расходы на получение 1000 доз готового лечебного препарата в 10 60 раз ниже, чем при использовании других животных-доноров.

Препараты глобулинов, полученных в примерах 1-4, были использованы для лечения собак естественно инфицированных чумой плотоядных. В результате применения глобулина у всех взятых в опыт собак наблюдают прекращение развития болезни через 2 суток и выздоровление через 5 суток после 2-3 кратного введения глобулина. Результаты приведены в таблице 2.

Таким образом, использованием свиней в качестве доноров сывороток для приготовления лечебно-профилактических сывороток и сывороточных препаратов против чумы плотоядных приводит к повышению их специфической активности, к снижению себестоимости препаратов, повышению уровня безопасности для персонала, повышению уровня ветеринарной безопасности препаратов. ТТТ1