Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

способ получения сорбентов

Классы МПК:C08B1/02 подготовка целлюлозы для получения сложных эфиров 
C08B5/00 Получение сложных эфиров целлюлозы и неорганических кислот
Автор(ы):, , , , , ,
Патентообладатель(и):Гаврюченкова Людмила Павловна
Приоритеты:
подача заявки:
1993-02-17
публикация патента:

Использование: в области хроматографии для разделения биологически активных веществ (БАВ). Сущность: способ получения сорбентов, содержащих фосфогруппы, включает обработку гидроксилсодержащих матриц, предварительно обработанных эпихлоргидрином в пристуствии щелочи, (рН больше 12). Процесс фосфорилирования проводят POC13 или Na2HPO4 при температуре не более 50oС. Полученные сорбенты сочетают высокие гидродинамические характеристики с более эффективными эксплуатационными характеристиками. 2 з. п. ф-лы, 3 табл.

Рисунки к патенту РФ 2059969

Рисунок 1

Изобретение относится к хроматографии, точнее к способам получения сорбентов, содержащих фосфогруппы, для разделения биологически активных веществ (БАВ).

Фосфокатиониты достаточно широко и эффективно используются для выделения и очистки различных БАВ [1] Недостатком их являются, как правило, низкие гидродинамические характеристики.

Прототипом изобретения является способ получения фосфоцеллюлозы [2] заключающийся в диспергировании сухого порошка целлюлозы в сухом пиридине с последующей обработкой POCl3 при температуре 115оС.

Недостатками способа являются:

получение сорбента в виде рыхлого порошка;

проведение реакции фосфорилирования в кипящем пиридине, что приводит к деструкции матрицы и изменению ее состава за счет обогащения более низкомолекулярными фракциями;

обработанная таким образом матрица содержит фосфогруппы различной ионной силы и различной химической породы, т.к. образуются не только моно-, но и ди- и трифосфоэфирные группы, что снижает хроматографическое качество сорбента.

Применение сорбента в виде порошка или частиц неправильной формы затрудняет процесс хроматографии, т.к. происходит засорение фильтров колонок и усадка слоя сорбента, что требует их частой перенабивки, кроме того практически исключает возможность масштабирования процессов хроматографии.

Задачей изобретения является упрощение технологии фосфорилирования с одновременным получением сорбентов в виде сферических гранул с целью улучшения их механических и гидродинамических характеристик.

Поставленная задача решается введением предварительной обработки матрицы, полученной в виде сферических гранул, эпихлоргидрином в присутствии щелочи с рН > 12 с последующей обработкой фосфорилирующими агентами при температуре не более 50оС.

Технический уровень заявляемого изобретения обуславливается тем, что авторами было установлено, что в случае обработки гидроксилсодержащей матрицы эпихлоргидрином происходит стабилизация структуры матрицы и активация ее реакционной способности. Это позволяет проводить реакцию фосфорилирования в мягких условиях, получать гранулы сорбента в его метрических (микросферических) размерах при сохранении его эксплуатационных характеристик.

Сочетание процессов гранулирования с поперечной сшивкой эпихлоргидрином и эпоксидирование с последующим фосфорилированием таких полимеров в литературе не описано.

В результате при использовании предварительно гранулированных матриц (3, 4) предлагаемый способ получения сферических фосфосорбентов для хроматографии биопрепаратов позволяет создать хроматографический материал повышенного качества: сорбенты не только имеют форму сферических гранул, но и:

содержат только химически эквивалентные фосфомоноэфирные группы что исключает дополнительные неспецифические взаимодействия матриц сорбентов с биополимерами, снижающие эффективность хроматографии;

имеют крупные поры, что позволяет проводить одновременно гельфильтрацию биополимеров;

обладают повышенными гидродинамическими характеристиками;

позволяют проводить процессы очистки биопрепаратов с высокой эффективностью.

П р и м е р 1 (прототип). 100 г сухой целлюлозы суспендировали в 1 л сухого пиридина, вводили 170,0 мл (285 г) РОCl3, кипятили в течение трех часов (t 115oC). Смесь отфильтровывали, и осадок трижды промывали пиридином. Осадок гидролизовали колотым льдом, фильтровали, промывали водой, 4 раза 1% -ным NaOH, отмывали водой остатки щелочи, 4 раза промывали 5%-ным HCl с последующей обработкой водой до нейтральной рН, сушили. Процент моно-, ди- и трифосфатов 70, 20 и 10 соответственно.

П р и м е р 2.

2.1. 100 мл сферически гранулированной целлюлозы, полученной по способу [3] поместили в колбу с мешалкой, добавили смесь 65 мл 0,5 М раствора NaOH с 3 мл эпихлоргидрина и перемешивали в течение 1 ч при t 60oC. Затем температуру повысили до 95оС и перемешивали еще в течение 1 ч. Охладили до комнатной температуры и промыли гранулы до нейтральной реакции водой на фильтре. Предел эксклюзии сорбента по декстранам (метод ГПХ) составляет 4способ получения сорбентов, патент № 2059969107 д. Плотность по D-глюкозным звеньям от 0,2 до 1,0 мгспособ получения сорбентов, патент № 2059969экв/мл, размер гранул 80-120 мкм.

2.2. 100 мл гранул целлюлозы (по 2.1) поместили в емкость с фильтром, промыли последовательно двумя объемами ацетона (или спирта), затем хлороформа (или толуола) и ввели 9,5 мл POCl3, затем добавили 10 мл сухого пиридина или триэтиламина. Смесь оставили на 1 ч при температуре 25-30о. Матрицу промыли последовательно хлороформом, диоксаном, затем 50%-ным водным пиридином, 1%-ным водным NaOH и водой до нейтральной рН.

П р и м е р 3. 1 л нейтрального геля (Биохром-Н), полученного по способу [4] и подготовленного по примеру 2.1, суспендировали в 0,5 л воды при t 45-50oC, при перемешивании вводили 0,1-0,15 л эпихлоргидрина и 0,1 л 10-15 М водного раствора NaOH в течение 2-3 ч, фильтровали, матрицу промывали водой до нейтрального рН.

1 л подготовленной матрицы выдерживали в 1 л 0,5-1,0N раствора Na2HPO4 в течение 6-8 ч при температуре 40-50оС. Результаты сведены в табл. 1.

П р и м е р 4. 100 мл нейтрального геля (Биохром-Н 1000), полученного по способу [4] и подготовленного по способу 2.1, поместили в стеклянную емкость с пористым фильтром, промыли последовательно двумя объемами ацетона (или этанола), толуола (или хлороформа) и ввели 9,5 мл POCl3, затем 10 мл безводного пиридина или триэтиламина. Смесь оставили на 1 ч при температуре 25-30оС. Далее матрицу промыли последовательно по два объема соответственно хлороформом, диоксаном, 50% -ным водным раствором пиридина, 1%-ным водным раствором NaOH и водой до нейтрального рН. Свойства сорбента аналогичны представленным в табл. 2.

П р и м е р 5. 100 мл сферически гранулированной целлюлозы, полученной по способу [3] и подготовленной для модификации по примеру 2.1, суспендировали в 50 мл воды при температуре 50-60о и при перемешивании вводили 10-15 мл эпихлоргидрина и 10 мл 15 мл водного раствора NaOH в течение 2-3 ч. Матрицу промывали на фильтре водой до нейтрального рН, выдерживали в 100 мл 0,5-1,0 н. раствора Na2HPO4 в течение 6-8 ч при температуре 40-50оС, промывали водой до нейтральной рН.

Свойства опытов приведены в табл. 2.

Размер гранул в ходе реакции не изменился. Полученные таким образом сорбенты содержат только монофосфоэфирные группы.

Физико-химические характеристики сорбентов в сравнении с прототипом и аналогом (фосфокатинит Р-11 фирмы Ватман, Англия) сопоставляли, пропуская через колонку 10 х 100 мм 0,1 н. раствор NaCl при давлении, равном 1 (в см водяного столба (см высоты колонки).

Эффективность сорбентов испытывали в процессе очистки лактадегидрогеназы (аналог Р-11) и инсулина.

П р и м е р 6. На колонку 10 х 100 мм наносили раствор смеси белков, содержащий лактодегидрогеназу 2 мл в 0,03 н. Na-фосфатном буфере (рН 7,5) при скорости потока 20 мл/ч. Колонку промывали тем же буфером, v 15 мл, элюировали белки в линейном градиенте 0-0,5 н. NaCl в том же буфере. Фракции по 4,4 мл собирали и определяли содержание белка и активность фермента. Результаты сведены в табл. 3.

П р и м е р 7. Хроматографическая очистка реакционной смеси после ферментативного превращения проинсулина и инсулин на колонке, заполненной сорбентом фосфо-Биохром.

Реакционную смесь объемом 2,3 л, содержащую 3 л фосфо-Биохром и уравновешенную исходным буфером, 50 мМ ацетат натрия рН 4,0 и 3,5 М мочевины. После нанесения смеси колонку промывали 7,2 л исходного буфера (2 ч) со скоростью протока 3,6 л/ч. При этом С-пептид, не задерживаясь на колонке, выходит первым, за ним элюируются примеси, которые в стартовых условиях не сорбируются на колонке. Далее элюирует белок в режиме линейного градиента от 0 до 100%-ного буфера 50 мМ ацетат натрия рН 4,0, 5 М мочевина и 0,5 М NaCl против исходного буфера в течение 7 ч (общий объем элюента 25 л). По окончании элюции колонка уравновешивается 9 л исходного буфера для следующего хроматографического цикла. Фракции, содержащие С-пептид без примесей, собирают в объеме 2,5-12 г. Фракции, содержащие инсулин без примесей, собирают в объеме 7,5 л 14 г. Чистота получаемого таким способом С-пептида составляет 85-95% Чистота получаемого таким образом инсулина составляет 95%

На сорбенте SP-Тойоперл 550 С фирмы Toson Corp, Япония, позволяющем выделять инсулин с чистотой не менее 95% белок С в чистом виде за одну хроматографическую стадию получить не удалось, т.к. вместе с белком С выходят все примеси, в результате фракции, содержащие С-белок, сильно загрязнены.

Как показали проведенные эксперименты, использование изобретения позволяет получать сорбенты, сочетающие высокие гидродинамические характеристики с более эффективными эксплуатационными характеристиками.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТОВ, содержащих фосфогруппы, включающий обработку гидроксилсодержащих матриц фосфорилирующим агентом, отличающийся тем, что матрицы предварительно обрабатывают эпихлоргидрином в присутствии щелочи (pH > 12), а процесс фосфолирования производят при температуре не более 50oС.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фосфорилирование проводят обработкой матрицы POCl3.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фосфорилирование проводят обработкой матрицы Na2HPO4.

Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C08B1/02 подготовка целлюлозы для получения сложных эфиров 

Класс C08B5/00 Получение сложных эфиров целлюлозы и неорганических кислот

Патенты РФ в классе C08B5/00:
способ получения нитроцеллюлозы -  патент 2523472 (20.07.2014)
способ получения коллоксилинов из пироксилиновых порохов -  патент 2492187 (10.09.2013)
способ сульфатирования карбоксиметилцеллюлозы -  патент 2471809 (10.01.2013)
способ получения мелкодисперсных нитратов целлюлозы -  патент 2441880 (10.02.2012)
получение полифункциональных сульфатированных производных на основе порошковой целлюлозы, обладающих антикоагулянтной активностью -  патент 2430729 (10.10.2011)
способ получения сульфатированной целлюлозы -  патент 2426746 (20.08.2011)
способ сульфатирования микрокристаллической целлюлозы -  патент 2404994 (27.11.2010)
смешанный эфир целлюлозы, содержащий одновременно сульфатные и фосфатные группы, и способ его получения -  патент 2395524 (27.07.2010)
способ получения нитратов целлюлозы -  патент 2350624 (27.03.2009)
способ получения динитратов целлюлозы из лигноцеллюлозного сырья -  патент 2339648 (27.11.2008)

Наверх