способ получения мембраносвязанной ацетилхолинэстеразы тли

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕМБРАНОСВЯЗАННОЙ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ТЛИ, предусматривающий экстракцию фермента из гомогената исходного сырья буфером, содержащим неионный детергент, и последующую очистку колоночной хроматографией с использованием сорбента, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют персиковую тлю Myzus persicae Sulz, детергента -Твин 20, а очистку ведут на колонке с сорбентом TSK GEL TOYOPEARL HW 60.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биохимии, в частности к получению ацетилхолинэстеразы из гомогената персиковой тли Myzus persicae Sulz. Фермент, полученный предложенным способом, может быть использован для оценки антихолинэстеразных свойств фосфорорганических и карбаматных соединений в целях поиска и синтеза инсектицидов и афицидов.

Известны способы получения частично очищенных ацетилхолинэстераз (АХЭ) из различных видов насекомых. Специфичностью методов выделения мембраносвязанной АХЭ в раствор является использование различных детергентов: бутанола, таурорхолата натрия, дезоксихолата натрия, тритона Х-100, смеси таурохолата натрия с бутанолом или тритоном Х-100, а также высаливание активных белков сульфатом аммония, центрифугирование в градиенте сахарозы, автолиз и введение бактериальной протеазы. Однако Н.R.Smissaert не удалось солюбилизировать структурносвязанную АХЭ персиковой тли Myzus persicae Sulz. ни одним из следующих приемов: обработкой толуолом, тритоном Х-100, дезоксихолатом натрия, трипсином, повторным замораживанием и размораживанием. По-видимому, связь мембраносвязанной АХЭ персиковой тли с клеточными структурами более прочная, чем у злаковой тли Schizaphis hramina Rond. При этом Н.R.Smissaert установил, что растворимая форма АХЭ персиковой тли, также как и многих других видов тлей является SН-чувствительной холинэстеразой, что отличает их от АХЭ из всех других известных источников. В литературе есть также сведения об использовании Твина в качестве солюбилизатора мембраносвязанных АХЭ из эритроцитов крови теплокровных и из грубого гомогената голов сверчка.

Частичная очистка мембраносвязанных АХЭ насекомых проводилась в основном методом колоночной хроматографии с применением различных сорбентов: сефадексов Г-100, Г-150, Г-200, ДЭАЭ-целлюлозы, фосфата кальция, ДЭАЭ сефадекса А-50, биогеля НТ, сефарозы 6В, аффи-геля 202, сефарозы 4В, триметиламмонийанилина и триметил-(н-аминофенил)-аммоний хлорида.

Следует также указать, что выполненные нами эксперименты проводились с использованием известных ранее методов исследования.

Наиболее близким из известных, принятым за прототип, является способ выделения и частичной очистки мембраносвязанной АХЭ злаковой три Schizaphis hramina Rond. Недостатком этого способа является метод подготовки биоматериала, использование неэффективного для перевода АХЭ персиковой тли в раствор детергента тритона Х-100, применение непрочного сорбента биогеля А 5М для колоночной хроматографии.

Цель настоящего изобретения упростить способ получения мембраносвязанной АХЭ из нового источника персиковой тли Myzus persicae Sulz. использованием эффективного детергента Твина 20 для перевода мембраносвязанной формы АХЭ в раствор и прочного сорбента TSK-GEL TOYOPEARL HW-60 в колоночной хроматографии, что увеличивает кратность очистки энзима в 2 раза. Согласно предложенному способу можно получить 6-7-кратно очищенную мембраносвязанную форму АХЭ персиковой тли.

Сущность предложенного способа заключается в том, что персиковая тля Myzus persicae Sulz. является широким полифагом в отличие от злаковой и многих других видов тлей. Ее можно разводить в лабораторных условиях на различных сельскохозяйственных растениях, что способствует получению большего количества биомассы насекомых (смесь самок и личинок разных возрастов). Биомасса тли лиофилизируется в лабораторном лиофилизаторе с целью увеличения концентрации АХЭ в исходном материале. Высушенную тлю растирают в ступке, получают однородный порошок, который хранят в закрытых крышками бюксах и эксикаторе. Порошок используют по мере необходимости. Из порошка при помощи гомогенизатора готовят гомогенат на натрийфосфатном буфере при соотношении ткани и растворителя 1:15, вес/объем. Отфильтрованный через капрон гомогенат центрифугируют на ультрацентрифуге в жестком режиме для отделения растворимых форм холинэстераз (ХЭ) от мембраносвязанных. Полученный осадок является источником мембраносвязанной формы АХЭ персиковой тли.

Поскольку АХЭ персиковой тли существует преимущественно в мембраносвязанной форме, то для выделения ее в раствор необходимо осуществить солюбилизацию. Наша проверка эффективности Твина 20, Твина 60 и Твина 80 подтвердила вывод о том, что наилучшим солюбилизатором является Твин 20.

Осадок, полученный указанным выше способом, при помощи того же буфера, но содержащего 4% Твина 20, доводят до состояния однородной суспензии. Экстракцию мембраносвязанной АХЭ проводят при постоянном перемешивании в течение 2-х ч. Отделение экстракта от нерастворимых частиц осуществляют ультрацентрифугированием. В результате выполненных операций по солюбилизации мембраносвязанной АХЭ персиковой тли в экстракт переходит 9,67% белка, обладающего 44,7% активностью при использовании субстрата ацетилтиохолина (АТХ) и 8,5% активностью при использовании субстрата бутирилтиохолина (БуТХ) от исходной в гомогенате. Степень очистки энзима 4-5 кратная.

Полученный экстракт используют для дальнейшей очистки мембраносвязанной АХЭ персиковой тли методом колоночной хроматографии на колонке, заполненной прочным и легко регенерируемым сорбентом TSK-GEL TOYOPEARL HW-60. Выделившиеся активные фракции объединяются и лиофилизируются. Выход белка 4,8% обладающего 30,0% активностью по АТХ и 5,6% по БуТХ. Удельная активность 6-7 кратно очищенной мембраносвязанной АХЭ персиковой тли 0,23 мкмоль/мин мг белка.

Способ очистки мембраносвязанной АХЭ тли известен, а в предлагаемом способе очистку мембраносвязанной АХЭ проводят из другого источника с использованием иного солюбилизатора, методом колоночной хроматографии с применением прочного, удобного для работы, легко регенерируемого сорбента, что обеспечивает его упрощение, повышение степени очистки энзима и получение 6-7 кратно очищенной АХЭ персиковой тли с удельной активностью 0,23 мкмоль/мин мг белка.

П р и м е р. 1. С 1 м² посадки свеклы, картофеля, перца и др. растений получают 18-20 г биомассы тлей (смесь самок и личинок разных возрастов), которую помещают в бюксы с закрытыми крышками; бюксы переносят в морозильную камеру при -4^оС и хранят для накопления достаточного количества биоматериала. Замороженную тлю лиофилизируют. Лиофилизацию проводят в чашках Петри в лабораторном лиофилизаторе типа ОЕ 950 (Венгрия) в течение 24 ч при температуре плиты 40^оС. Высушенную тлю растирают в охлажденной ступке и получают однородный порошок в количестве 8,5-10 г. Порошок можно хранить длительное время в закрытых бюксах и эксикаторе при 4^оС. Используют его по мере необходимости.

2. Для приготовления гомогената на 0,05 M натрийфосфатном буфере, рН 7,5 в соотношении 1:15 вес/объем, 2,6 г порошка смешивают с 36,4 мл буфера и гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе с пришлифованным пестиком при скорости вращения его 200 об/мин. Для удаления грубых частиц гомогенат фильтруют через капрон.

3. Для разделения растворимых форм холинэстераз от мембраносвязанных гомогенат центрифугируют на ультрацентрифуге Spinco L7-55 при ускорении 100000g в течение 1 ч. Надосадочную жидкость используют для частичной очистки растворимой бутирилхолинэстеразы (БуХЭ), а осадок является источником получения частично очищенной мембраносвязанной формы АХЭ.

4. Для выделения мембраносвязанной АХЭ персиковой тли в раствор осадок суспендируют 28 мл натрийфосфатного буфера 0,05 М, рН 7,5, содержащего 4% Твина 20, в течение 2-х ч при постоянном перемешивании (на холоду). Затем суспензию центрифугируют на ультрацентрифуге Spinco L7-55 при 100000g в течение 1 ч. Полученный экстракт (надосадок N 2) содержит 9-10% белка, обладающего 40-45% активности по АТХ и 8-8,7% по БуТХ от исходной в гомогенате. (Образовавшийся осадок N 2 отбрасывается). В результате выполненных операций в экстракт переходит 4-5 кратно очищенная мембраносвязанная АХЭ с удельной активностью 0,15-0,17 мкмоль/мин мг белка.

5. Частичная очистка мембранной АХЭ персиковой тли выполняется методом жидкостной хроматографии на колонке, размером 360 мм х 25 мм, заполненной прочным, удобным для работы и легко регенерируемым сорбентом TSK-GEL TOYOPEARL HW-60 (фирма TOYO SODA, TOKYO, Япония), уравновешенной 0,05 М натрийфосфатным буфером, рН 7,5. Этот сорбент по химическому строению отличается от декстрановых, агарозных и полиакриламидных гелей. Он представляет собой полуокаменелые сферические частички из гидрофильного винилового полимера, мало отличающихся между собой по размерам. Взаимодействие частиц геля с разделяемыми компонентами происходит за счет из функционирования с гидроксильными группами сорбента. Этот гель рекомендуется для использования в индустриальной биохимии. Он оказался удобным для работы с нашими полупрепаративными колонками. Высота столбика геля в колонке 260 мм. Элюция энзима проводилась тем же буфером, но без Твина 20, со скоростью 30 мл/ч с помощью перистальтического насоса S-31 (Польша). На колонку наносится 25 мл экстракта. Первая фракция, соответствующая свободному объему, равнялась 40 мл; объем каждой из последующих фракций был одинаков, по 5 мл. Активность энзима определялась по двум субстратам АТХ и БуТХ. Присутствие в экстракте детергента Твина 20 может отразиться на определении белка в пробах по методу Хартри, несмотря на то, что элюаты использовали в объеме 0,1 мл, т.е. при 10-кратном разбавлении белка и детергента. Поэтому присутствие белка и детергента в пробах параллельно определяли на спектрофотометре СФ-26 (Российская Федерация) при длине волны 280 нм, которая в наибольшей степени соответствует спектру поглощения Твина 20.

На чертеже представлены кривые элюции АХЭ персиковой тли по двум субстратам, где 1 поглощение при длине волны 280 нм, 2 белок мг/мл, 3 активность по АТХ, 4 активность по БуТХ. Пики активности энзима по АТХ и БуТХ совпали с выходом основной массы белка: фракции с 9 по 13. Пик, имеющий наибольшую оптическую плотность при = 280 нм, но содержащий мало белка, определенного по ХАРТРИ, по-видимому, обеспечивается за счет Твина 20 и сопутствующих небелковых компонентов: фракции с 4 по 8. Так, при гель-хроматографии на колонке с TSK-GEL TOYOPEARL HW-60 можно удалить основную часть солюбилизатора и получить 6 7 кратно очищенную мембраносвязанную АХЭ персиковой тли с удельной активностью 0,23 мкмоль/мин мг белка. Активные фракции с 10 по 13 объединяются и лиофилизируются. Выход белка 4,8% активность АХЭ по АТХ 30% по БуТХ 5,8% В табл. 1 представлены данные по выделению и частичной очистке мембраносвязанной АХЭ персиковой тли. В табл. 2 представлен баланс белка и активности энзима при выделении и частичной очистке на колонке с TSK-GEL TOYOPEARL HW-60. Сходимость результатов удовлетворительная. Данный сорбент характеризуется стабильностью, удобством в работе и возможностью многократного его использования. Кривые элюции белка и активности фермента близки между собой, что дает возможность рассчитать средние показатели и их отклонения.

6. Изучены каталитические свойства частично очищенной мембранной АХЭ персиковой тли. Этот энзим также оказался чувствительным к SH-реагенту-5,5-дитио-бис-(2-нитробензойной) кислоте. Он проявил высокую чувствительность к воздействию температуры: при 30-40^оС наблюдается быстрая потеря активности. Этот фермент обладает узкими пределами рН-оптимума: от 6,0 до 8,5.

В отличие от АХЭ теплокровных и злаковой тли частично очищенная мембраносвязанная АХЭ персиковой тли катализирует гидролиз трех субстратов: с наибольшей скоростью АТХ, в 3-3,5 раза медленнее пропионилтиохолин (ПрТХ) и в 10 раз медленнее БуТХ. К_м для этих субстратов соответственно равны: 9,2 10^-4 М, 2,08 10^-4 М и 2,74 10^-3 М. Подобно АХЭ теплокровных активность АХЭ персиковой тли тормозится в зоне высоких концентраций субстратов АТХ и ПрТХ, что свидетельствует о наличии аллостерического пункта на активной поверхности фермента. Мембраносвязанная АХЭ персиковой тли высоко чувствительна ко многим тестовым ингибиторам: эзерину, ДФФ (диизопропилфторфосфату), ГТ 165, ГТ 231, ГД-7, ГД-42. На основе этих признаков частично очищенную мембраносвязанную АХЭ персиковой тли можно классифицировать как ацетилгидролазу ацетилхолина, КФ 3.1.1.7.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить 6-7 кратно очищенную мембраносвязанную АХЭ персиковой тли с удельной активностью 0,23 мкмоль/мин мг белка. Кратность очистки фермента по сравнению с прототипом выше в 2 раза. Фермент, полученный предлагаемым способом, может быть использован для оценки антихолинэстеразной активности фосфорорганических и карбаматных соединений в целях поиска и синтеза инсектицидов и афицидов, в том числе и селективных.