способ определения изоточки полиэлектролитов

Формула изобретения

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗОТОЧКИ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ, заключающийся в наложении электрического поля на исследуемый раствор полиэлектролита, отличающийся тем, что раствор полиэлектролита подвергают электродиализу с применением ионселективных мембран, в процессе которого регистрируют кинетическую зависимость рН и определяют изоионную точку полиэлектролита в момент выхода зависимости на плато.

Описание изобретения к патенту

Изобретение касается анализа физико-химических показателей полиэлектролитов, в частности белков.

Известен способ определения изоэлектрической точки (ИЭТ) белков методом изоэлектрофокусирования в искусственном градиенте рН, который создается с помощью набора синтетических амфолитов [1] Чаще применяют не просто раствор, а гель агарозы или проводят процесс электрофореза в градиенте плотности сахарозы. Это используется для исключения размывания сфокусированной зоны. Белок перемещается в электрическом поле в сторону рН, соответствующего ИЭТ, т. е. туда, где его суммарный заряд равен нулю.

Белки, природные амфолиты, содержат в своей структуре ионогенные группы различной полярности, степень ионизации которых зависит от рН и ионного состава раствора. Соотношение нейтральных и заряженных групп определяет суммарный заряд молекулы белка, который может быть отличным от нуля. В случае, когда молекула имеет заряд равный нулю, белок не может перемещаться в электрическом поле; рН такого раствора называют изоэлектрической точкой. На положение ИЭТ существенное влияние может оказывать ионное окружение молекулы белка. Поэтому более строгим понятием является изоионная точка (ИИТ), которую определяют как изоэлектрическую точку в свободном от солей растворе. Так, изоэлектрическая точка бычьего сывороточного альбумина 5,4 в 0,15 М NaCl, а его изоионная точка равна 4,9 [2] Изоионную точку определяют либо аппроксимацией экспериментальных данных на нулевую ионную силу раствора, либо путем сложных математических расчетов, требующих знания структуры и конформации белка.

Целью изобретения является практическое определение изоионной точки полиэлектролитов, в частности белков.

Сущность способа заключается в том, что раствор полиэлектролита подвергают электродиализу с применением ионселективных мембран, в процессе которого регистрируют кинетическую зависимость рН и определяют изоинную точку полиэлектролита в момент выхода зависимости на плато.

На фиг. 1 представлена схема экспериментальной установки; на фиг. 2-6 кинетические кривые зависимости рН при определении изоионной точки различных полиэлектролитов методом электродиализа (соответственно примеры 1-5).

Экспериментальная установка состоит из катионообменной мембраны 1, анионообменной мембраны 2, камеры 3 обессоливания, камеры 4 концентрирования, насоса 5, источника 6 постоянного напряжения, рН-метра 7 и самописца 8.

Исходно полиэлектролит, в частности белок, находится в буферном растворе, в камерах 4 концентрирования циркулирует дистиллированная вода. Под действием электрического поля возникает направленный перенос ионов. К катоду двигаются катионы, к аноду анионы. На своем пути ионы встречают катионообменные мембраны 1, которые селективно пропускают катионы, а ионообменные мембраны 2, которые селективно пропускают анионы. Таким образом, происходит деионизация удаление ионизированных примесей из исходного раствора в камере 3 обессоливания. Пройдя через ионообменные мембраны 1 и 2, ионы попадают в камеру 4 концентрирования, где рекомбинируют с образованием исходных соединений. По мере удаления из камеры 3 обессоливания 3 ионов и нарастания концентрации последних в камере 4 концентрирования происходит перераспределение проводников электричества в системе, что сопровождается в потенциостатическом варианте электродиализа нарастанием электрического тока до момента уравнивания концентраций ионов в камерах 3 и 4 обессоливания и концентрирования соответственно. При дальнейшем обессоливании величина тока в электродиализной ячейке падает (растет ее общее электросопротивление) и, наконец, при достаточно значительной степени обессоливания возникает предельное состояние на мембранах 1 и 2, которое сопровождается разложением воды на границе раздела мембрана-раствор с поставкой в раствор ионов гидроксила и гидроксония. Предельное состояние для анионообменной мембраны 2 наступает при более высоких значениях тока, т.е. в первую очередь в зону камеры обессоливания 3 будут поступать ионы гидроксония, что и приводит к закислению обессоливаемого раствора. В дальнейшем аналогичное состояние наступает и на катионообменной мембране 1. В раствор начинают поступать гидроксил-ионы и, как следствие, рН раствора асимптотически стремится к нейтральному. Несмотря на появление дополнительных переносчиков электричества (Н⁺ и ОН^-) процесс удаления иных ионогенных примесей не прекращается. Одновременно в камере 3 обессоливания имеет место диссоциация ионогенных групп исследуемого объекта (белка). Противоионы ионогенных групп объекта под действием электрического поля также удаляются из зоны камеры 3 обессоливания, как и ионы примесей. Система стремится к такому состоянию, которое характеризуется полным отсутствием в зоне обессоливания ионных низкомолекулярных примесей. В этом случае рН исследуемого раствора определяется соотношением зарядов ионогенных групп объекта (белка), и кинетическая кривая зависимости рН выходит на плато. Раствор приобретает величину рН, соответствующую изоэлектрической точке белка в отсутствии иных органических или минеральных противоионов, т.е. изоионной точке.

П р и м е р 1. Для экспериментального определения изоионной точки уреазы 50 мл ее раствора в буфере (30 мм tris-HCl + 0,3 M NaCl, рН 7,8) подвергали электродиализу с использованием чередующихся катионообменных 1 МК-40 и анионообменных 2 МА-40 мембран, образующих одну камеру 3 обессоливания и две камеры 4 концентрирования. В камеру 3 обессоливания подавали исходный раствор белка, в камеру 4 концентрирования дистиллированную воду. Объем растворов, циркулирующих в камерах 4 концентрирования, равен 250 мл/мин. Проточности растворов в камерах были равны 10 мл/мин. Электродиализ проводили в циркуляционном режиме при постоянном напряжении на электродах 40В. Рабочая площадь каждой мембраны 1 и 2 равна 4 см². Межмембранное расстояние 1 см. Материал электродов платина. Процесс считали законченным по выходу кривой изменения рН на плато (рН 5,00). ИИТ 5,00.

П р и м е р 2. Экспериментальное определение изоинной точки папаина проводили в аналогичных примеру 1 условиях. Процесс считали законченным по выходу кривой изменения рН на плато (рН 9,10). ИИТ 9,10.

П р и м е р 3. Экспериентальное определение изоионной точки инсулина КРС проводили в аналогичных примеру 1 условиях. Процесс считали законченным по выходу кривой изменения рН на плато (рН 5,85). ИИТ 5,85.

П р и м е р 4. Экспериментальное определение изоионной точки БСА проводили в аналогичных примеру 1 условиях. Процесс считали законченным по выходу кривой изменения рН на плато (рН 4,95). ИИТ 4,95.

П р и м е р 5. Для определения изоионной точки уреазы использовали также ее раствор в карбонатном буфере (0,2М Na₂CO₃ + NaHCO₃ + 0,2 M NaCl, РН 10,0). Условия эксперимента аналогичны описанным в примере 1. Процесс считали законченным по выходу кривой изменения рН на плато (рН 5,05). ИИТ 5,05.

Условия экспериментов и результаты приведены в таблице.

Как видно из таблицы, значения изоточек различных белков, полученных предлагаемым способом, хорошо согласуются с полученными по известному способу. Так, например, значение изоточки уреазы в различных буферных системах равна 5,00 и 5,05, а изоточка этого белка, полученная известным способом, соответствует 5,00. Аналогичное совпадение данных наблюдается и для других белков, приведенных в таблице.

Сравнение значений изоточек различных белков, определенных известным и предлагаемым способами представлены в таблице.