гибридный полипептид, обладающий активностью ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁

Формула изобретения

1. Гибридный полипептид, обладающий активностью ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁ тимозин - ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> фактор некроза опухолей-тимозин a₁ полученный в штамме, трансформированном рекомбинантной плазмидой, содержащей ген с нуклеотидной последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность и указанный в описании, имеющий мол.м. мономера 23,78 КДа, изоэлектрическую точку 4,5 и предназначенный для выщепления из него химическими методами дезацетилтимозина ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁ или для применения в качестве иммуномодулирующего препарата.

2. Способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁ тимозин ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> фактор некроза опухолей тимозин a₁ заключающийся в культивировании штамма Escherichia coli SG 20050 с плазмидой p Thy 325 при 37^oС до поздней фазы экспоненциального роста, а затем до стационерной фазы при 40 41^oС в жидкой питательной среде с последующим выделением и очисткой гибридного белка из надосадочной жидкости и осадка, получающихся после лизиса клеток, для этого надосадочную жидкость наносят на гидрофобный носитель (фелил) при рН 5,8 6,0 в присутствии 33%-ного насыщения сульфата аммония, носитель промывают буфером без сульфата аммония при рН 5,8 - 6,0 и элюируют гибридный белок этим же буфером, содержащим дополнительно 6 М мочевины, фракции с гибридным белком наносят на анионообменный носитель ДЕАЕ при рН 5,6 5,8 в буфере с 7 М мочевиной, элюируют гибридный белок тем же буфером с добавлением до 250 мМ NaCl, затем фракции с гибридным белком наносят на матрицу с иммобилизованным красителем Cibacron Blue, уравновешенную буфером с 7 М мочевиной при рН 5,5 5,8, белок элюируют буфером с градиентом рН 7,0 - 7,8 в присутствии 7 М мочевины и 0,4 М NaCl.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что культивирование проводят в среде следующего состава 1 1,4% пептона или трептона, 1 1,6% дрожжевого экстракта, 1 1,15% NaCl и 50 мкг/мл ампициллина.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что для очистки гибридного белка из осадка, получившегося после лизиса клеток, его растворяют в буфере, содержащем 6 М мочевины, и не используют хроматографию на гидрофобном носителе.

5. Рекомбинатная плазмидная ДНК pThy 325, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающий активностью ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁ тимозин ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> фактор некроза опухолей тимозин a₁ с мол.м. 23, 78 КДа, имеющая мол.м. 2,2 МДа и размер 3,33 т.п. н. содержащая: KpnI Eco91I фрагмент ДНК размером 0,5 т.п.н. плазмиды pThy 230 с участком связывания рибосом, частью гена гибридного белка, имеющего последовательность для тимозина ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁ промежуточной последовательностью аспарагиновая кислота пролин и N-концевой части фактора некроза опухолей ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁ KpnI Eco91I фрагмент ДНК размером 2,8 т.п.н. плазмиды pThy 315 с тандемом ранних промоторов А2 и А3 бактериофага Т7, частью гена гибридного белка, имеющего последовательность С-концевой части фактора некроза опухолей ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> и тимозина a₁ между которыми находится метиониновый остаток, а также терминатор транскрипции фага ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058011/955.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> генетический маркер селекции: ген b лактамазы, придающий устойчивость к ампициллину клеткам Escherichia coli, трансформированным плазмидой pThy 325, уникальные сайты рестрикции, расположенные на расстоянии, т.п.н. EcoRI 0 и 0,11, BglII 0,32 и 0,88, BamnI 0,36, ClaI 0,27 и 0,83, Eco47III 0,76, Eco91I 0,75, KpnI 0,25, PstI 2,58, XbaI 0,93 и 1,03.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой сконструированную in vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую ген, кодирующий синтез гибридного белка ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁-тимозин-фактор некроза опухолей- ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-тимозин- ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁ (Т-ФНО-Т).

Известна плазмида рThy314, кодирующая гибридный белок ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-фактор некроза опухолей-тимозин- ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁ (ФНО-Т) и белки устойчивости к антибиотикам ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058027/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> -лактамазу и хлорамфениколацетилтрансферазу (заявка на авт. св. N 4760812).

Недостатком использования плазмиды рThy314 является наличие в цитоплазме клеток, трансформированных этой плазмидой, наряду с гибридным белком ФНО-Т в равном по массе количестве белка хлорамфенилколацетилтрансферазы. Выявлено, что плазмида рТhy314 нестабильна при культивировании штамма SG 20050 (рТhy314) в бульоне после хранения на плотных питательных средах.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pThy230 (Коробко В.Н. и др. Биоорганическая химия, 1992, т. 18, N 5, с. 646-659) кодирует синтез гибридного белка ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁-тимозин-фактор некроза опухолей- (Т-ФНО). Указанный гибридный белок обладает биологической активностью в тесте цитотоксичности на клетках 1-929 и предназначен для выщепления пептида, подобного ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁-тимозину, за счет гидролиза кислотолабильной связи аспарагиновая кислота пролин между аминокислотными последовательностями тимозина-₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> и ФНО.

Недостатком использования плазмиды рТhy230 для выщепления ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁-тимозина является растворимая форма гибридного белка, кодируемого этой плазмидой, что требует применения способов предварительной хроматографической очистки этого белка, затем его осаждения и последующего растворения в кислоте для выщепления тимозина. Предварительная очистка гибридного белка является необходимым этапом, поскольку кислотный гидролиз суммы белков E. coli приведет к выщеплению множества пептидов, сравнимых по размерам с 1-тимозином, и затруднит его последующую очистку.

Способ очистки ФНО включает последовательные этапы хроматографии синтезированного ФНО на гидрофобных носителях (пористом стекле, фенил-сефарозе), анионообменниках при рН от 7,8 до 10 и аффинной матрице с иммобилизованным красителем (красный, зеленый, синий) в том же интервале значений рН.

Синтезируемый в клетках микроорганизмов ФНО находится в основном в растворимой форме, поэтому все процедуры очистки проводятся без использования денатурирующих агентов, таких как мочевина, гуанидингидрохлорид и др.

Способы очистки гибридных белков на основе ФНО и тимозина неизвестны.

Задачей изобретения является

1) получение рекомбинантной плазмидной ДНК рТhy325, кодирующей синтез нового гибридного белка ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁-тимозин-₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> -фактор некроза опухолей-тимозина- ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁ (Т-ФНО-Т), обладающего широким спектром иммуномодулирующего действия;

2) создание способа получения гибридного белка Т-ФНО-Т, обеспечивающего стабильное наследование плазмиды в процессе культивирования и получение максимального синтеза гибридного белка;

Поставленная задача решается

1) получением промежуточной плазмидной ДНК pThy315, являющейся производной рТhy314 с делением гена хлорамфениколацетилтрансферазы, а затем рекомбинацией фрагментов плазмидных ДНК рТhy315 и pThy230 in vitro. При этом Крh1 Eco911 фрагмент размером 498 нуклеотидных пар плазмиды рТhy230, содержащий последовательность для ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁-тимозин, дипептида аспарагиновая кислота-пролин и N-концевой части ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> -ФНО, лигируется с КрnI-Eco911 фрагментом размером 2,8 т. н. п. плазмиды рТhy315, содержащим последовательность для С-концевой части ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-ФНО и ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> ₁-тимозина, которому предшествует метиониновый остаток для расщепления бромоцианом. В результате описанной рекомбинации получают плазмиду рТhy325, кодирующую синтез гибридного белка ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-ФНО с двумя последовательностями ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁-тимозина на N и С-концах ФНО.

2) поведением культивирования первичных трансформантов штамма SG 20050, которые засевают в бульон с 50 мкг/мл ампициллина сразу после трансформации клеток плазмидой рТhy325. После выращивания в бульоне около 100% клеток сохраняют плазмиду. По данным электрофореза количество гибридного белка в клетках достигает максимума в поздней фазе экспоненциального роста и выходе культуры на стационар.

Поскольку культивирование свежеполученных трансформантов является не вполне технологичным, применяют другой вариант культивирования. Свежеполученные трансформанты выращивают до экспоненциальной фазы роста, затем производят отбор культуры, добавляют стерильный глицерин до 40% и хранят клетки при 20^оС в течение нескольких месяцев. Для последующих культивирований в ферментере используют в качестве посевного материала эти консервированные клетки;

3) проведением подбора и оптимизации состава питательного бульона для культивирования штамма SG 20050 с плазмидой рТhy325 и получения максимального уровня синтеза гибридного белка;

4) проведением культивирования при 37^оС, а в конце экспоненциальной фазы роста при Н 41^оС, при этом получают гибридный белок Т-ФНО-Т в нерастворимой форме; проведением культивирования при температуре 30^оС, при этом получают гибридный белок Т-ФНО-Т в растворимой форме;

5) использованием очистки гибридного белка в нерастворимой форме после лизиса клеток за счет а) отмывки осадка гибридного белка; б) растворения осадка гибридного белка в 6 М растворах мочевины;в) очистки гибридного белка в присутствии мочевины хроматографией на анионообменниках (ДЕ-, ДЕАЕ-) и аффинных матрицах с иммобилизованным красителем (голубой); г) диализа раствора очищенного белка против забуференного физиологического раствора при рН 7,2-7,4.

6) использованием очистки гибридного белка в растворимой форме после лизиса клеток за счет а) очистки гибридного белка в присутствии мочевины последовательными хроматографиями на фенил-сефарозе, анионообменниках (ДЕ-, ДЕАЕ-) и аффинных матрицах с иммобилизованным красителем (голубой); б) диализа раствора очищенного белка против забуференного физиологического раствора при рН 7,2-7,4.

При использовании перечисленных признаков достигаются следующие технические результаты:

1) получают новую плазмидную ДНК рТhy325 (фиг. 1), кодирующую синтез нового гибридного белка Т-ФНО-Т (фиг. 3-7);

2) предложенный способ позволяет получать воспроизводимые результаты, обеспечивает стабильное 100%-ное наследование плазмид и высокий уровень синтеза гибридного белка (30-40% от общего клеточного белка). Указанный результат не достигается при использовании для последующих культивирований клеток, достигших стационарной фазы роста на плотной или в жидкой питательной среде;

3) предложенный способ позволяет получать максимальный (указанный выше) уровень синтеза гибридного белка и не требует дополнительного поддержания оптимального рН в процессе культивирования;

4) культивирование при повышенной (до 41^оС) температуре позволяет получать гибридный белок в нерастворимой форме и проводить его очистку после лизиса клеток, не используя хроматографические методы, и непосредственно растворять его в кислотах для выщепления тимозина, причем из каждой молекулы гибридного белка получается две молекулы тимозина;

5) гибридный белок, полученный предложенным способом, имеет чистоту не менее 95% по данным электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ-ДСН) и позволяет получать Т-ФНО-Т в растворе для использования в качестве иммуномодулирующего препарата;

6) сравнительное излучение (пример 8) с использованием широкого набора иммунологических тестов указывает на то, что белок Т-ФНО-Т при отсутствии цитотоксичности усиливает активность естественных киллерных клеток, фагоцитоз, антителопродукцию, реакции гиперчувствительности замедленного типа, дифференцировку лимфоцитов Т-хелперов, что позволяет использовать его в качестве иммуностимулирующего препарата, превосходящего ФНО, тимозин ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁ и гибридные белки Т-ФНО, ФНО-Т.

На фиг. 1 изображена схема получения рекомбинантной плазмидой ДНК рТyh325. Обозначения сайтов рестриктаз: T Eco RI, Ec Eco911, C Clal, H Hind III, K KpnI, X Xba I;

на фиг. 2 электрофореграмма в 15% ПААГ-ДСН лизатов клеток E.coli SG 20050, содержащих плазмиды: I pThy315, 2 pThy230, 3 pThy325, 4 маркеры молекулярных масс белков;

фиг. 3, 4 аминокислотная последовательность гибридного белка Т-ФНО-Т (выделена жирным шрифтом) и нуклеотидная последовательность гена, кодирующего синтез этого гибридного белка;

на фиг. 5 -7- аминокислотные последовательности белков; курсивом выделена последовательность, соответствующая тимозину, ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁, жирным шрифтом фактору некроза опухолей ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">

на фиг. 8 влияние препаратов белков на поглотительную функцию макрофагов;

на фиг. 9 влияние тимозина ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁, ФНО и гибридных белков на процесс образования антителопродуцирующих клеток.

П р и м е р 1. Плазмидные ДНК рThy315 и рТhy230 в количестве 10 мкг каждой растворяют в 100 мкл буфера, содержащего 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-НСl, рН 7,5 и 3 мМ ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058027/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-меркаптоэтанола. Добавляют по 10 ед. активности рестриктазы КрnI и Есо 91 I, инкубируют при 37^оС в течение 1 ч. После инкубации реакцию останавливают эктракцией 200 мкл смеси равных объемов фенола и хлороформа. ДНК осаждают, добавляя 1 мкл 5 М NaCl и 250 мкол 96%-ного этанола. После инкубации при 20^оС в течение 1 ч и центрифугирования 10 мин при 8000 g спирт сливают. ДНК высушивают под вакуумом и растворяют в 200 мкл буфера, содержащего 66 мМ трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ АТР и 5 мМ дитиотрейтола. Добавляют 10 ед. активности Т4 ДНК-лигазы и инкубируют 18 ч при 15^оС, 25 мкл этой смеси используют для трансформации компетентных клеток Е. coli HB 101 и выделения плазмидных ДНК, как указано выше. Плазмиды из различных клонов анализируют электрофорезом в 0,7%-ной агарозе, отмечая те, у которых подвижность больше чем у рТhy230 и меньше или равна pThy315. Проводят анализ с помощью рестриктаз Hind III, Xba I, Eco RI, Eco 91 I, Bg III, Xho I и Рst I при раздельном и совместном гидролизе в условиях, как указано выше. Отбирают варианты плазмидной ДНК, аналогичные рТhy315 с вставкой фрагмента ДНК размером 0,1 т.п.н. расположенного между Cla I и Xho I сайтами; при этом должны быть сохранены Tco 91 I, Bg III, Bam HI сайты, присутствующие в рТhy230. Схема конструирования плазмиды рТhy325 и ее рестрикционная карта показаны на фиг. 1. Выбранную указанным способом плазмиднуюб ДН рТhy325 и ДНК плазмид рТhy315 и рТhy230 трансформируют в клетки штамма E. coli SG 20050 по методике, приведенной выше. Выращенные клетки анализируют на наличие гибридного белка в 15% ПААГ-ДСН. Спектр и количество синтезируемых белков показаны на фиг. 2.

П р и м е р 2. Культивирование для получения гибридного белка Т-ФНО-Т.

Выращивают штамм E. coli SG 20050 в 5 мл LB при 37^оС в течение ночи. Разводят культуру свежим LB в 50-100 раз и растят на качалке при 37^оС до оптической плотности при 590 нм, равной 0,2-0,3. Если оптическая плотность более 0,3, культуру разводят свежим LB до 0,1 и подращивают 30 мин. Переносят 100 мл культуры в стерильную центрифужную пробирку и осаждают клетки при 4^оС 5000 g в течение 10 мин. Супернатант сливают, клетки суспендируют в 50 мл 0,1 М CaCl₂, охлажденного на льду. Инкубируют клетки 20 мин на льду. Осаждают клетки 10 мин при 5000 об/мин, 4^оС. Супернатант сливают, клетки суспендируют в 3 мл 0,1 М CaCl₂, охлажденного на льду. К компетентным клеткам можно добавить стерильный глицерин до 15% и хранить клетки для трансформации до трех месяцев при 70^оС. Переносят 3 мл компетентных клеток в холодную пробирку и добавляют 5-10 мкг плазмидной ДНК рТhy325. Инкубируют на льду 1 ч. Переносят пробирку на 42^оС 5 мин. Переносят клетки в колбу с 100 мл подогретого до 37^оС L-бульона без антибиотика и инкубируют при 37^оС 1-1,5 ч. Заполняют ферментер вместимостью 10 л L-бульоном объектом 7 л с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл. Прогревают ферментер до необходимой температуры и вносят посевную дозу 100 мл L-бульонной культуры свежеполученных трансформаторов. Культивируют при необходимой температуре, 250-300 об/мин с продувкой воздуха 0,5 л/мин на л бульона. При достижении стационарной фазы роста бульон сливают, берут пробу для определения уровня синтеза гибридного белка методом электрофореза в 15% ПААГ-ДСН. Клетки отделяют центрифугированием или микрофильтрацией и используют для выделения гибридного белка. Экспериментально определено, что при культивировании штамма SH 20050 (рТhy325) при 30^оС практически весь гибридный белок синтезируется в клетках в растворимой форме; при 37^оС около 50% в нерастворимой; при 41-42^оС около 90% гибридного белка находится в клетках в нерастворимой форме.

П р и м е р 3. Использование консервированных клеток трансформированного штамма Е. coli для культивирования и получения гибридного белка.

Трансформация штамма Е. сoli SG 20050, плазмидой и культивирование свежеполученных трансформантов проводят, как в примере 2, за исключением: а) в экспоненциальной фазе роста штамма производят отбор культуры, добавляют стерильный глицерин до 40% и хранят клетки при (-20)-(-40)^оС в течение нескольких месяцев. Доля последующих культивирований в 10 л ферментере используют в качестве посевного материала консервированные клетки трансформированного штамма. Клетки, выросшие до стационарной фазы роста, непригодны для последующих культивирований; б) для культивирования в большом объеме клетки в экспоненциальной фазе роста из 10 л ферментов используют как посевной материал для инокуляции в 100 или 250 л ферментер.

П р и м е р 4. Подбор состава питательного бульона для культивирования.

Состав использованных сред представлен в табл. 1. Культивирование проводят в колбах при 37^оС в течение 18 ч. Для засева в каждый питательный бульон используют свежеполученные трансформанты (пример 2) или консервированные клетки (пример 3). Результаты культивирований представлены в табл. 2.

Полученные данные однозначно показывают, что пептон, дрожжевой экстракт и хлористый натрий являются необходимыми и достаточными компонентами для получения биомассы клеток и синтезируемого ими гибридного белка.

Для оптимизации состава питательного бульона проведены культивирования с варьированием количества компонентов, как указано в табл. 3.

С использованием математических методов планирования экспериментов проведен расчет оптимального состава питательного бульона. Предсказанный состав и полученные результаты приведены в табл. 4.

В качестве оптимального выбран состав бульона 1 (табл. 4), обеспечивающий высокий уровень роста клеток и синтез гибридного белка и содержащий наименьшие количества компонентов. Указанный состав бульона обеспечивает также устойчивый рН в процессе культивирования, что позволяет исключить необходимость подтитровки щелочью или кислотой.

П р и м е р 5. Выделение и очистка гибридного белка Т-ФНО-Т, синтезированного в нерастворимой форме.

Клетки штамма SG 20050 с плазмидой рТhy325, выращенные до поздней фазы экспоненциального роста при 37^оС, а затем до стационарной фазы при 41^оС, осаждают центрифугированием при 6000 об/мин 4^оС, в течение 10 мин. Бульон сливают, клетки суспендируют в лизирующем буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl рН 7,5 мМ Na₂-ЭДТА и 1 мМ феноксиметилсульфонилфторида, из расчета на 1 г клеток 10 мл буфера. Клетки разрушают каким-либо способом (например, замораживанием-оттаиванием или импульсами ультразвука три раза по 40 с, или продавливанием в замороженном состоянии через фильеру French прессе или Х-прессе). Лизат центрифугируют 10 мин при 4^оС, 5000 g. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют лизирующий буфер из расчета 10 мл на 1 г клеток, интенсивно перемешивают. Повторяют центрифугирование. Супернатант сливают, осадок растворяют в 6 М мочевине того же объема. Повторяют центрифугирование. Надосадочная жидкость представляет собой раствор гибридного белка Т-ФНО-Т около 60-70%-ной электрофоретической чистоты. Полученный раствор белка хроматографируют на носителях ДЭAЭ, уравновешенных 25 мМ ацетатным буфером рН 5,8 с 7 М мочевиной. Раствор белка в 6 М мочевине титруют уксусной кислотой до рН 5,8 и наносят на колонку. Загрузка на 100 мл носителя около 50 мл раствора гибридного белка. Промывают сразу после нанесения белка равным по объему колонки 25 мМ ацетатным буфером рН 5,8 с 7 М мочевиной и 80 мМ NaCl; затем пятью объемами того же буфера, с 250 мМ NaCl собирают фракции. Аликвоты из фракций по 20 мкл анализируют электрофорезом в 15% ПААГ-ДСН. Фракции, содержащие гибридный белок, очищают хроматографией на "голубой" агарозе с привитым красителем Cibacron Blue F3GA. Носитель уравновешивают 25 мМ Na-ацетатным буфером рН 5,5 с 7 М мочевиной и 250 мМ NaCl. Фракции с ДЭАЭ объемом до 200 мл наносят на колонку с 30 мл носителя. Элюируют гибридный белок 30 мМ Na-фосфатным буфером с градиентом рН 7,0-7,8 в присутствии 0,4 М NaCl и 7 М мочевины. Получают белок не менее 95%-ной электрофоретической чистоты. Фракции, содержащие гибридный белок, диализуют при 4-8^оС в течение 18 ч против 100 объемов 150 мМ NaCl, 10 мМ Na-фосфата рН 7,2-7,4. Заменяют буфер на свежий и диализуют еще несколько часов. Белок хранят при -20^оС.

П р и м е р 6. Выделение и очистка гибридного белка Т-ФНО-Т, синтезированного в растворимой форме.

Получение лизата клеток, выращенных при 30^оС, проводят, как описано в примере 5. После центрифугирования супернатант, содержащий раствор белка Т-ФНО-Т, титруют уксусной кислотой до рН 5,8. Добавляют небольшими порциями сухой сульфат аммония до 28% насыщения. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре, центрифугируют 8000 g 10 мин. Супернатант сливают, добавляют сухой сульфат аммония до 33% насыщения (на 30 мл носителя около 100 мл белка). Промывают колонку сразу после нанесения белка 25 мМ Na-ацетатным буфером рН 5,8, а затем элюируют белок 6 М раствором мочевины в том же буфере. Фракции, содержащие гибридный белок, очищают на колонках с носителем ДЕАЕ, затем "голубой" агарозой и диализуют, как указано в примере 5.

П р и м е р 7. Проверка структуры гибридного белка Т-ФНО-Т.

Взвешивают осадок влажного белка, полученного как в примере 5, до этапа растворения в 6 М мочевине; 5-7% от него составляет масса гибридного белка. Проводят электрофорез образца гибридного белка в 15 или 17,5% ПААГ-ДСН с использованием маркеров молекулярных масс белков. Т-ФНО-Т имеет молекулярную массу по подвижности в геле около 24 кДа (фиг. 2).

Для определения выщепляемых последовательностей тимозина проводят гидролиз гибридного белка в кислоте с добавлением или без добавления бромоциана. Белок растворяют в 60% муравьиной кислоте до концентрации 5-10 мг/мл, добавляют 1/10 объема 1,1 М трифторуксусной кислоты и твердый бромоциан из расчета 1 мг на 2 мг (100 эквивалентов). Инкубируют при температуре 37-40^оС в темноте в течение 24 ч с перемешиванием. Разводят реакционную смесь 5 объемами бидистиллированной воды, упаривают на роторном испарителе до начального объема при 40^оС. Добавляют 5 объемов воды и повторяют упаривание. Добавляют равный объем бидистиллированной воды, титруют 0,1 н. NaOH до рН 5-6. Образовавшийся хлопьевидный осадок отделяют центрифугированием при 10000 g в течение 10 мин. Образцы осадка и надосадочной жидкости анализируют электрофорезом в 20% ПААГ-ДСН. Осадок содержит белок с мол.м. около 17 кДа, что соответствует молекулярной массе выщепляемого ФНО. В надосадочной жидкости находятся выщепленные пептиды с мол.м. около 3 кДа (фиг. 5-7).

Гибридный белок Т-ФНО-Т состоит из 216 аминокислотных остатков (определяется по нуклеотидной последовательности гена методом Сенгера фиг. 3, 4). Молекулярная масса гибридного белка 23782 Да. Аминокислотный состав: 19 Ala 2 Cys 3 His 2 Met 12 Thr 8 Arg 10 Gln 11 Ile 4 Phe 2 Thp 8 Asn 22 Glu 20 Leu 11 Pho 7 Tyr 13 Asp 11 Gly 14 Lys 19 Ser 18 Val Изоэлектрическая точка: рI 4,5.

П р и м е р 8. Определение иммунобиологических свойств гибридного белка.

В качестве контролей используют следующие препараты белков: фактор некроза опухолей ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> (ФНО) (изготовитель НПО "Фермент", г. Вильнюс); тимозин- ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> ₁ химически синтезированный (изготовитель ВНИИ ОЧБ, г. Санкт-Петербург).

Bлияние препаратов белков на активность макрофагов.

Для изучения влияния гибридных белков на фагоцитоз используют спектрофотометрический метод регистрации уровня поглощения длины волны возбуждения гемоглобина фагоцитируемых эритроцитов. В 96-луночные планшеты вносят клетки перитонеального экссудата. После процесса адгезии планшеты отмывают от неприлипших клеток. Клетки за 2 ч до внесения эритроцитов барана инкубируют с анализируемыми белками в дозах от 0,32 ^. 10^-6 М. По завершении реакции поглощения эритроцитов лунки отмывают от незахваченных клеток и клеточный монослой лизируют. Лизат спектрофотометрируют при длине волны 405 нм. Данные представлены в относительных единицах как отношение показателей экстинкции опытных групп к контрольной.

Результаты экспериментов по влиянию препаратов белков на поглотительную функцию магрофагов представлены на фиг. 8. Профиль влияния тимозина в зависимости от дозы на фагоцитоз показывает отсутствие выраженного эффекта. Индекс стимуляции не превышает 1,2 при дозе 0,32 ^. 10^-6 М. ФНО имеет снижающийся дозозависимый профиль активизации фагоцитоза при увеличении концентрации. Умеренное стимулирующее влияние при различных дозах оказывает гибридный белок Т-ФНО. Наиболее выраженным эффектом обладают гибриды ФНО-Т и Т-ФНО-Т; индекс стимуляции фагоцитоза при их концентрации 0,32 ^. 10^-6 М достигает 1,8-2,0, при этом нет проявления прямой дозозависимости.

Влияние препаратов белков на интенсивность антителопродукции.

Для анализа интенсивности антителопродукции мышей внутрибрюшинно иммунизируют эритроцитами барана в дозе 5 ^. 10⁷ клеток и одновременно вводят исследуемые препараты в дозах 0,32 ^. 10^-8 и 0,32 ^. 10^-7 М. После иммунизации определяют количество аителообразующих клеток (АОК) среди 10⁶ клеток селезенки.

Результаты изучения представлены на фиг. 6 в виде индекса стимуляции как отношение количеств АОК в опыте к контролю. Каждая величина представлена средним значением из трех опытов и достоверна при Р 95% Тимозин усиливает в дозозависимой форме продукцию антител (индекс стимуляции 2,01). ФНО влияет на процесс накопления АОК. Гибридные белки ФНО-Т и Т-ФНО проявляют выраженное стимулирующее влияние только при дозе 0,32 ^. 10^-7 М; индекс стимуляции 2,22 и 2,69 соответственно. Наиболее сильным стимулирующим действием обладает Т-ФНО-Т для обеих исследованных доз; индекс стимуляции 2,2 и 2,78 соответственно.

Влияние препаратов на реакцию гиперчувствительности замедленного типа.

Для изучения влияния препаратов белков на реакцию гиперчувствительности замедленного типа мышей иммунизируют эритроцитами барана с одновременным введением исследуемых белков в дозе 10⁷ М. На четвертые сутки после первичной иммунизации мышам в подушечку одной из задних лап вводят разрешающую дозу антитела. В подушечку противоположной лапы среду (контроль реакции). Через 24 ч микрометром измеряют толщину "опытной" и "контрольной" лап. Отношение величин в процентах указывает на величину реакции. Для оценки модифицирующего действия исследуемых белков используют коэффициент, представляющий собой отношение величины реакции в опытной группе (получавшей белок) к контрольной группе (белок не вводят).

Результаты исследования влияния препаратов на реакцию ГЗТ суммированы в табл. 5.

Из полученных результатов видно, что препараты ФНО, ФНО-Т тимозина ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁ не оказывают какого-либо влияния на интенсивность реакции ГЗТ; более того, гибридный белок Т-ФНО даже несколько ее снижает. В тоже время белок Т-ФНО-Т значительно, до 70% усиливает ответ.

Влияние препаратов белков на активность естественных киллерных клеток.

Активность естественных киллерных клеток (ЕКК) определяют у мышей линии СВА (18-20 г). Животным за три дня до выделения клеток вводят анализируемые препараты белков в дозе 5 ^. 10^-8 М. В качестве мишеней цитотоксической активности ЕКК используют клетки миелолимфомы мыши Jack-1, меченные 3Н-уридином. Спленоциты мышей и клетки-мишени берут в соотношении 25:1 и 50:1. Смесь клеток инкубируют 4 ч, отмывают и переносят на фильтры для счета импульсов в 1 мин (срm). Цитотоксический индекс рассчитывают по формуле

Ц.И ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058390/2058390t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">100% где срmK счет контрольных лунок с опухолевыми клетками-мишенями;

срm 0 счет опытных лунок с опухолевыми клетками-мишенями и спленоцитами.

О влиянии препаратов на активность ЕКК судят по коэффициенту активности как отношения показателя ЕКК в опыте (введение препарата) к контролю (препарат не вводят). Данные суммированы в табл. 6.

Результаты показывают, что препараты белков, за исключением ФНО-Т и Т-ФНО-Т, не оказывают влияния на проявление киллерного действия ЕКК. ФНО-Т обеспечивает усилие только при большей дозе эффекторов. В то же время Т-ФНО-Т значительно усиливает функциональную активность киллеров при различных соотношениях эффектор мишень.

Влияние препаратов белков на процессы дифференцировки лимфоцитов.

Изучение влияния препаратов белков на процессы дифференцировки лимфоцитов проводят по трем антигенам Т-лимфоцитов антиген I-го класса главного комплекса гистосовместимости мышей Н-2К, рецепторы СD4 (маркер Т-хелперов) и CD8 (маркер Т-киллеров). После инкубации клеток тимуса с соответствующим препаратом белка вносят моноклональные антитела: анти-Н-2К, анти-13Т4 (анти-CD4) или анти-Lyt 2 (анти-CD8). Уровень связывания моноклональных антител выявляют кроличьими антителами к IgG мыши, меченными пероксидазой. Реакцию с субстратом оценивают по оптической плотности при длине волны 492 нм. Эффективность реакции рассчитывают как отношение экстинкции опытных групп к контрольным за вычетом фона (сорбция кроличьих антител), меченных пероксидазой, на интактных клетках). Индекс стимуляции рассчитывают по формуле

И. С ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058390/2058390-2t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> где D_o оптическая плотность в опыте при добавлении препарата белка, моноклональных и меченных антител;

D_ф оптическая плотность без добавления моноклональных антител;

D_к оптическая плотность без добавления препарата белка.

Результаты, полученные при исследовании процессов дефференцировки лимфоцитов с использованием моноклональных антител, представлены в табл. 7.

Все препараты в зависимости от дозы усиливают в разной степени экспрессию антигена Н-2К. Так тимозин ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁, использованный в данном случае в качестве контроля, демонстрирует известный факт усиления клеточной экспрессии антигена Н-2К, проявляя себя как фактор дифференцировки тимоцитов. ФНО (второй положительный контpоль) усиливает экспрессию данного антигена при небольших дозах и слабо снижает его представительство на клетках при использовании больших концентраций. В то же время ФНО-Т за исключением самой низкой дозы увеличивает экспрессию антигена Н-2К в дозозависимой форме, близкой к тимозину ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">_1.Гибридный белок Т-ФНО способен усиливать экспрессию при использовании всех проверенных доз. Наибольший эффект усиления экспресс антигена Н-2К во всех дозах наблюдается при использовании гибридного белка Т-ФНО-Т.

Анализ экспрессии маркера дифференцировки Т-хелперов CD4 под действием препаратов белков показал, что тимозин ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁ усиливает его экспрессию в дозах 5 ^.10^-12 5 ^. 10^-10 М. ФНО увеличивает его уровень при меньшей и снижает при большей дозе. ФНО-Т и Т-ФНО оказывают незначительное влияние на выражение этого антигена. Гибрид Т-ФНО-Т наиболее значительное усиление выражения CD4 проявляет в дозе 5 ^. 10^-14М (почти в 2 раза), при этом большие дозы не оказывают воздействия. Препараты белков способны обеспечить дифференцировку тимоцитов по линии созревания Т-хелперов. Причем, эта активность наиболее выражена у тимозина ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">₁ и гибридного белка Т-ФНО-Т.

Анализ экспрессии CD8-маркера Т-лимфоцитов киллеров установил некоторое увеличение его экспрессии под влиянием тимозина ₁ -тимозин- -фактор некроза опухолей- тимозин a₁, способ получения гибридного полипептида, обладающего активностью ₁ - тимозин- -фактор некроза-опухолей - тимозин a₁ , рекомбинантная плазмидная днк pthy, экспрессирующая гибридный полипептид, обладающая активностью ₁ - тимозин фактор некроза опухолей - тимозин- a₁, патент № 2058390" SRC="/images/patents/414/2058022/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">_1, ФНО обеспечивает увеличение представительства CD8 только при низкой дозе 5 ^. 10^-14 М. Гибридные белки Т-ФНО и ФНО-Т проявляют умеренное стимулирующее действие на выражение этого маркера. Отличающимися являются результаты, полученные при использовании Т-ФНО-Т; ни одна из исследованных доз не вызывает увеличение уровня CD8. Напротив, более высокие дозы даже подавляют экспрессию СD8. Цитотоксичность белков для клеток L929 приведена в табл. 8.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что гибридный белок Т-ФНО сохраняет полную цитотоксическую активность, присущую ФНО, и присоединение последовательности тимозина на N-конец ФНО не влияет на его функции. Присоединение последовательности тимозина на С-конец ФНО приводит к снижению его активности в 10 раз. Однако две присоединенные последовательности тимозина на оба конца ФНО в белке Т-ФНО-Т лишают его цитотоксичности.

Пролиферативная активность белков.

Результаты исследований, представленные в табл. 9, свидетельствуют о том, что ФНО в дозе 1 мкг ингибируют пролиферацию на 34% Гибридные белки Т-ФНО и ФНО-Т в дозе 1 мкг усиливают пролиферацию примерно в 4 раза, а Т-ФНО-Т в 5-6 раз, при этом меньшие дозы гибридных белков не оказывают существенного влияния.