способ получения кратномеченных тритием по двойным связям полииновых жирных кислот

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КРАТНОМЕЧЕННЫХ ТРИТИЕМ ПО ДВОЙНЫМ СВЯЗЯМ ПОЛИИНОВЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ путем конденсации моно- или полииновых алкилгалогенидов пропаргильного типа с металлсодержащими производными по концевой ацетиленовой группе и гидрирования тритием в присутствии катализатора полученных соответствующих эфиров полииновых кислот, отличающийся тем, что в качестве металлсодержащего производного используют соединения, получаемые взаимодействием алкильных эфиров алкиновых кислот с CuCl в присутствии K₂CO₃ и KI, и процесс конденсации проводят при 20 - 25^oС, а после гидрирования тритием проводят гидролиз эфиров полииновых кислот с образованием целевого продукта.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к химии природных и физиологически активных веществ, в частности к способам получения кратномеченных тритием по двойным связям полиеновых жирных кислот, и может найти применение в экспериментальной биологии, ветеринарии, медицине.

Метаболиты полиеновых кислот (простагландины, тромбоксаны, лейкотриены, гепоксилины, липоксины и т.п.) играют ключевую роль в регуляторных механизмах живой клетки. Среди них наименее изучены эйкозаноиды производные эйкозановых кислот, выполняющие важные биологические функции в жизнедеятельности организма, являющиеся медиаторами аллергических и воспалительных процессов. Для детального изучения их биологической роли необходима разработка чувствительных методов их определения в биологическом материале. Наиболее приемлемыми для этой цели являются иммуно-ферментный и радиоимунный методы анализа, при реализации которых необходимо располагать меченными тритием полиеновыми кислотами, из которых можно получить их [³H]-метаболиты.

Известен способ получения кратномеченных тритием по двойным связям полиеновых жирных кислот путем обработки газообразным тритием эфиров соответствующих полиеновых кислот с последующим гидролизом эфирной группы. Эфиры полиеновых кислот получают по данному известному способу конденсацией галоидных алкадиинов с магнийбромпроизводными по концевой ацетиленовой группе ацетиленовых жирных кислот. Конденсацию проводят в тетрагидрофуране в течение 20 ч, при 50^оС с выходом 48% Продукт конденсации обрабатывают смесью водорода и трития, полученный меченный тритием продукт металируют, подвергают хроматографической очистке и омылению эфирной группы с выходом 85% Общий выход [³H]-полиеновых кислот составляет 41% [1, 2, 3]

Недостатками данного известного способа являются:

сложность технологического процесса на стадии конденсации: длительность этой стадии (20 ч) и достаточно высокая температура (50^оС);

низкий выход целевого продукта (41%).

Известен способ получения кратномеченных тритием метиловых эфиров полиеновых кислот селективным гидрированием тритием метиловых эфиров полииновых кислот с выходами 95-98% [4] Сами же полииновые кислоты по этому способу получают с выходом 48% конденсацией полииновых пропаргильных галогенидов с магнийгалоидпроизводными по концевой ацетиленовой группе гексиновой кислоты. Полученные полииновые кислоты метилируют диазометаном в диэтиловом эфире в течение 5 мин в атмосфере аргона. Выход на двух стадиях (гидрирования и гидролиза) [³H]-полиеновых кислот составляет 71-73%

Данный известный способ имеет недостатки: многостадийность дополнительное переведение полииновых кислот в их метиловые эфиры; низкий общий выход кратномеченных тритием полиеновых кислот (71-73%).

Целью изобретения является повышение выхода, упрощение и ускорение процесса.

Цель достигается тем, что в способе получения кратномеченных тритием по двойным связям полиеновых жирных кислот путем обработки газообразным тритием эфиров соответствующих полииновых кислот с последующим гидролизом эфирной группы, включающем получение полииновых кислот конденсацией моно- или полииновых алкилгалогенидов пропаргильного типа с производными по концевой ацетиленовой группе моно- или полииновых жирных кислот, отличительной особенностью является то, что в качестве производных используют купраты, которые получают из эфиров моно- и полииновых жирных кислот с концевой ацетиленовой группой, а процесс конденсации ведут при 20-25^оС.

Было установлено, что при использовании купратов в качестве производных по концевой ацетиленовой группе ненасыщенных жирных кислот вместо магнийбромпроизводных, используемых в известном способе 5, выход продуктов конденсации повышается с 48 до 91% При этом использование в процессе конденсации не свободных ненасыщенных жирных кислот, а их эфиров позволяет сразу получить эфир полииновой жирной кислоты, в то время как по известному способу [4] получают свободные полииновые кислоты. Для проведения процесса гидрирования газообразным тритием полииновые кислоты должны использоваться в виде их эфиров и поэтому после проведения реакции конденсации по известному способу [4] необходимо проводить дополнительно реакцию этерификации продуктов конденсации, что усложняет процесс, приводит к снижению выхода целевого продукта.

П р и м е р 1. К смеси 0,64 г CuCl, 0,123 г K₂CO₃ и 0,150 г KI в 10 мл диметилформамида добавляют 0,083 г метилового эфира гексиновой кислоты. Через 5 мин к раствору образовавшегося купрата добавляют соответствующий алкилгалогенид:

0,105 1-бром-2, 5, 8, 11-тетрадекатетраина или 0,145 г 1-бром-2, 5, 8-тетрадекатриина, 0,130 г 1-хлор-2, 5-тетрадекадиина.

Смесь выдерживают при 20-25^оС в течение 2-2,5 ч, затем добавляют 50 мл воды. Продукт конденсации экстрагируют эфиром (трижды по 20 мл), сушат безводным Na₂SO₄, растворитель отгоняют, хроматографируют на колонке высотой 150 мм объемом 10 мл с силикагелем 40/100 мл, элюент:смесь бензол-эфир (4: 1). После хроматографической очистки получают с выходом 90-91% метиловые эфиры эйкозаполииновых кислот, соответственно метиловый эфир эйкозапентаиновой кислоты или метиловый эфир эйкозатетраиновой кислоты; или метиловый эфир эйкозатрииновой кислоты.

5 мг метилового эфира соответствующей полученной полииновой кислоты растворяют в 0,5 мл смеси пентан диоксан (4:1), раствор переносят в ампулу объемом 7,0 мл и помещают туда 15 мг палладиевого катализатора и магнитную мешалку. Содержимое ампул замораживают жидким азотом и вакуумируют до давления 1-10 Па. Затем ампулу заполняют тритием до давления 400 гПа, нагревают до комнатной температуры и перемешивают в течение 30 мин. Ампулу вновь замораживают жидким азотом и удаляют избыточный тритий вакуумированием. Катализатор удаляют фильтрованием реакционной смеси через 100 мг силикагеля Л (Чехословакия) 100-160 мкм. Элюируют бензолом (2 мл). Лабильный тритий удаляют трехкратным упариванием меченого продукта, растворенного в 2 мл метанола при пониженном давлении. Препаративную очистку осуществляют методом ВЭЖХ, хроматограф "Gilson" (Франция), колонка 4,6 х 250 мл, фаза Servachrom Octadecye Si 100. Продукты реакции растворяют в 0,2 мл смеси метанол-вода 4:1, заводят на колонку и элюируют 85%-ным водным метанолом, скорость потока 1 мл/мин, детекция по радиоактивности. Время удерживания: 9,3 мин (метиловый эфир тимнодоновой кислоты), 12,7 мин (метиловый эфир арахидоновой кислоты), и 17,6 мин (метиловый эфир 5Z,8Z,11Z-эйкозатриеновой кислоты). Анализ метиловых эфиров на всех стадиях получения и очистки меченного препарата проводили методом ГЖХ на хроматографе Chrom 5, колонка 3 х 1200 мл, фаза Silor 10 С, носитель Chromosorb W-AW, 100-120 мин, азот, 20 мл/мин, в программе: 200^оС (6 мин) в градиенте 10^оС/мин до 240^оС и при 240^оС 10 мин. Выход [³H] -метиловых эфиров полиеновых кислот 96% в расчете на полиеновые кислоты.

Гидролиз метиловых эфиров до свободных кислот осуществляют щелочным гидролизом в 5 мл смеси диоксан метанол водный 1 н. раствор КОН (1:1:1) в атмосфере аргона в течение 6 ч. Выходы меченных свободных кислот составляют 95-98% Полученные меченные тритием полиеновые кислоты имеют следующие характеристики (установлено на образцах, полученных при гидрировании водородом):

5Z, 8Z, 11Z,14Z,17Z-эйкозапентаеновая кислота (тимнодоновая кислота n_D²⁰ 1,4945

ИК-спектр ( , см): 3600-2380, 1715 (СООН); 33010, 1600 (СН=СН).

ПМР-спектр ( , м.д.): 0,98 (т, 3Н, СН₃); 1,65 (м, 2Н, СН₂ССОО); 2,82 (м, 8Н, С=ССН₂С=С); 5,30 (м, 10Н, СН=СН, J 3 Гц).

Молярная радиоактивность меченной тритием эйкозапентаеновой кислоты составляет 1,0-1,5 ПБк/моль в расчете на одну двойную связь.

5Z, 8Z, 11Z, 14Z-эйкозатетраеновая кислота (арахидоновая кислота); n_D²⁰ 1,4855.

ИК-спектр (, см): 3600-2400, 1715 (СООН); 3010, 1600 (СН=СН).

ПМР-спектр ( , м.д.): 0,88 (т, 3Н, СН₃); 1,29 (м, 6Н, СН₂); 1,78 (м, 2Н, СН₂ССОО); 2,0 (м, 4Н, СН₂С=С); 2,30 (т, 2Н, СН₂СОО); 2,75 (м, 6Н, С= ССН₂С=С); 5,30 (м, 8Н, СН=СН), 54 Гц).

Молярная радиоактивность меченной тритием эйкозатетраеновой кислоты составляет 1,0-1,5 ПБк/моль в расчете на одну двойную связь.

5Z,8Z,11Z-эйкозатриеновая кислота: n_D²⁰ 1,4761.

ИК-спектр ( , см^-1): 1716 (СО₂^-), 2270, 2195 (С=С).

ПМР-спектр ( , м.д.): 0,85 (т, 3Н, СН₃); 1,26 (м, 14Н, СН₂); 2,05 (т, 4Н, СН₂С=С); 2,31 (т, 2Н, СН₂СОО); 2,78 (т, 4Н, С=ССН₂С=С); 5,23 (м, 6Н, СН= СН, J 4 Гц). Молярная радиоактивность меченной тритием эйкозатриеновой кислоты составляет 1,0-1,5 ПБк/моль в расчете на одну двойную связь.

П р и м е р 2. Провели сопоставление известного и нового способов. Результаты приведены в табл. 1 и свидетельствуют о преимуществе нового способа.

П р и м е р 3. Изучили влияние условий на протекание процесса конденсации по новому способу на общий выход меченных тритием полиеновых кислот. Результаты приведены в табл. 2 и свидетельствуют о том, что максимальный выход получают при выдерживании реакционной смеси при 20-25^оС в течение 2-2,5 ч.