консервирующая жидкость для трансплантантов

Формула изобретения

КОНСЕРВИРУЮЩАЯ ЖИДКОСТЬ ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАНТОВ, отличающаяся тем, что включает амниотическую жидкость, солкосерил и трасиол при следующих соотношениях компонентов :

Солкосерил - 0,8 мл

Трасилол - 40,000 К1Е

Амниотическая жидкость - 200 мл.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантологии, и может быть использовано в клинической и экспериментальной медицине для консервации органов и тканей без их предварительной перфузии, а также для перфузии органов с целью очищения их сосудистого русла от остатков крови с последующей консервацией и пересадкой.

Трансплантология постоянно испытывает большие трудности в связи с дефицитом донорских органов и сохранением их жизнеспособности, обусловленной несовершенством консервирующих сред.

Из всех существующих к настоящему времени консервирующих сред лучшей является "Евроколлинз", хотя широкое распространение имеет среда 199, которая используется в микробиологии, экспериментальной хирургии и биологии.

Среда 199 предложена в 1950 г. Morgan c cоавт. Среда 199 имеет чрезвычайно сложный состав, в нее входят аминокислоты, комплекс витаминов, липоиды, компоненты нуклеиновых кислот, глюкоза, альфа-глутатион, альфа-гуламин и т. д. (Анджапаридзе О.Г. и соавт. 1962, с.28-30). Наиболее широко применяется для культивирования различных тканей. Приготовление среды 199 трудоемкое и дорогостоящее.

В центрах трансплантации всего мира для перфузии и временной консервации пересаживаемого органа хирургии применяют раствор "Евроколлинз". Он сохраняет жизнеспособность сердца, печени, почек и других органов на период от их изъятия у донора до включения в кровоток уже в организме реципиента (Шумаков В. И. и соавт. 1991). Имеются указания и на другие консервирующие среды без их рецептуры и характеристик (Лопухин Ю.М. 1978, Лопаткин Н.А. Лопухин Ю.М. 1989). Раствор "Евроколлинз" в своей основе состоит из уравновешенных по электролитному составу с внутриклеточной жидкостью компонентов. В него входят: калий фосфорнокислый однозамещенный 2,05 г/л; калий фосфорнокислый двузамещенный 7,4 г/л, калия хлорид 1,12 г/л, натрия гидрокарбонат 0,8; глюкоза 35,0 г/л; вода дистиллированная 1000,0.

Авторы поставили задачу создание консервирующего раствора не уступающего по своим качествам среде 199 и раствору "Евроколлинз", главные преимущества которого должны заключаться в том, что свойства консерванта будут максимально приближены к природным.

Существенным отличием предлагаемого изобретения является применение амниотической жидкости рожениц с добавлением в нее солкосарила и трасилола.

Преимущества амниотической жидкости (АЖ) человека по сравнению со средой 199 и раствором "Евроколлинз" придают ее следующие основные свойства: 1) оптимальная близость по биохимическому составу к плазме крови человека; 2) ее значительная антибактериальная активность; 3) иммуносупрессивные свойства; 4) высокое содержание кислорода.

Солкосерил депротеинезированный гемодиализат из крови телят. В его состав входят органические вещества низкого молекулярного веса, а также неорганические вещества. Этот препарат ускоряет поглощение и утилизацию кислорода, а также глюкозы клетками увеличивает резервы АТФ. Основным показанием к его применению служит нарушение циркуляции как артерального, так и венозного кровотока, а также их осложнения (гипоксия со всеми последствиями). Переносимость даже больших доз солкосерила хорошая ("Вадемекун") проспект, Солко Базель АГ, Бирсфельден Базель, 1987 г. Кроме того, было показано (Гавриленко Г.А. и соавт. 1985; Гавриленко Г.А. и соавт. 1991), что солкосерил обладает заметной антиоксидантной активностью.

Трасилол основной ингибитор протеаз. Получил широкое распространение не только при лечении панкреатита, но и при лечении инфаркта миокарда, тиреотоксического криза, шока, перитонита.

Характеристика и испытания АК-90А.

Обширная научная литература по составу АК свидетельствует о том, что она обладает оптимальным электролитным составом, значения ее pH находятся в пределах значений pH плазмы крови, кроме того она обладает иммуносупрессивными свойствами, содержит биологически активные вещества, стерильна, обладает антимикробными свойствами; напряжение в ней кислорода выше, чем в крови плода (Анкирская А.Р. 1985; Волкова А.С. 1980; Емельянова А.И. и соавт. 1982; Паллади Г.А. Карку Г.А. 1972, 1974; Савельева Г.М. Федорова К.В. 1984; Федорова М.В. Быкова Г.Ф. 1982).

Нами использована АЖ женщин в возрасте 15-36 лет. Всем проведено общеклиническое, лабораторное и акушерское обследование. Среди обследованных женщин не было больных вирусным гепатитом, сифилисом, ВИЧ-инфицированных.

По данным биохимических исследований (общий билирубин сыворотки крови и его фракции, активность АЛТ, АСТ, мочевина, креатинин) основные функции печени и почек не были нарушены. До вмешательства были исключены воспалительные заболевания гениталий и экстрагенитальная патология.

Амниотическую жидкость брали в стерильных условиях тонкой стерильной иглой путем пункции плодного пузыря. В стерильный флакон одномоментно забирали 150-200 мл АЖ. Производили забор АЖ в пробирку для определения стерильности, флакон с АЖ закрывали стерильной пробкой и ставили в камеру бытового холодильника с температурой +4^оС. Центрифугирования и выделения супернатанта перед хранением не проводили. Через 4 недели хранения АЖ отправляли в бактериологическую лабораторию на посев.

Одновременно с забором АЖ на посев сразу после пункции плодного пузыря 4,0 мл жидкости брали для исследования в ней диеновых коньюгатов (ДН) и малонового диальдегида (МДА). Концентрацию ДК и АЖ определяли по методике И.Д. Стальной (1977).

Посев АЖ на стерильность через 1 мес. хранения производили в бактериологической лаборатории с рассевом АЖ по 0,1 мл на плотные питательные среды. Использовали кровяной агар и среду Эндо. Посевы инкубировали при температуре 37^оС и просматривали ежедневно.

Окончательный вариант приготовленного раствора АЖ-90А представляет из себя следующее: 200 мл стерильной отцентрифугированной АЖ (10 мин, 3000 об/мин), куда добавлено солкосеила 0,8 мл и 40000 КIE трасилола. Расчет дозы солкосерила и трасилола производили по формуле

Д

где Д доза лекарства в 200 мл, АЖ-90А, Д₁ максимальная разовая доза лекарства, вводимого внутривенно; 5000-5000 мл циркулирующей крови в организме человека с массой 70-80 кг.

Экспериментальный раздел выполнен на беспородных белых крысах-самцах массой 3000 20 г. Животным производили декапитацию кусочки ткани сердца, печени и почки брали остро заточенным конхотомом. Это позволяло иметь биоптаты равного объема с незначительной травматизацией тканей. Изъятые кусочки отмывали в соответствующей жидкости, после чего каждый погружали в бюкс емкостью 5 мл и держали в холодильной камере при температуре +4^оС. Окончательным сроком хранения было 3 сут. Кусочки одновременно изымали из бюкса с соответствующей жидкостью (табл.1).

Перфузию органов (эксперимент 4) проводили после скрытия грудной и брюшной полостей и канюлирования левого желудочка сердца. К канюле подключали посредством переходной эластичной трубки 20 мл шприц с перфузионной жидкостью. Перфузию начинали после скрытия бедренной вены и проводили до остановки сердца и просветления паренхимы печени и почек.

Методы оценки жизнеспособности тканей весьма разнообразны, также как и способы консервации. Так, сравнивая эффективность перфузионной консервации работающего на специальном стенде сердца, И.В. Ступин и соавт. (1978) нашли, что уже через 3 ч после начала перфузии, как солевым раствором, так и средой 199, 50% разведенной кровью, криоприципитатной плазмой происходят значительные измерения функции миокарда. При этом отмечены некоторые преимущества среды 199 (Лопухин Ю.М. 1978). При бесперфузионной жидкостной консервации органов в условиях гипотермии "достоверную жизнеспособность органов" констатировали на сроках от 3 до 36 ч. Бесперфузионная газовая консервация обеспечивала жизнеспособность от 3 до 46 ч (там же). Достоверная жизнеспособность при перфузионной нормотермической консервации достигнута в интервале от 3 до 12 ч (Биленко М.В. и др. 1966).

Способы оценки жизнеспособности также весьма разнообразны: от электронно-микроскопического контроля до определения качества работы органа (чисто функциональная оценка) на стенде (Лопухин Ю.М. 1978).

Нами применен простой, но достаточной информативный метод оценки переживаемости тканей морфологический контроль с морфометрическим анализом.

Материал фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина. Обезвоживание и уплотнение производили в спиртах возрастающей крепости и заливали в смесь парафина и воска (соотношение 9:1). Парафиновые срезы толщиной 5-6 микрометров окрашивали гематоксилином Майера и эощином. Проводили морфологический и морфометрический анализ структур изучаемых органов.

Всего морфологическое исследование проведено на 66 биоптатах.

Результаты исследования и их обсуждение.

Хранение набранной в стерильных условиях в стерильную посуду АЖ в бытовом холодильнике при температуре +4^оС в течение месяца без добавления в нее каких-либо антибактериальных лекарственных веществ показало полную ее стерильность. Во всех 48 случаях посевы АЖ в бактериологической лаборатории не дали роста микрофлоры. Это позволило еще раз убедиться в том, что АЖ обладает антибактериальной активностью.

Определение содержания в АЖ ДК и МДА выявило в целом довольно однообразные показатели их концентрации в этой среде. Наиболее существенным оказалось значительно меньшая их концентрация в АЖ по сравнению с содержанием в плазме крови здоровых людей. Так, концентрация МДА в плазме 49 здоровых людей (доноров) составляла в среднем 2,24 0,01 нмоль/мл. В АЖ концентрация МДА достигала лишь 1,74 0,005 кд. опт. плотности, в АЖ 1,14 0,14 ед.опт. плотности. Вместе с тем, у отдельных женщин были обнаружены концентрации ДК и МДА в АЖ значительно превышающие средние показатели. Нам не удалось связать эти отклонения с какими-либо клиническими или биохимическими проявлениями какого-то заболевания. Да и заболеваний, как следует из анализа историй болезни, у них не было. Возможно, подобные всплески (до 3,82 и 5,27 нмоль/мл) содержание МДА и ДК (до 4,76 и 3,68 ед, опт.плотности) следует объяснять различной стрессовой реакцией.

Однако, определив высокие уровни ДК и МДА в АЖ, мы исключили подобные случаи из эксперимента, а брали в опыт АЖ от тех женщин, у которых концентрация МДА и ДК были минимальными.

Морфологические изменения в органах после консервации.

Печень.

При использовании среды 199 и раствора "Евроколлинз" без предварительной перфузии на всех стадиях инкубации отмечается пикноз ядер гепатоцитов, вакуолизации цитоплазмы, ее "осыпание". В центральной части долек появляются оксифильные клетки, что свидетельствуют о паранекротических процессах. Периферические участки при этом сохраняют базофильную окраску цитоплазмы гепатоцитов. В синусоидных капиллярах отмечаются явления стаза форменных элементов крови.

Наряду с гибнущими и паранекротически измененными гепатоцитами наблюдаются сохранные клетки, содержащие в своей цитоплазме гранулы липофуоцина. Структурный гетероморфизм гепатоцитов нарастает к третьим суткам инкубации.

В целом, однако, исследованные фрагменты печени не утрачивают структурной организации своих стромальных и паренхиматозных элементов. В этом варианте экспериментов несколько более благоприятный эффект на сохранность тканей печени оказала среда "Евроколлинз" (табл.2).

Почки.

Установлено, что основные структурные компоненты коркового и мозгового вещества почки сохраняются во все сроки наблюдения. Общими морфологическими признаками реактивных изменений этого органа были следующие: резкое расширение полостей капсул Шумлянского-Боумена, разрушение щеточной каемки проксимальных отделов нефрона. Локальная десквамация нефроцитов, особенно на стадии 3 сут инкубации, когда значительно увеличивалось число клеток с признаками кариопикноза и кариорексиса. Сравнительный анализ по трем используемым средам показал, что среда "Евоколлинз" относительно лучше воздействовала на сохранность структур почки (табл.2). Жидкость А-90 и среде 199 оказали близкий эффект. Эти два консерванта в данном варианте эксперимента не обеспечивают сохранности большей части гломерул и извитых канальцев на стадиях двух и трех суток. Неблагоприятным фактором при этом является мозаичный процесс разрушения сосулистых клубочков, а также канальцевых отделов нефронов через трое суток во всех наблюдениях.

Сердце.

Здесь особых различий в действии испытанных консервантов обнаружено не было. Отмечен выраженный пикноз ядер кардиомиоцитов, просветление цитоплазмы в парануклеарной зоне за счет разрушения миофибрилл. Характерным также является отек интеротициальной ткани и инфильтрация ее лейкоцитами. К трем суткам исчезает поперечная исчерченность клеток, увеличивается число пикноморфных кардиомиоцитов.

Результаты этой серии экспериментов позволили сделать заключение о том, что среда "Евроколлинз" оказывает более благоприятное воздействие на сохранность гистоструктур печени и почек нежели среды 1099 и АЖ-90А. Хотя и в случае использования среды "Евроколлинз", явления структурных повреждений клеточных и тканевых элементов имели место. Изменения гистоструктуры сердца после консервации в трех средах не выявили сколько-нибудь достоверных различий при тщательном морфометрическом контроле.

Заметное превосходство раствора АЖ-90А над двумя другими выявлены при условии консервации тканей указанных органов после предварительной кратковременной изотермической перфузии этих органов предлагаемым раствором.

Морфометрические данные представлены в табл.2.

Таким образом, анализ проведенного экспериментального сопоставления консервирующих качеств среды 199, раствора "Евроколлинз" и амнистической жидкости человека с добавлением в нее трасилола и солкосерила (АЖ-90А) показал их сходные качества, а в отдельных проявлениях консервирующие свойства АЖ-90А превосходили таковые среды 199 и "Евроколлинз". Консервация этих же органов при таких же условиях, но после кратковременной перфузии раствором АЖ-90А значительно улучшали морфометрические показатели переживаемости органов (тканей) в течение 3 сут при температуре +4^оС.

Получаемая консервирующая жидкость не требует специальных затрат.

Появляется возможность расширения ассортимента консервирующих сред, причем предлагаемая по качеству превосходит известные растворы, по цене она дешевле. Возможно приготовление АЖ-90А в достаточно больших количествах с небольшими экономическими затратами.