вектор pel 5b, предназначенный для экспрессии чужеродной днк

Формула изобретения

ВЕКТОР PEL 5b, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК, размером 6,4 т.п.о. содержащий Xba1 Xba1-фрагмент плазмидной ДНК бактериального вектора pEX2 размером 5,8 т.п.о. со слитным cro lacZ-геном, кодирующим белок под контролем промотора P_R бактериофага лямбда, полилинкер в 3" - конце lacZ-гена; BamH1 BamH1-фрагмент ДНК плазмиды PLysS, с ген лизоцима бактериофага Т4 размером 0,6 т.п.о. уникальные сайты рестрикции для клонирования ДНК на 3"-конце гена lacZ: EcoR1, Sma1, BamH1, Sal1, Pst1; - оператор O_R и промотор P_R бактериофага лямбда; терминаторы транскрипции фага fd; генетический маркер устойчивость к ампициллину; - спектр хозяев бактерии Escheri chia coli, с геном clts 857 бактериофага лямбда.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, генетической инженерии и может быть использовано для получения плазмид, синтезирующих рекомбинантные белки.

Большие количества рекомбинантных белков можно синтезировать в клетках Escherichia coli, несущих системы экспрессии рекомбинантных белков на основе промотора фага лямбда. Транскрипция в таких системах регулируется связыванием температурочувствительного репрессора фага лямбда, кодируемого мутантным геном clts857, с операторным участком. Когда клетки растут при температуре 30-32^оС, репрессор связывается с оператором и блокирует экспрессию. При повышении температуры роста до 42^оС репрессор инактивируется, что позволяет РНК-полимеразе связываться с промотором и начать транскрипцию гена. В результате интенсивной транскрипции и последующей трансляции могут синтезироваться значительные количества белка.

Известны рекомбинантные плазмидные ДНК pEX1,pEX2 и pEX3, позволяющие экспрессировать рекомбинантные белки во всех трех рамках считывания. Последовательности ДНК для экспрессии можно вставить в полилинкер, расположенный в 3"-конце гена lacZ. В указанных плазмидах P_R промотор бактериофага лямбда обеспечивает экспрессию последовательностей ДНК, и продукт составляет значительную часть суммарного бактериального белка. Экспрессируемый белок в клетке накапливается в виде водонерастворимых аггломератов. Однако у этих векторов есть недостаток: для выделения водонерастворимых аггломератов рекомбинантного белка необходимо разрушать клеточную стенку бактерии.

Вектор pEX2 выбран в качестве прототипа для получения вектора pEL5b. Преимущество заявленного вектора pEL5b заключается в том, что в результате использования оперона, состоящего из гена, кодирующего рекомбинантный белок, и гена лизоцима одновременно с синтезом рекомбинантного белка идет синтез лизоцима, разрушающего полисахаридную оболочку E.coli, что существенно упрощает очистку водонерастворимых аггломератов рекомбинантного белка.

Сущность изобретения состоит в том, что сконструирован вектор pEL5b размером 6,4 тысячи пар оснований (т.п.о.), состоящий из следующих элементов.

Xba1-Xba1- фрагмента плазмидной ДНК бактериального вектора pEX2 размером 5,8 т. п. о. который содержит слитный cro-lacZ ген, кодирущий слитный белок под контролем промотора P_R бактериофага лямбда, полилинкер в 3"-конце lacZ-гена:

BamH1-BamH1- фрагмента ДНК плазмиды pLysS, содержащего ген лизоцима бактериофага Т4 и имеющего размер 0,6 т.п.о.

Для конструирования плазмиды pEL5b ДНК плазмиды pEX2 гидролизуют рестриктазой XbaI и достраивают по три нуклеотида в липких концах с помощью ДНК-полимеразы PollK. Параллельно получают BamH1 рестрикт размером 0,6 т.п. о. из плазмиды pLysS, содержащий ген лизоцима бактериофага Т4 и имеющий три достроенных с помощью PollK нуклеотида в липких концах. Фрагмент pEX2 лигируют с фрагментом ДНК, содержащим ген лизоцима бактериофага Т4. Лигазной смесью трансформируют клетки E.coli, содержащие в хромосоме температурочувствительный ген бактериофага лямбда clts857, например клетки штамма PLT90. Трансформанты высевают на среду с ампициллином при 30^оС. Клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды с геном лизоцима в нужной ориентации, отбирают с помощью анализа на способность к лизису после индукции синтеза белка. Экспрессию рекомбинантных белков индуцируют повышением температуры до 42^оС. В клонах, продуцирующих лизоцим, после индукции белкового синтеза и последующего добавления хлороформа, происходит лизис клеток. Из отобранных клонов стандартными способами выделяют плазмиду pEL5b. Векторная ДНК стабильна при хранении в 10 мМ трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА при -20^оС.

П р и м е р 1. Получение векторной плазмиды pEL5b с оперонной системой экспрессии и лизиса.

Клетки бактерий E.coli PLT90, содержащие плазмиду pEX2, выращивают в 50 мл бульона 2YT (16 г триптона, 10 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl на 1 л воды), содержащего 100 мкг/мл ампицллина до титра 10⁹ кл/мл.

Клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 2 мл раствора (50 мМ глюкозы, 25 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 5 мг/мл лизоцима) и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. Далее добавляют 4 мл раствора 0,2 М NaOH, 1% -ного додецилсульфата натрия, перемешивают, инкубируют 10 мин во льду, добавляют 3 мл охлажденного 5 М раствора ацетата калия, рН 4,8, перемешивают, оставляют на 10 мин во льду, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием. К надосадочной жидкости добавляют 0,6 объема изопропилового спирта и выдерживают 15 мин при комнатной температуре. Осадок собирают центрифугированием, ресуспендируют в 0,5 мл ТЕ8-буфера (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) и добавляют равный объем насыщенного раствора ацетата натрия. После инкубации в течение 30 мин при минус 20^оС осадок удаляют центрифугированием, а к надосадочной жидкости добавляют 0,6 объема изопропанола и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Осадок собирают центрифугированием, промывают 70%-ным этанолом и ресуспендируют в 100 мкл ТЕ8-буфера.

Плазмидную ДНК (1 мкг pEX2) обрабатывают эндонуклеазой рестрикции Xba1 (10 ед.) в буфере A (50 мМ трис-HCl, рН 7,6, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотрейтол, 100 мМ NaCl, 4 мМ спермидина) в течение 2 ч.

Анализ полноты гидролиза проводят с помощью электрофореза. Используя фрагмент Кленова ДНК-полимеразы E.coli достраивают три из четырех нуклеотидов в липких XbaI-концах. Белки удаляют фенольной экстракцией, ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в 5 мкл ТЕ8.

Для получения фрагмента ДНК с геном лизоцима проводят рестрикцию 10 мкг ДНК плазмиды pLysS рестриктазой BamH1. С помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы E.coli достраивают три из четырех нуклеотидов в липких BamH1-концах. Фрагмент -BamH1-BamH1- с частично достроенными липкими концами размером 0,6 т. п. о. выделяют с помощью электрофореза сорбцией на бумагу ДЕ81. Бумагу промывают, инкубируют 30 мин при 80^оС в буфере 2 М ацетата натрия, 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ ЭДТА. ДНК, перешедшую в раствор, удаляют с бумаги центрифугированием, к раствору добавляют 2 объема этанола. После инкубации при -20^оС в течение 1 ч осадок собирают центрифугированием и растворяют в 5 мкл буфера ТЕ8.

0,5 мкг фрагмента ДНК вектора pEX2 смешивают с 0,2 мкг ДНК, содержащей ген лизоцима бактериофага Т4. Соединение фрагментов проводят с помощью 10 ед. ДНК-лигазы фага Т4 в буфере: 30 мМ трис-HCl, рН 7,2, 10 мМ хлористого магния, 2 мг/мл желатины, 1 мМ спермидина, 0,1% меркаптоэтанола, 0,2 мМ АТФ при 20^оС в течение 2 ч.

Полученной смесью трансформируют клетки E.coli PLT90 содержащие clts857 репрессор. Для этого ночную культуру клеток разводят средой LB с 10 мМ MgSO₄ в соотношении 1:100 и растят с аэрацией до плотности А550 0,3 ОЕ. После 15 мин охлаждения при 0^оС клетки собирают центрифугированием, суспендируют в 1/3 первоначального объема буфером 30 мМ ацетата калия, рН 5,8, 100 мМ RbCl, 50 мМ MnCl₂, 10 мМ CaCl₂, 15% глицерина, и оставляют на 30-60 мин на льду. Клетки собирают центрифугированием, ресуспендируют в 1/12,5 первоначального объема в буфере 10 мМ MOPS, рН 6,8, содержащем 10 мМ RbCl, 75 мМ CaCl₂, 15% глицерина и инкубируют 15 мин на льду. К суспензии клеток добавляют лигированные фрагменты ДНК, инкубируют 40 мин при 0^оС, затем 2 мин при 34^оС, 2-3 мин при 0^оС, разбавляют в 5 раз средой 2YT, растят 30 мин, при 30^оС и высевают на агаризованную среду 2YT с ампициллином (50 мг/мл).

Клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды с геном лизоцима в нужной ориентации, отбирают с помощью анализа на способность к лизису после индукции синтеза белка. Экспрессию рекомбинантных белков индуцируют повышением температуры до 42^оС. В клонах, продуцирующих лизоцим, после индукции белкового синтеза и последующего добавления хлороформа происходит лизис клеток. Из отобранных клонов стандартными способами выделяют плазмиду pEL5b. Векторная ДНК стабильна при хранении в 10 мМ трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА при -20^оС.

П р и м е р 2. Использование вектора pEL5b для получения рекомбинантных белков в виде водонерастворимых аггломератов.

Клетки PLT90, содержащие плазмиду pEL5b, инокулируют в 1 мл среды LB с 100 мкг/мл ампицилина и растят ночь при 30^оС. Ночную культуру разводят в 2 мл этой же среды в соотношении 1:100 и растят с аэрацией до 0,2 ОЕ при 550 нм, затем повышают температуру до 42^оС для индукции синтеза слитного белка и растят еще 2 ч. Затем добавляют хлороформ до 1% и инкубируют при 37^оС еще час. Далее лизат центрифугируют, ресуспендируют осадок в 75 мкл буфера ТЕ8 и добавляют равный объем буфера для электрофореза (160 мМ трис-HCl, рН 6,8, 20% глицерина, 4% додецилсульфата натрия, 4 мМ ЭДТА, 6% меркаптоэтанола, 0,05% бромфенолового синего). Клеточные белки анализируются с помощью электрофореза в полиакриламидном геле по Лэммли. После окончания электрофореза белки в геле фиксируют и окрашивают кумасси ярко-голубым R-250.

Анализ полученных результатов показывает, что в результате действия лизоцима происходит разрушение оболочки бактерии и высвобождение водорастворимых клеточных бактерий в среду, что проявляется в ослаблении минорных белковых полос. В контроле, в случае использования плазмиды pEX2, такого эффекта нет.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет получать водонерастворимые аггломераты рекомбинантных белков без использования дополнительных методов разрушения клеточных стенок.