способ идентификации мумиеподобных веществ

Формула изобретения

СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ МУМИЕПОДОБНЫХ ВЕЩЕСТВ путем определения спектральных характеристик исследуемого образца, отличающийся тем, что дополнительно определяют аминокислотный и жирнокислотный состав, а также проводят спектрофлуоресцентный анализ образца и при содержании в образце, от суммы идентифицируемых соединений, освобождаемых после гидролиза: глицина и глутаминовой кислоты 35 73, миристиновой кислоты 35 50, а также наличии полос спектра флуоресценции, характеризующихся возбуждением в пределах: I - 272 0,2 нм, II 330 370 нм, III 300 310 нм, испусканием в пределах: I 301 0,2 нм, II 450 0,2 нм, III 430 0,2 нм, идентифицируют мумие.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в фармации для определения и стандартизации биологически активных веществ природного происхождения.

В народной медицине мумие используется более трех тысяч лет. Это природный смолоподобный продукт биологического происхождения, вытекающий из расщелин скал и гор. Представляет собой бесформенные куски с неравномерно-ячеистой или гладкой поверхностью, твердой или упругой консистенции с характерным бальзамическим запахом.

Эмпирический опыт применения мумие выявил свойства продукта, позволяющие применять его для биостимулирующего, кроветворного и иммуностимулирующего действия, а также для угнетения роста и развития болезнетворных микроорганизмов.

В нашей стране применение мумие и препаратов на его основе в медицинской практике не разрешено из-за отсутствия четких доказательств и границ терапевтической эффективности, а также отсутствия методов его идентификации и стандартизации.

Поэтому прежде всего необходимо идентифицировать мумие и мумиеподобные вещества от других смолообразных продуктов природного происхождения.

Известен способ идентификации мумиеобразных веществ по цветным реакциям с хлорным железом и диазосоединениями. Раствор мумиеподобных веществ при соединении с хлорным железом образует бурый осадок, а щелочной водно-спиртовой фильтрат их при 50^оС с раствором диазотированной сульфаниловой кислоты дает темно-красное окрашивание (Нуралиев Ю.Н. Денисенко П.П. Мумие и его лечебные свойства. Душанбе: Ирфон, 1977).

Недостатком известного способа является то, что указанные качественные реакции неспецифичны для мумиеподобных веществ, поскольку цветные реакции характерны и для других органических веществ, например, торфа, навоза и пр.

Известен также способ идентификации мумиеподобных веществ путем определения величины кислотности (рН) растворов исследуемых образцов. При этом установлено, что величина кислотности зависит от места происхождения образца (Галимов Э.М. и др. К геохимии мумие. Геохимия, N 10, 1986).

Известен способ идентификации мумиеподобных веществ по характеру поглощения в ИК-спектре. ИК-спектры поглощения мумие обладают стабильными полосами поглощения в средне- и высокочастотных областях колебаний (Шакиров А.Ш. Петров С.И. Фролова Т.Т. Некоторые электрохимические свойства препарата мумие. Вопросы травматологии и ортопедии. т. 15, Ташкент, 1975).

Наиболее близким техническим решением является способ идентификации мумиеподобных веществ, путем использования ИК-спектроскопии, характеризующийся наличием в спектре характеристических частот различных функциональных группировок, таких как амино-, гидроксильных, карбоксильных и т.п. (Петров С. И. и др. Применение ИК-спектроскопии для идентификации препарата мумие. Вопросы травматологии и ортопедии. т. 15, Ташкент, 1975).

Необходимо отметить, что ИК-спектры отличаются большой индивидуальностью: каждое соединение в этой области имеет свой, только ему присущий набор полос поглощения, благодаря этому можно идентифицировать вещества, а также проводить определение смеси близких по строению изомерных соединений. Функциональные группы или фрагменты, повторяющиеся в молекулах различных соединений, характеризуются примерно одними и теми же частотами в колебательных спектрах, по которым может быть установлено их присутствие в молекуле данного вещества, правда не всегда с одинаково высокой степенью достоверности.

Отсутствие полос поглощения в данной области спектра доказывает, что в молекуле исследуемого вещества какой-либо функциональной группы нет. В то же время наличие полос в указанной области не является однозначным доказательством присутствия в молекуле какой-либо функциональной группы, так как в этой области могут случайно оказаться частоты других колебаний молекулы.

Таким образом, недостатком способа идентификации, основанных на спектральных характеристиках исследуемых образцов, является получение качественной характеристики мумиеподобных веществ и отсутствие количественных критериев, позволяющих идентифицировать мумие независимо от места происхождения.

Технический эффект заключается в специфичности идентификации мумиеподобных веществ независимо от места происхождения образца и учета проявления всех характерных свойств.

Для этого в предлагаемом способе помимо определения спектральных характеристик исследуемого образца, получаемых спектрофлуориметрически, проводят определение аминокислотного и жирнокислотного состава и при содержании в образце, в процентах от суммы идентифицируемых соединений, освобождаемых после гидролиза глицина и глутаминовой кислоты в количестве 35-73% миристиновой кислоты 25-50% а также наличии трех полос спектра флуоресценции, характеризующихся возбуждением в пределах I 2720,2 нм, II 330-370 нм, III 300-310 нм, испусканием в пределах I 3010,2 нм, II 4500,2 нм, III 4300,2 нм идентифицируют мумие.

На фиг. 1 изображен спектр излучения образцов мумие; на фиг. 2 схема жирнокислотного состава образцов мумие.

Способ реализуют следующим образом.

Анализируемую пробу исходного образца делят на три части. Одна часть пробы предназначается для определения жирнокислотного состава вещества, который проводят методом ГЖК (газожидкостный хроматографии качественный и количественный анализ). Полученные хроматограммы анализируют, обращая особое внимание на содержание в образце миристиновой кислоты, которая должна составлять 25-50% от суммы идентифицируемых соединений, освобождаемых после гидролиза.

Вторую часть пробы анализируемого образца используют для определения аминокислотного состава вещества методом, заключающимся в полном гидролизе белка до аминокислот с последующим хроматографированием смеси на аминокислотном анализаторе. Полученные хроматограммы анализировали, обращая особое внимание на содержание глицина и глутаминовой кислоты, составляющих 35-73%

Третью часть пробы анализируют спектрофлуориметрически.

Измерение интенсивности флуоресценции проводят на спектрофлуориметре в кварцевых кюветах с оптическим путем 1 см и отмечали наличие трех полос спектра флуоресценции, характеризующихся возбуждением в пределах I 2720,2 нм; II 330 370 нм; III 300 310 нм; испусканием в пределах I 3010,2 нм; II 4500,2 нм; III 4300,2 нм.

Наличие в анализируемом образце указанного содержания миристиновой кислоты, глицина и глутаминовой кислоты и данного спектра флуоресценции в совокупности позволяет сделать вывод, что вещество, подвергаемое анализу мумие.

Методика определения миристиновой кислоты в исследуемом образце.

Полученные метиловые эфиры эфирных кислот анализировали в газовом хроматографе. Анализируемая проба (5 мкл) вводится в поток газа-носителя (гелий) при повышенной температуре дозатором (шприцем) через резиновую термостойкую мембрану. Жидкая проба быстро испаряется и потоком газа переносится в хроматографическую колонку, находящуюся в термостате.

Разделение проводят в режиме программирования температуры от 150-200^оС. Благодаря различной адсорбции и десорбции компонентов липидной фракции, происходит разделение смеси на отдельные зоны на выходе из колонки, что регистрируется детектором в качестве пиков хроматограммы.

Количественную оценку результатов анализа проводят методом внутренней нормализации. Идентификацию жирных кислот осуществляют по временам удерживания стандартных веществ. Расчет содержания каждой из кислот проводят по формуле

c₁ где С₁ концентрация отдельной кислоты (мг/г);

С₂ концентрация внутреннего стандарта (мкм/мл);

Н₁ высота пика отдельной жирной кислоты;

Н₂ высота пика внутреннего стандарта;

М молекулярная масса жирной кислоты;

а навеска исходного препарата;

К коэффициент пересчета для каждой жирной кислоты (определяется как отношение высоты пика отдельной жирной кислоты к высоте пика внутреннего стандарта, вводимых в хроматограф в одинаковых концентрациях).

Рассчитав по вышеуказанной формуле концентрацию каждой жирной кислоты, рассчитывают суммарное содержание жирных кислот, а отсюда процентное содержание каждой жирной кислоты.

На хроматограммах всех образцов мумие видно, что среди пиков жирных кислот доминирует пик жирной кислоты 14:0 миристиновой кислоты. По расчетам ее процентное содержание в образцах мумие находится в пределах 25-50%

Методика определения аминокислотного состава исследуемого образца.

Полученную после гидролиза и высушивания смесь аминокислот растворяли в соляной кислоте, отбирали аликвоту (50 мкл) и наносили на колонку аминокислотного анализатора.

Количественную оценку результатов анализа проводили методом внутренней нормализации площадей пиков.

Результаты расчетов свидетельствуют, что во всех образцах мумие после гидролиза доминируют аминокислоты глицин и глутаминовая кислота. Их процентное содержание от суммы всех аминокислот находится в пределах 35-73%

Спектрофлуориметрический анализ образца.

При анализе на спектрофлуориметре получали график зависимости оптической плотности вещества от длины волны.

Для всех образцов мумие было отмечено наличие трех полос излучения, характеризующихся следующим: возбуждение в пределах I от 272 мм;

II от 330-370 нм;

III от 300-310 нм, испускание в пределах I от 301 нм;

II от 450 нм;

III от 430 нм.

Все вышеизложенное свидетельствует о наличии в мумие триады специфичных характеристик.

Доминирование в водорастворимой липидной фракции мумие миристиновой кислоты. Ее содержание (в от суммы всех жирных кислот) находится в пределах 25-50%

Доминирование в аминокислотном составе гидролизата водной вытяжки мумие глицина и глутаминовой кислоты. Их содержание (в от суммы всех аминокислот) находится в пределах 35-73%

Наличие трех полос в спектре флуоресценции:

I возбуждение 272 нм/испускание 301 нм;

II возбуждение 330-370 нм/испускание 450 нм;

III возбуждение 300-310 нм/испускание 430 нм.

Все эти характеристики в совокупности позволяют идентифицировать мумие в объектах минерального, животного и растительного происхождения.

П р и м е р. 1. Определение жирнокислотного состава образцов мумие. Из представленных на анализ образцов мумие N 5 (50,3 мг) и N 2 (50 мг) готовили 5% -ные водные растворы. Нерастворимый осадок отфильтровывали. Для анализа использовали надосадочную жидкость (супер).

К 0,5 мл надосадочной жидкости добавляли 10 мл внутреннего стандарта (пентадекановая кислота в концентрации 1 мкл/мл), 1,5 мл дистиллированной воды и 6 мл смеси хлороформ-метанол (2:1) и тщательно встряхивали. Полученный раствор центрифугировали и отделяли нижнюю фазу, содержащую экстракт липидов в хлороформе. Хлороформ упаривали на роторном испарителе до сухого остатка.

К сухому остатку добавляли по 0,3 мл 0,5 н. раствора натра едкого в метаноле и нагревали на водяной бане при 60^оС в течение 5 мин до получения однородного раствора. К полученному раствору добавляли по 0,5 мл 14%-ного метанольного раствора трехфтористого бора (BF СНОН) и нагревали при 60^оС еще 2-3 мин.

Полученную после гидролиза и этерификации смесь охлаждали и добавляли 3 мл дистиллированной воды. Метиловые эфиры жирных кислот дважды экстрагировали гексаном. Гексановые вытяжки объединяли, гексан упаривали на ротационном испарителе, а остаток растворяли в 50 мл гексана.

5 мкг полученного раствора вводили в инжектор газового хроматографа. Полученные хроматограммы анализировали.

Содержание миристиновой кислоты в образцах N 5 и 2 составило соответственно 0,30 мг/г и 1,20 мг/г. Суммарное содержание жирных кислот для образцов N 5 и 2 составило соответственно 1,17 мг/г и 2,40 мг/г. Отсюда следует, что процентное содержание миристиновой кислоты в образце N 5 составляет 25,5% а в образце N 2 50%

2. Определение аминокислотного состава. Из анализируемых образцов мумие N 10 (50 мг) и N 2 (50 мг) готовили 5%-ные водные растворы. Полученные водные растворы центрифугировали 15 мин при 4000 об/мин с целью осаждения нерастворимой части вещества. Надосадочную жидкость подвергали гидролизу.

Гидролиз проводили в стеклянных ампулах. 1 мл надосадочной жидкости анализируемого образца помещали в ампулу и добавляли 1 мл 6 н. соляной кислоты. Образец замораживали, помещая ампулы в баню со смесью этанола и твердой углекислоты или в сосуд Дьюара с жидким азотом и откачивали ампулу на вакуум-насосе до давления 20-30 мн. Затем ампулу заплавляли под вакуумом и термостатировали в сушильном шкафу при 1101^оС в течение 24 ч. Ампулу вынимали из термостата, охлаждали до комнатной температуры, вскрывали и содержимое количественно фильтровали через стеклянный фильтр на водоструйном насосе. Стенки ампулы несколько раз промывали водой. Промывные воды объединяли с фильтратом, и раствор упаривали досуха на роторном испарителе в круглодонной колбе при 40-45^оС. Остаток соляной кислоты удаляли, добавляя в колбу 2-3 раза 0,5 мл дистиллированной воды и каждый раз упаривая досуха.

Полученную после гидролиза и высушивания смесь аминокислот растворяли в 1000 мкл дистиллированной воды. 50 мкл полученного раствора смешивали с 450 мкл 0,2 н соляной кислоты. 50 мкл полученного раствора наносили на колонку аминокислотного анализатора. Полученные хроматограммы анализировали.

Суммарное содержание глицина и глутаминовой кислоты составляет 1,69 мкг (для образца N 10) и 0,88 мкг (для образца N 2). Суммарное содержание всех аминокислот в гидролизате составляет 2,33 мкг (для образца N 10) и 1,76 мкг (для образца N 2). Отсюда, процентное содержание глицина и глутаминовой кислоты составляет 72,38% (для образца N 10) и 49,92% (для образца N 2).

3. Изучение спектров флуоресценции.

Из анализируемых образцов N 1 и N 4 готовили водные растворы в концентрации 20 мкг/мл. Измерение интенсивности флуоресценции вели на спектрофлуориметре в кварцевых кюветах с оптическим путем 1 см.

Для образца N 1 полученные спектры характеризуются следующим: I 272 нм возбуждение/около 301 нм испускание; II 350 нм возбуждение/около 450 нм испускание; III минорная полоса возбуждение 300 нм/около 430 испускание.

Для образца N 4 полученные спектры характеризуются следующим: I 272 нм возбуждение/301 нм испускание; II 360 нм возбуждение/452 нм испускание; III 310 нм возбуждение/430 нм испускание.

4. Изучение аминокислотного состава образца Х.

Готовим 10%-ный водный раствор образца Х. Полученный раствор гидролизуем.

Для этого 1 мл 10%-ного водного раствора смешивали с 1 мл концентрированной соляной кислоты, упариваем досуха. Полученный после гидролиза и высушивания сухой остаток растворяем в 5000 мкл дистиллированной воды. 10 мкл раствора смешиваем со 150 мкл дистиллированной воды и 50 мкл полученного раствора наносим на колонку аминокислотного анализатора. Полученные хроматограммы анализируем.

Процентное содержание всех аминокислот в гидролизате составляет 0,4% Суммарное содержание глицина и глутаминовой кислоты в образце составляет 20,7%

Таким образом, данный образец не мумие.

Применение предлагаемого способа идентификации мумиеподобных веществ в практической деятельности повысит точность определения за счет использования различных показателей определяющих различные характеристики вещества.

Способ позволяет оценить качественную и количественную характеристику мумиеподобного вещества, что позволит на практике повысить точность определения в лекарственных препаратах мумиеподобной основы.

Способ дает возможность отличить мумие от других веществ природного происхождения от подделок и искусственно создаваемых аналогов.

Способ создает основу для стандартизации самого продукта и препаратов из него, независимо от места происхождения. При анализе отечественных образцов мумие: образец N 1 Якутия; образцы N 2, 6, 10, 8-2, 9-2, 10-3, 12-15, К, 1_о, 2_о, 3_о, 5_о из различных месторождений Горного Алтая и зарубежных образцов мумие; N 4 Монголия, N И Индия было выявлено следующее.

Содержание миристиновой кислоты составляет 25-50% от суммы всех жирных кислот; содержание в гидролизате глицина и глутаминовой кислоты составляет 35-73% от суммы всех аминокислот; наличие трех характерных полос спектра излучения, характеризующихся возбуждением в пределах I 2720,2 нм; II 330-370 нм; III 300-310 нм; испусканием в пределах I 3010,2 нм; II 4500,2 нм; III 4300,2 нм (фиг. 1 и 2).

Способ позволяет сократить время и упростить идентификацию мумиеподобных веществ.