кристаллический этопозид 4`-фосфат диэтанолсольват и способ его получения

Формула изобретения

1. Кристаллический этопозид 4-фосфат диэтанолсольват формулы I



2. Способ получения кристаллического этопозид 4-фосфат диэтанолсольвата, отличающийся тем, что включает образование насыщенного раствора этопозид 4-фосфата в системе растворителей, содержащей этанол.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанная система растворителей включает воду и этанол.

4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанная система растворителей включает метанол и этанол.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к кристаллическому этопозид 4"-фосфату, сольватированному двумя молекулами этанола.

Этопозид представляет собой противораковое средство, одобренное в настоящее время в Соединенных Штатах для лечения рака мелких клеток легкого и резистентной опухоли яичек. Поскольку этопозид лишь умеренно растворим в воде, для приготовления раствора этопозида требуется органический растворитель или смесь органических растворителей. Препарат этопозида для парентерального применения, продаваемый в настоящее время, содержится в системе из многих растворителей.

Этопозид 4"-фосфат (I) и его двунатриевая соль (II) описываются в патенте США N 4904768 в качестве пролекарственных форм этопозида и являются такими же активными, как этопозид в противоопухолевых испытаниях in vivo.

I: R=H

II: R=Na

В то время как растворимость этопозида в воде составляет около 0,1 мг/мл, как этопозид 4"-фосфат, так и его двунатриевая соль проявляют растворимость в воде, составляющую 100 мг/мл, допуская тем самым приготовление фармацевтических композиций с применением небольшого количества или в отсутствии органических растворителей. Ранее описанные формы этопозид 4"-фосфата и его двунатриевой соли представляют собой рыхлые аморфные вещества, с которыми трудно обращаться и которые имеют тенденцию разлагаться при хранении. Таким образом, цель предлагаемого изобретения заключается в предоставлении формы этопозид 4"-фосфата, которую можно более выгодно использовать для фармацевтических целей, чем предшествующие формы. Изобретение рассматривает новый кристаллический этанольный сольват этопозид 4"-фосфата, с которым легче обращаться и который проявляет неожиданную стабильность по сравнению с известными формами этопозид 4"-фосфата.

Настоящее изобретение представляет стабильный кристаллический этопозид 4"-фосфат, сольватированный двумя молекулами этанола, впоследствии называемый этопозид 4"-фосфат диэтанолсольватом



C другой стороны настоящее изобретение представляет способ получения кристаллического этопозид 4"-фосфат диэтанолсольвата, включающий образование насыщенного раствора этопозид 4"-фосфата в содержащей этанол системе растворителя.

На фиг.1 показана картина дифракции рентгеновского излучения на порошке этопозид 4"-фосфат диэтанолсольвата; на фиг.2 спектр ЯМР на протонах (Д₂О, 200 МГц) этопозид 4"-фосфат диэтанолсольвата.

I. Получение этопозид 4"-фосфат диэтанолсольвата.

Кристаллический этопозид 4"-фосфат диэтанолсольват можно получить, образуя насыщенный раствор этопозид 4"-фосфата в системе растворителя, содержащей этанол, давая кристаллам образоваться и собирая указанные кристаллы Исходное вещество этопозид 4"-фосфат можно получить посредством способа, описанного в патенте США N 4904768, указанный способ включает взаимодействие этопозида с дифенилхлорфосфатом и подвергание получающегося продукта каталитическому гидрированию. Продукт, полученный посредством этого способа, представляет собой аморфное вещество, которое можно превратить в кристаллический этопозид 4"-фосфат диэтанолсольват настоящего изобретения.

Насыщенный этанольный раствор этопозид 4"-фосфата можно получить, смешивая этопозид 4"-фосфат, этанол и соpастворитель; указанный сорастворитель может представлять собой, например, воду или метанол. При необходимости смесь можно нагреть для достижения полного растворения. Кристаллы этопозид 4"-фосфат диэтанолсольвата образуются, когда раствор оставляют стоять при температуре, подходящей для образования кристаллов; температура конкретно не ограничивается и может изменяться от, например, около 0^о до около 65^оС, но предпочтительно кристаллизацию осуществляют при температуре окружающей среды, т.е. около 15^оС до около 25^оС. Кристаллизация желаемого продукта обычно довольно медленная, и раствор, как правило, перемешивают в течение около 18 до около 72 ч до того, как собирают кристаллы. Необязательно раствор может быть затравлен небольшим количеством предварительно образованных кристаллов этопозид 4"-фосфат диэтанолсольвата. Кристаллы собирают стандартным способом, например фильтрованием, и кристаллическое вещество промывают абсолютным этанолом, а затем сушат, получая этопозид 4"-фосфат диэтанолсольват в виде бесцветного кристаллического твердого вещества. Высушивание предпочтительно осуществляют в вакууме при температуре, изменяющейся от 20 до 25^оС.

В одной типичной методике этопозид 4"-фосфт смешивают с абсолютным этанолом, предпочтительно около 1 г этопозид 4"-фосфата в около 15 мл этанола, и смесь нагревают до обратного стекания жидкости. К этой смеси добавляют воду в количестве, достаточном для получения полного растворения; обычно требуется около 0,3 мл до около 0,6 мл воды на 1 г этопозид 4"-фосфата. Раствор при необходимости фильтруют горячим для удаления нерастворенных примесей, и фильтрату дают охладиться до температуры окружающей среды т.е. около 15 до 25^оС при перемешивании. Фильтрат поддерживают при температуре, благоприятной для образования кристаллов, до тех пор, пока не образовалось достаточно кристаллов. Хотя кристаллизация может происходить при около 55-65^оС, предпочтительно раствор поддерживают при температуре окружающей среды. Таким образом, раствор перемешивают в течение около 18 до 72 ч, образованные кристаллы собирают фильтрованием, промывают абсолютным этанолом и сушат, получая желаемый продукт в виде бесцветного кристаллического твердого вещества.

П р и м е р 1. Получение этопозид 4"-фосфат диэтанолсольвата из этопозид 4"-фосфата.

К аморфному этопозид фосфату (18,0 г) добавляют абсолютный этанол (270 мл). Смесь нагревают до обратного стекания жидкости и добавляют деионизированную воду до тех пор, пока не происходит полного pастворения (требуется от 5 до 10 мл). Раствор фильтруют горячим, затем ему дают охладиться до приблизительно 20^оС и перемешивают в течение 18 ч. Продукт собирают фильтрованием, промывают абсолютным этанолом (2х20 мл) и сушат в вакууме при 20^оС в течение 18 ч. Этопозид фосфат диэтанолсольват получают в виде бесцветного кристаллического твердого вещества 15,4 г (выход 91%).

В альтернативной методике кристаллический этопозид 4"-фосфат диэтанолсольват можно получить, добавляя заключительную стадию кристаллизации к способу получения этопозид 4"-фосфата, описанному в патенте США N 4904768. Обычная методика получения кристаллического этопозид 4"-фосфат диэтанолсольвата, исходя из этопозида, описывается ниже. Этопозид 4"-фосфат получают посредством модифицированного варианта способа, описанного в патенте США N 4904768.

П р и м е р 2. Получение этопозид 4"-фосфат диэтанолсольвата, исходя из это- позида.

А. Получение 4"-дибензилфосфат этопозида.

К перемешиваемому раствору дибензилфосфита (446,5 г, 1,70 моль, 2 экв.) в хлористом метилене (3,5 л) при 20^оС добавляют одной порцией N-хлорсукцинимид (227,5 г, 1,70 моль, 2 экв.). Реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч при 30^оС, охлаждают до 0^оС, и выдерживают при 0^оС в течение 12-72 ч, а затем фильтруют. Часть полученного таким образом раствора дибензилхлорфосфата (62,5% 1,25 экв.) в течение промежутка времени 1-1,5 ч добавляют к раствору этопозида (500 г, 0,85 моль), 4-диметиламинопиридина (10,5 г, 0,086 моль, 0,1 экв.) и N,N-диизопропилэтиламина (311,5 мл, 1,79 моль, 2,1 экв.) в сухом ацетонитриле (5 л), перемешиваемому при (-15)-(-20)^оС в атмосфере инертного газа. Реакционную смесь перемешивают в течение 20 мин при -(15)-(-20)оС и добавляют небольшие порции (0,1-0,25 экв.) раствора дибензилхлорфосфата до тех пор, пока жидкостная хроматография высокого разрешения не покажет, что израсходовано по крайней мере 98% этопозида. К этой реакционной смеси затем добавляют 0,5 моль/л КH₂PO₄ (5 л), и смеси дают нагреться до комнатной температуры. Органическую фазу отделяют и дважды промывают 10% NaСl (2 л), сушат над сульфатом натрия, а затем растворитель выпаривают в вакууме. Неочищенные твердые вещества хроматографируют на силикагеле, используя 20% EtOAc/CH₂Cl₂, 40%EtOAc/CH₂Cl₂, затем EtOAc в качестве растворителей для элюирования; фракции, содержащие желаемый продукт смешивают и выпаривают в вакууме до 2 л Раствор медленно при хорошем перемешивании добавляют к гептану (5 л), реакционную смесь перемешивают при 20^оС в течение 1-3 ч, фильтруют и сушат в вакууме при 40^оС в течение 18 ч, получая обозначенное в заглавии соединение (505 г, 70% выход).

В. Получение кристаллического этопозид 4"-фосфат диэтанолсольвата.

Раствор 4"-дибензилфосфат этопозида (500 г, 0,59 моль) в метаноле (2 л) добавляют в суспензии 10% Pd/C (50 г) в метаноле (1 л), и суспензию нагревают до около 37^оС. К этой суспензии медленно добавляют раствор 1-метил-1,4-циклогексадиена (555 г, 660 мл, 5,89 моль, 10 экв.) в метаноле (1 л), и суспензию перемешивают при 40-45^оС до тех пор, пока реакция не завершится, что покажет тонкослойная хроматография. Реакционную смесь фильтруют, и объем фильтрата доводят до около 1 л посредством концентрирования или добавления дополнительного количества метанола, получающийся раствор добавляют затем в абсолютный этанол (4 л). Раствор затравливают эталонным этопозид 4"-фосфатом и концентрируют до около 2,5 л. К суспензии добавляют абсолютный этанол (3,5 л) и перемешивают при около 20^оС в течение 18-72 ч. Твердые вещества собирают фильтрованием, промывают абсолютным этанолом (2х250 мл) и сушат в вакууме в течение 18 ч при около 20^оС, получая 300-350 г продукта (выход 80-90% ).

II. Физико-химические свойства кристаллического этопозид 4"-фосфат диэтанолсольвата

Температура плавления: 141-150^оС (теряет

растворитель);

160-172^оС (плавится).

Этанольный остаток: 11,8% (посpедством

ЯМР); 13,2% (посре-

дством термограви-

метрического анали-

за). Рассчитано для

С₂₉Н₃₃O₁₆P2C₂H₆O

12,1%

Содержание влаги: 0,22% посредством

метода Карла Фише-

ра.

ЯМР: соответствует представленному на фиг.2.

Картину дифракции рентгеновского излучения на порошке в соответствии с представленной на фиг.1 получали на системе дифракции на порошке Philips модели АРД 3720, снабженной вертикальным гониометром в геометрии /2. С генератором рентгеновского излучения (Philips модели XRG-3100) работали при 45 кВ и 40 мА, используя медную линию K при 1,544056 в качестве источника излучения. Каждый образец сканировали между 2 и 32 градусами 2, используя размер шага 0,04 градуса 2 и скорость сканирования 0,04 градуса 2/c. Для сбора и анализа всех данных использовали выполнение Philips АРД с программным обеспечением 4,00.

III. Исследование стабильности.

А. Используемые вещества.

а. Кристаллический этопозид 4"-фосфат диэтанолсольват, полученный в соответствии с вышеописанным.

b. Кристаллический этопозид 4"-фосфат (нерастворенный) получали по следующей методике. Этопозид 4"-фосфат (300 мг) в этаноле (175 мл) нагревали при перемешивании при 70^оС, получая прозрачный раствор. Раствор фильтровали, и фильтрат нагревали при 70^оС до тех пор, пока объем не уменьшался до приблизительно 34 мл. Часть раствора (приблизительно 17 мл) помещали в ампулу и затравливали небольшим количеством пpедварительно полученных кристаллов этопозид 4"-фосфата, имеющих игольчатую форму. Раствор помещали в морозильную камеру при -12^оС на 4 дня, и получающиеся кристаллы игольчатой формы собирали в виде белого рыхлого вещества. ЯМР-анализ этого вещества указывал на содержание этанола, равное приблизительно 1,6 мас.

с. Аморфная двунатриевая соль этопозид 4"-фосфата, полученная в соответствии с описанным в патенте США N 4904768.

d. Аморфный этопозид 4"-фосфат получали, растворяя кристаллический этопозид 4"-фосфат диэтанолсольват (125 мг) в метаноле (50 мл), выпаривая раствор досуха на роторном испарителе и высушивая остаток при 25^оС в вакууме в течение 1 ч.

В. Методика.

Тщательно взвешенные образцы испытуемых веществ помещали в ампулы из стекла флинт типа 1 и закупоривали пробками с тефлоновым покрытием и алюминиевыми колпачками. Ампулы хранили при 50^оС. Эффективность этих образцов определяли посредством жидкостной хроматографии высокого разрешения на 2, 4 и 8 нед. Образцы, хранившиеся высушенными при 4^оС, служили контрольными (100% предполагаемая эффективность).

С. Условия анализа методом жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) (ЖХВД)

Колонка: Jones Apex Октадецил,

5 мкм, 150х4,6 мм

Скорость потока: 1 мл/мин

Подвижная фаза А: 0,02 моль/л фосфата аммония (одноосновного)

в воде MiII-Q (pH 4,5):

Ацетонитрил (85:15)

Подвижная фаза В: Ацетонитрил

Градиент: 0-3 мин изократный

при 0% В;

3-18 мин линейный

градиент 0 до 30% В;

18-23 мин изократный

при 30% В;

23-25 мин линейный

градиент 30 до 0% В;

25-30 мин снова урав-

новешивающийся при

100% А (т.е. 0% В)

Длина волны 235 нм

Концентрация

образца: 0,1 мг/мл

Разбавитель

образца: Подвижная фаза А

Объем пробы: 20 мкл

Время удерживания: Этопозид 4"-фосфат 5,4 мин; лигнан Р

11,5 мин; этопозид

17,5 мин

Площадь пика для этопозида 4"-фосфата линейно коррелировали с концентрацией в области 0,05-0,20 мг/мл (коэффициент корреляции 0,9999).

D. Результаты.

Результаты вышеописанного исследования стабильности представлены в таблице, в которой название "ЕР" символизирует этопозид 4"-фосфат.

Результаты исследования стабильности при 50^оС показывают, что кристаллический этопозид 4"-фосфат диэтанолсольват претерпевает очень незначительную потерю эффективности за промежуток времени, равный 8 нед, и ясно показывают стабильность кристаллического этопозид 4"-фосфат диэтанолсольвата, превышающую стабильность других форм этопозид 4"-фосфата.

Кристаллический этопозид 4"-фосфат диэтанолсольват настоящего изобретения можно использовать непосредственно в фармацевтических препаратах. Например, его можно приготовить, смешивая с инертными наполнителями, например, лактозой, маннитом, декстраном, или каким-либо другим подходящим наполнителем; цитратом натрия для регулирования pH. Твердую смесь можно затем использовать для заполнения ампул и превращать перед применением в растворы для инъекций, разбавляя обычно используемым фармацевтически приемлемым разбавителем, например, раствором глюкозы или обычным физиологическим раствором. Твердую смесь можно также использовать для заполнения желатиновых капсул, пригодных для перорального применения этопозид 4"-фосфата.

Или же кристаллический этопозид 4"-фосфат диэтанолсольват можно использовать для приготовления лиофилизированных препаратов этопозид 4"-фосфата. Так, кристаллический этопозид 4"-фосфат диэтанолсольват растворяют в воде для инъекций, и раствор доводят до pH в области от около 4 до около 5, добавляя в него фармацевтически приемлемое основание, например, гидроксид натрия или цитрат натрия; необязательно, раствор может также содержать другие фармацевтические компоненты, такие как наполнитель, например, лактозу или декстран. Один миллилитр раствора помещают в стеклянные ампулы и лиофилизируют. Лиофилизат можно снова смешать с физиологически приемлемым разбавителем перед применением к пациенту.

Следует отметить, что кристаллический этопозид как в виде фармацевтического препарата, так и в виде нерасфасованной лекарственной формы следует хранить в условиях с низкой относительной влажностью, предпочтительно при относительной влажности менее чем около 33% и наиболее предпочтительно в присутствии обезвоживающего средства или в герметичном контейнере для того, чтобы избежать нежелательного подвергания действию влаги.